基于多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲測(cè)序技術(shù)的高同源SNP鑒定

王決恒，周宇荀，李 凱，肖君華

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)指基因組DNA序列中的單堿基(A,T,C和G)突變引起的DNA片段多態(tài)性[1-2],其位點(diǎn)的變化類(lèi)型包括堿基的插入、缺失、倒置等。通常采用Sanger測(cè)序、SNP shot技術(shù)、PCR-LDR分型技術(shù)、TaqMan探針?lè)ā⒏咄繙y(cè)序法等[3-4]檢測(cè)SNP,其中多重PCR(polymerase chain reaction)捕獲二代測(cè)序[5]因具有高效率、高通量、低成本的特性而被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模SNP分型領(lǐng)域[6-8]。但對(duì)高同源區(qū)段的SNP進(jìn)行分型時(shí),由于同源片段的影響,靶向高通量測(cè)序難以準(zhǔn)確地進(jìn)行SNP分型[4,9]。

高同源區(qū)段SNP是指SNP所在200～400 bp片段(SNP位于片段中間位置)在其基因組上同源性超過(guò)80%、同源序列數(shù)量≥2。作為比較特殊的SNP類(lèi)型[8-9],高同源SNP的準(zhǔn)確分型將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。為避免試驗(yàn)前期浪費(fèi)時(shí)間和原材料,應(yīng)在試驗(yàn)前先采用生信技術(shù)預(yù)評(píng)估SNP所在片段的同源性,并將同源性較高的片段篩選出來(lái)進(jìn)行測(cè)序。因此,需要通過(guò)BLAST(basic local alignment search tool)數(shù)據(jù)庫(kù)將高同源片段與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行全序列比對(duì)[10],標(biāo)記出延長(zhǎng)引物覆蓋范圍(1～4 kb)后的SNP兩端的特異區(qū)域,然后在特異性區(qū)段上設(shè)計(jì)特異性多重長(zhǎng)PCR引物,并借助多重長(zhǎng)PCR技術(shù)靶向捕獲目標(biāo)片段,避免其他同源片段的干擾。最后,進(jìn)行第二次靶向擴(kuò)增子捕獲并建庫(kù)測(cè)序。二次多重?cái)U(kuò)增子捕獲應(yīng)通過(guò)定量PCR技術(shù)調(diào)節(jié)多重?cái)U(kuò)增子表達(dá)量一致,從而保證多重?cái)U(kuò)增子文庫(kù)的均一性。

本研究利用多重長(zhǎng)PCR反應(yīng)[11-12]對(duì)329個(gè)樣本進(jìn)行9個(gè)高同源區(qū)段SNP分型,先通過(guò)6重長(zhǎng)PCR靶向捕獲9個(gè)高同源SNP所在片段,再通過(guò)8重(有2個(gè)SNP處于同一擴(kuò)增子片段)擴(kuò)增子捕獲建庫(kù),最后應(yīng)用HWE法則計(jì)算二代測(cè)序數(shù)SNP的基因頻率。為了進(jìn)一步確認(rèn)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,使用本實(shí)驗(yàn)室PCR-LDR(ligase detection reaction)技術(shù)探索得到的經(jīng)驗(yàn)性閾值進(jìn)行驗(yàn)證,記等位基因比率在15%～85%的位點(diǎn)為雜合子,在此范圍之外的為純合子[13]。若兩次計(jì)算結(jié)果一致,再將其分型結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)基因頻率進(jìn)行比較并計(jì)算HWE對(duì)應(yīng)p值[14-17],判定測(cè)序結(jié)果是否可靠。本研究有望提出一個(gè)準(zhǔn)確、高效的高同源SNP分型方案。

1 材料與方法

1.1 DNA提取

本試驗(yàn)的329個(gè)血樣樣本均來(lái)自江蘇省太湖干部療養(yǎng)院志愿者(所有參與志愿者均已知情);采用磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào)：DP705);DNA提取操作步驟依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并以0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000C型超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)控。

