泊馬度胺對COPD大鼠氣道炎癥及黏液高分泌的改善作用及其機制

劉淑娟，李亞，范正媛，李高峰，李素云*

1河南中醫藥大學河南省中醫藥防治呼吸病重點實驗室，河南鄭州 450046；2河南中醫藥大學呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南鄭州 450046；3河南中醫藥大學第一附屬醫院中藥藥理(呼吸)實驗室，河南鄭州 450000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是慢性炎癥性呼吸系統疾病，發病率和病死率均較高[1]。COPD 以持續氣流受限為特征，已成為世界三大致死原因之一[2]。中國18 歲以上人群中COPD 的患病率為8.6%，給社會帶來了沉重負擔[3]。吸煙被認為是COPD 的重要危險因素[4]。香煙煙霧可在小氣道內募集炎性細胞，并釋放大量炎 性 因 子，如 腫 瘤 壞 死 因 子(tumor necrosis factor，TNF)‐α 和白細胞介素(interleukin，IL)家族因子等[5‐6]。TNF‐α 增多可促進中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞的募集及炎性細胞因子IL‐1β、IL‐6、IL‐13的釋放，加重肺部炎癥[7‐9]。TNF‐α 還可促進氣道上皮杯狀細胞增生和黏蛋白[如黏蛋白5AC(mucin5AC，MUC5AC)、黏蛋白5B(mucin5B，MUC5B)]的過度釋放，引起氣道黏液分泌增多，加重氣道阻塞[10]。因此，抑制TNF‐α 可能改善COPD 患者的氣道炎癥和黏液高分泌。

泊馬度胺(pomalidomide，POM)是沙利度胺的衍生物，屬于第三代免疫調節劑[11]。POM 可靶向TNF-αmRNA 的3'‐非翻譯區強烈抑制TNF‐α 的產生[12]。目前，POM主要用于治療多發性骨髓瘤，并已被證明具有抗炎作用[13‐15]。有研究顯示，沙利度胺能明顯改善香煙煙霧所致的小鼠肺損傷[16]。此外，POM 可抑制哮喘動物模型的呼吸道收縮和炎癥反應[17]。COPD 與哮喘具有相似的臨床癥狀，如慢性呼吸道炎癥和黏液高分泌[18]。因此，POM 在COPD大鼠中是否具有類似的作用有待進一步研究。本研究觀察POM對COPD大鼠呼吸道炎癥和黏液分泌的影響，并探討相關的機制，旨在為COPD 的相關治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 POM(S1567，美國Selleck 公司)，蘇木精‐伊紅(HE)染色試劑盒(G1120，北京Solarbio 公司)，核質蛋白提取試劑盒(PK10014，美國Proteintech公司)，大鼠血清TNF‐α(E‐EL‐R2856c)、IL‐1β(E‐EL‐R0012c)、IL‐6(E‐EL‐R0015c)、IL‐13(E‐EL‐R0563c)的ELISA檢測試劑盒及兔抗大鼠MUC5AC抗體(E‐AB‐40037)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，兔抗MUC5B 多克隆抗體(YN0881)、鼠抗GAPDH(YM3029)、Lamin B1(YM3036)單克隆抗體均購自美國ImmunoWay Biotechnology 公司，牛血清白蛋白、HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體(G5001、GB23303，武漢賽維爾生物科技有限公司)，鼠抗TNF‐α受體1(tumour necrosis factor recptor 1，TNFR1)多克隆抗體[21574‐1‐AP，美國Proteintech 公司]，兔抗IκB 激 酶(Ikappa B kinase，IKK)、磷 酸 化IKK(p‐IKK)和P65 蛋白抗體(#8943，#2697，#8242)均購自美國Cell Signaling Technology 公司。恒溫箱購自上海新苗醫療設備有限公司，BS210S 型精密電子天平購自德國Sartorius 公司，LDZ5‐2 型高速離心機購自美國賽默飛世爾科技有限公司，Fine Pointe PFT型動物肺功能檢測系統購自美國BUXCO 公司，Spectra Max i3x 型酶標儀來自美國Molecular Devices 公司，BX41型倒置顯微鏡來自日本Olympus 公司，ChemiDocTMMP成像系統購自美國Bio‐Rad公司。