1.2 SNP同源性評(píng)估

在Bio-Linux 8.04平臺(tái)構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)[18](使用人類(lèi)基因組版本為hg19)后,打開(kāi)Terminal輸入代碼blastn-query input_nuclear.fasta-db database_hg19-out output.xlsx-outfmt 6得到評(píng)估結(jié)果。Input_nuclear.fasta表示需要同源性評(píng)估的序列,database_hg19作為比對(duì)的參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù),output.xlsx表示輸出結(jié)果。將評(píng)估結(jié)果中高同源區(qū)段的SNP片段篩選出來(lái),通過(guò)設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段特異性引物捕獲該區(qū)段。

1.3 引物設(shè)計(jì)

9個(gè)SNP位點(diǎn)的rs號(hào)和基因序列信息來(lái)源于美國(guó)NCBI(national center for biotechnology information)。所有特異引物用Oligo7.6軟件設(shè)計(jì),特異引物設(shè)計(jì)遵循規(guī)則包括解鏈溫度(tm)為55～65 ℃,GC含量為40%～60%,與Blast比對(duì)后,多重長(zhǎng)PCR的上、下引物位置應(yīng)設(shè)置在序列唯一性較好的位置,如圖1所示。由圖1可知：在特異區(qū)A設(shè)計(jì)上游引物,特異區(qū)B設(shè)計(jì)下游引物;特異區(qū)的選擇標(biāo)準(zhǔn)為盡可能避開(kāi)紅色、紫色、綠色、藍(lán)色區(qū)域,Alignment Scores數(shù)值越小越好。

圖1 NCBI比對(duì)Graphic Summary結(jié)果中標(biāo)記的特異性較好的位置Fig.1 NCBI compared with Graphic Summary results to mark the position with better specificity

多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)二代測(cè)序方法：一輪多重長(zhǎng)PCR特異性引物無(wú)需通用接頭(見(jiàn)表1);二輪多重PCR特異引物上游和下游分別添加通用接頭序列,上游通用序列5′-ACGACGTGTCG-AGTTCAGGT-3′,下游通用序列5′-CAGTGAGT-CGCCACAGGTCA-3′(見(jiàn)表2)。為標(biāo)記不同樣本,以攜帶不同index序列的接頭引物標(biāo)記不同樣本,329個(gè)樣本分別由不同的接頭引物標(biāo)記。所有設(shè)計(jì)的多重引物均使用Oligo 7.6和Primer 3-py軟件進(jìn)行引物互作分析,將不會(huì)發(fā)生互作的引物設(shè)為同一組構(gòu)成多重PCR。所有引物皆由上海賽索飛生物科技有限公司合成。所有引物和探針皆由上海賽索飛生物科技有限公司合成。

表1 多重長(zhǎng)PCR引物Table 1 Multiplexed long PCR primers

由表1可知,LP為多重長(zhǎng)PCR引物名稱(chēng),擴(kuò)增長(zhǎng)度為1.4～3.4 kb。使用Oligo 7.6及Primer 3-py軟件對(duì)6對(duì)長(zhǎng)PCR引物進(jìn)行引物互作分析,結(jié)果顯示6對(duì)引物不會(huì)發(fā)生互作現(xiàn)象,可以構(gòu)建6重長(zhǎng)PCR反應(yīng)。由表2可知,rs ID為SNP對(duì)應(yīng)的rs號(hào),ACGACGTGTCGAGTTCAGGT作為上游引物的通用序列、CAGTGAGTCGCCACAGGTCA作為下游引物的通用序列。添加通用序列是為了便于第三輪PCR擴(kuò)增子建庫(kù)添加Index、I5/I7。表中rs代表引物名稱(chēng),擴(kuò)增長(zhǎng)度為183～220 bp。8對(duì)擴(kuò)增子引物(rs28399468、rs5031016共用一對(duì)擴(kuò)增子引物)使用Oligo 7.6及Primer 3-py軟件進(jìn)行引物互作分析,結(jié)果顯示8對(duì)引物不會(huì)發(fā)生互作現(xiàn)象,因此可以構(gòu)建8重?cái)U(kuò)增子反應(yīng)。