1.2 實驗動物與分組 SD 大鼠36 只(SCXK 北京2019‐0010，北京斯倍福生物技術有限公司)，體重(200±20) g，適應性喂養1 周后，將大鼠隨機分為對照組、模型組和POM組，每組12只，雌雄各半。本研究獲河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審批(YFYDW2021002)，動物實驗遵循動物倫理相關規定。

1.3 細菌及香煙 肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae，菌株號46114)由中國醫學細菌保藏管理中心供應，配制成6×108菌落形成單位(colony forming unit，CFU)/ml后進行鼻腔滴注。紅旗渠牌過濾嘴卷煙購自河南中煙工業有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 COPD 大鼠模型制備 采用香煙煙霧暴露聯合肺炎克雷伯桿菌感染制作COPD 大鼠模型。模型組和POM 組大鼠在自制的暴露箱內進行煙霧暴露，煙 霧 濃 度 須 達 到(1000±10) mg/m3，每 次30 min，2 次/d，中間間隔3 h 以上。同時大鼠雙側鼻腔內滴入肺炎克雷伯桿菌溶液共0.1 ml (6×108CFU/ml)，每5 d 1 次。對照組大鼠采用等量生理鹽水滴鼻。造模過程持續8周。

1.4.2 藥品配制及干預 將POM 溶于DMSO 制成50 mg/ml 的原液，再按體積比加入其他溶劑：2%原液+30% PEG 300+2%Tween 80+66% 純水，最終工作液POM濃度為1 mg/ml。POM組大鼠腹腔注射POM 0.5 mg/kg，1 次/d，持續1 周[19]。對照組和模型組大鼠分別給予等量的除原液外的其他溶劑進行腹腔注射。末次給藥后，用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉處死，獲取大鼠的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、血清和肺組織。

1.4.3 肺功能測定 各組隨機選擇6 只大鼠分別于第0、4、8、9周采用自由全身體積描記儀測定大鼠潮 氣 量(tidal volume，TV)和 每 分 鐘 通 氣 量(minute ventilation，MV)。取材當天大鼠麻醉氣管插管后采用Fine Point 肺功能測試系統測定大鼠的用力呼氣肺活量(forced expiratory vital capacity，FVC)、0.1 s 用力呼 氣 容 積(forced expiratory volume in 0.1 second，FEV0.1)和0.3 s 用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 second，FEV0.3)。

1.4.4 肺組織病理及AB‐PAS染色檢測氣道上皮杯狀細胞的增生情況 各組隨機選擇6 只大鼠左肺組織用10%多聚甲醛溶液固定；脫水、石蠟包埋后獲得切片(4 μm)，并分別采用HE 染色和AB‐PAS 染色；最后，用中性樹脂封片。采用ImageJ 軟件對大鼠肺泡平均線性截距(mean linear intercept，MLI)和平均肺泡數(mean alveolar number，MAN)進行計量分析；采用Image Pro Plus 6.0軟件檢測肺組織氣道上皮中杯狀細胞的比例。

1.4.5 BALF沉渣細胞分類計數檢測中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞的占比 抽取預冷的PBS 對各組隨機選擇的6只大鼠肺部進行沖洗并回收，3 ml/次，共3 次，回收率在75%左右。回收的BALF 在4 ℃，1200 r/min(離心半徑124 mm)離心10 min后取細胞沉渣，3 ml PBS 重懸3 次。離心棄上清，取10 μl 的細胞沉渣，均勻涂布于載玻片上，HE染色后中性樹脂封片。在光學顯微鏡下檢測中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞的比例。

1.4.6 ELISA 法檢測大鼠血清炎性因子TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IL‐13 的水平 大鼠腹主動脈采血，血液靜置分層后在4 ℃、3000 r/min(離心半徑124 mm)離心15 min，取上層部分血清，根據ELISA檢測試劑盒說明書指導，依次加入樣本(各組隨機選擇6 只)、抗體工作液、酶結合工作液、底物及終止液進行孵化，最后在酶標儀指定波長下檢測OD 值，根據得到的標準品OD 值和濃度用四參數法擬合出的曲線計算各指標的含量。

1.4.7 免疫組化法檢測大鼠肺組織MUC5AC、MUC5B 的分泌情況 4 μm 石蠟組織切片脫蠟至水、抗原修復后用5%牛血清白蛋白封閉。分別與抗MUC5AC(1∶400稀釋，E‐AB‐40037)、抗MUC5B抗體(1∶200稀釋)在4 ℃孵育過夜。另與山羊抗兔抗體在37 ℃孵育30 min。DAB 顯色液處理后蘇木精進行復染。最后，利用ImagePro Plus 6.0 軟件進行了定量分析。

1.4.8 Western blotting 檢測TNF‐α/核轉錄因子‐κB(nuclear factor kappa‐B，NF‐κB)信號通路相關蛋白TNFR1、IKK、p‐IKK 和P65 的表達情況 各組隨機選擇3 只大鼠肺組織切碎后加入預冷的RIPA 緩沖液中進行總蛋白提取。用核質蛋白提取試劑盒獲得核蛋白和細胞質蛋白。變性蛋白用10%的SDS‐PAGE分離，轉至PVDF 膜上。用封閉液封閉膜后，加入一抗TNFR1(1:600)、IKK(1:1000)、p‐IKK(1:1000)和P65(1:1000)、GAPDH(1:2000)和Lamin B1(1:2000)抗體4 ℃孵育過夜，隨后與相應的二抗孵育1 h。采用ChemiDocTMMP成像系統觀察蛋白質條帶并用ImageJ軟件分析條帶。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。本研究均為計量資料，以xˉ±s表示，方差齊時組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD‐t檢驗；方差不齊則選用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 POM對COPD大鼠肺功能的影響 與對照組比較，模型組及POM組大鼠第8周的TV和MV均明顯降低(P＜0.01)；模型組大鼠第9 周的FVC(P＜0.01)、FEV0.1(P＜0.05)、FEV0.3(P＜0.01)均明顯降低。與模型組比較，POM 治療1 周后，POM 組大鼠第9 周的TV(P＜0.05)和MV(P＜0.01)明顯增高，FVC、FEV0.1、FEV0.3均明顯改善(P＜0.01，圖1)。

圖1 POM對COPD大鼠肺功能的影響(xˉ±s，n=6)Fig.1 Effect of POM on lung function in COPD rats (xˉ±s, n=6)

2.2 POM對COPD大鼠肺組織病理損傷的影響 對照組大鼠的肺泡大小較為一致，組織和氣管結構完整，周圍有少量炎性細胞浸潤。與對照組比較，模型組大鼠肺泡大小不一、排列紊亂，部分肺泡壁斷裂融合成肺大皰，氣管黏膜皺襞增多、變長，突入管腔內，氣管周圍有著大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，POM組肺組織病理損傷減輕，肺泡壁斷裂減少，氣管黏膜皺襞輕度變長、增多，周圍炎性細胞浸潤明顯減少(圖2A)。與對照組比較，模型組大鼠 肺 泡MLI 明 顯 增 高(P＜0.01)，MAN 明 顯 減 少(P＜0.01)；與模型組比較，POM 組大鼠肺泡MLI 和MAN均明顯改善(P＜0.01，圖2B、C)。

圖2 POM對COPD大鼠肺組織病理的影響(xˉ±s，n=6)Fig.2 Effect of POM on lung histopathology in COPD rats (xˉ±s, n=6)

2.3 POM對COPD大鼠肺炎性細胞和血清炎性因子TNF‐α、IL‐1β、IL‐13 水平的影響 與對照組比較，反復香煙煙霧刺激和細菌感染后，模型組大鼠BALF沉渣內中性粒細胞、巨噬細胞(P＜0.01)和淋巴細胞(P＜0.05)比例升高，血清炎性因子TNF‐α、IL‐1β、IL‐13(P＜0.01)和IL‐6(P＜0.05)水平升高；與模型組比較，POM組大鼠BALF中的中性粒細胞(P＜0.05)和淋巴細胞(P＜0.01)比例降低，巨噬細胞比例增高(P＜0.01)，血清中TNF‐α、IL‐6(P＜0.05)和IL‐1β、IL‐13(P＜0.01)水平均明顯降低(圖3)。

圖3 POM對COPD大鼠肺炎性細胞和血清炎性因子水平的影響(xˉ±s，n=6)Fig.3 Effect of POM on lung inflammatory cell and serum levels of inflammatory factors in COPD rats (xˉ±s, n=6)

2.4 POM對COPD大鼠氣道黏液分泌的影響 與對照組比較，模型組大鼠氣道上皮杯狀細胞比例增高(P＜0.01)，MUC5AC 和MUC5B 分 泌 增 多(P＜0.01)；與模型組比較，POM 組大鼠杯狀細胞比例降低(P＜0.01，圖4A、C)，MUC5AC、MUC5B 分泌減少(P＜0.01，圖4B、D)。

圖4 泊馬度胺對COPD大鼠氣道杯狀細胞和黏蛋白分泌的影響(xˉ±s，n=6)Fig.4 Effects of POM on airway goblet cell and mucin secretion in rats with COPD (xˉ±s, n=6)

2.5 POM 對COPD 大鼠肺組織TNF‐α/NF‐κB 信號通路蛋白水平的影響 Western blotting 檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TNFR1含量、p‐IKK/IKK比值升高(P＜0.01，圖5A)，胞核中P65含量增高(P＜0.01)，胞質中P65含量降低(P＜0.05)；與模型組比較，POM 組大鼠肺組織中TNFR1 含量(P＜0.01)、p‐IKK/IKK 比值(P＜0.05)降低，胞質P65 含量增高(P＜0.05)，胞核P65含量降低(P＜0.05，圖5B)。

圖5 POM對COPD 大鼠肺組織TNF‐α/NF‐κB信號通路蛋白TNFR1、P‐IKK/IKK、P65/GAPDH 和P65/Lamin B1表達的影響(xˉ±s，n=3)Fig.5 Effects of POM on TNFR1, P‐IKK/IKK, P65/GAPDH, and P65/Lamin B1 of TNF‐α/NF‐κB signaling pathway in lung of rats with COPD (xˉ±s, n=3)

3 討 論

COPD 是一種慢性炎癥性呼吸系統疾病。慢性氣道炎癥和黏液高分泌是COPD 的重要表現[20]，其中氣道炎癥是COPD 肺組織病理生理學的核心[21]。香煙煙霧可促進肺組織促炎細胞因子如TNF‐α、IL家族等的釋放，以及中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞聚集，導致肺組織損傷[22]。炎性因子可刺激呼吸道上皮杯狀細胞增生，是呼吸道黏液高分泌的病理基礎，可導致嚴重的呼吸道阻塞和呼吸道反復感染，導致高發病率和高病死率[23‐24]。研究顯示，呼吸道黏液高分泌可使COPD急性加重的風險增加約2倍，死亡風險增加約3.5倍[25]。目前，COPD 的呼吸道炎癥多采用糖皮質激素治療[26]，可在短期內緩解患者的臨床癥狀，但長期使用不良反應較多，且不同個體用藥效果差異較大[27]。因此，尋找新的治療藥物或方法是COPD 臨床治療的迫切需求。TNF‐α介導的信號通路具有調節呼吸道炎癥和黏液分泌的重要作用[28‐30]。本研究采用POM 對COPD 大鼠進行干預，結果顯示，經POM治療后，COPD 大鼠肺功能指標TV、MV、FVC、FEV0.1、FEV0.3均有不同程度提高；同時，POM 還能使MLI 降低，MAN 升高，從而明顯緩解COPD 大鼠肺組織的病理損傷，其機制可能與抑制TNF‐α的作用有關。

中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞是COPD 患者肺部炎性環境中的主要免疫細胞類型[4]。在炎性因子作用下，這些免疫細胞迅速被招募并分泌多種蛋白水解酶和炎性細胞因子，導致肺組織炎癥和損傷[31‐32]。促炎細胞因子TNF‐α、IL‐1β、IL‐6 和IL‐13是COPD 炎癥反應的關鍵指標。TNF‐α 作為促炎細胞因子，主要由活化的巨噬細胞、自然殺傷細胞和淋巴細胞分泌[6]。TNF‐α 是最早參與全身炎癥反應的介質之一，可誘導其他炎性細胞因子的釋放，促進炎性細胞的黏附、遷移和侵襲，擴大炎癥效應，造成肺損傷[33‐34]。研究顯示，COPD患者血清TNF‐α水平升高，且與肺功能呈負相關[7]。IL‐1β 可促進中性粒細胞在氣道周圍聚集，增強炎癥反應，引起支氣管黏膜水腫，腺體分泌增多，加重氣道阻塞[35]。IL‐6 可預測COPD 的加重頻率，誘發和維持呼吸道炎癥[36]。IL‐13 在肺的表達會導致COPD 的表型伴有炎癥、黏液化生及基質金屬蛋白酶和組織蛋白酶依賴的肺氣腫[37]。本研究發現，COPD大鼠BALF沉渣內中性粒細胞和淋巴細胞增多，巨噬細胞減少，與COPD 大鼠肺組織病理變化一致；血清TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IL‐13水平升高；而POM可逆轉這些變化，提示POM可減輕COPD大鼠的呼吸道炎癥。

呼吸道黏液高分泌是COPD的另一重要表現[20]。COPD 患者氣道上皮的杯狀細胞比例增加[38]，而杯狀細胞是呼吸道黏液的主要來源之一。MUC5AC 和MUC5B 是兩種重要的呼吸道黏蛋白[39‐40]。黏蛋白過度分泌可導致呼吸道阻塞、肺功能下降和感染概率增高[41]。本研究發現，POM 可促進COPD 大鼠氣道上皮杯狀細胞增生，減少MUC5AC和MUC5B分泌，提示POM可抑制COPD大鼠氣道黏液的分泌。

NF‐κB 作為一種核轉錄因子，與免疫反應、炎癥反應、細胞增殖、轉化和細胞凋亡等病理生理過程密切相關[42]。正常情況下，NF‐κB 存在于細胞質中，呈非活性狀態；其經典激活途徑是激活TNFR1，可誘導IKK 磷酸化；游離的NF‐κB 被激活并迅速轉移到細胞核，與靶基因的κB序列連接，啟動靶基因的表達，并促進免疫因子和炎性因子的分泌，如TNF‐α、S100蛋白家族、MUC家族、IL家族等[43‐44]。本 研 究 發 現，COPD 大 鼠 肺 組 織 中 的TNFR1、p‐IKK 和 胞 核 的P65 含 量 增 加，激 活 了TNF‐α/NF‐κB通路；經POM干預后，TNF‐α/NF‐κB通路可被抑制。

綜上所述，本研究發現，POM 對COPD 大鼠的氣道炎癥和黏液高分泌均有一定的抑制作用，可能是通過抑制TNF‐α/NF‐κB信號通路實現的，但尚不能排除存在其他作用機制的可能。此外，長期服用POM 的有效劑量和可能的不良反應尚需進一步研究。