1.4 擴(kuò)增子測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

目標(biāo)序列的靶向精準(zhǔn)捕獲是檢測(cè)高同源SNP位點(diǎn)的基因頻率的關(guān)鍵,保證多重PCR產(chǎn)物均一性是準(zhǔn)確鑒定SNP的基因頻率的重要標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)熒光定量PCR法(染料法)調(diào)試第二輪PCR引物濃度,保證每對(duì)引物均勻擴(kuò)增。每輪PCR產(chǎn)物均進(jìn)行磁珠純化、稀釋,盡可能消除上一輪PCR反應(yīng)體系中模板、引物的殘留,避免下一輪PCR受影響。3輪多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序技術(shù)原理示意圖如圖2所示。由圖2可知：特異引物包括特異序列(白色)和通用序列(黑色)兩個(gè)部分;接頭引物包括接頭序列、特異index序列和通用序列等3部分。

圖2 多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序技術(shù)原理Fig.2 Principle of multi-long PCR targeted capture amplicon library construction and sequencing technology

多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序步驟：第一輪多重長(zhǎng)PCR,添加低濃度多重長(zhǎng)PCR特異引物,靶向捕獲含有高同源區(qū)段SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列;第二輪多重PCR,取部分第一輪多重PCR產(chǎn)物作為模板添加到第二輪PCR體系中,并且采用熒光定量PCR法調(diào)整多重PCR引物濃度以保證多重PCR擴(kuò)增的均一性;第三輪PCR,直接將第三輪PCR體系添加到第二輪多重PCR產(chǎn)物中,利用接頭引物將所有PCR產(chǎn)物添加上測(cè)序接頭。經(jīng)過(guò)三輪PCR后,成功構(gòu)建二代測(cè)序擴(kuò)增子文庫(kù)。

1.5 多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序技術(shù)

1.5.1 第一輪PCR

PCR反應(yīng)體系(10 μL)包括3.0 μL雙蒸水,5 μL PCR Mix(2×Phanta?Flash Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號(hào)P520-01),1 μL混合特異引物(每條特異引物濃度為0.5 μmol/L)和1 μL DNA模板(質(zhì)量濃度為20 ng/μL)。第一輪長(zhǎng)PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性120 s,98 ℃變性10 s,68 ℃退火10 s,72 ℃延伸90 s,2個(gè)循環(huán);98 ℃變性10 s,66 ℃退火10 s,72 ℃延伸90 s,2個(gè)循環(huán);98 ℃變性10 s,64 ℃退火10 s,72 ℃延伸90 s,2個(gè)循環(huán);98 ℃變性10 s,62 ℃退火10 s,72 ℃延伸90 s,2個(gè)循環(huán);98 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸90 s,20個(gè)循環(huán)。待PCR反應(yīng)程序運(yùn)行結(jié)束后,取下PCR反應(yīng)體系進(jìn)行磁珠純化。第一輪長(zhǎng)PCR產(chǎn)物磁珠純化條件：取40 μL(2個(gè)相同的孔混在一起,樣本與磁珠比例為1∶1.8)樣本添加72 μL磁珠,混勻,靜置2 min;置于磁力架30 min,棄上清;加180 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乙醇,靜置30 s,棄上清,揮發(fā)5 min;20 μL TE洗脫、吹打,脫離磁力架靜置2 min;再次置于磁力架上吸上清15 μL ,收集在潔凈的EP管中。對(duì)獲得的第一輪長(zhǎng)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),設(shè)置條件：各取5 μL收集的樣本,5 k長(zhǎng)marker 取2 μL,分別添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠的膠孔中進(jìn)行電泳。

1.5.2 第二輪PCR均一性調(diào)整

將磁珠純化后的多重長(zhǎng)PCR產(chǎn)物作為模板,進(jìn)行第二輪PCR。由于第一輪PCR的靶向捕獲目標(biāo)區(qū)段,第二輪PCR的靶向捕獲目標(biāo)區(qū)段得以避免同源基因的干擾。因此,第二輪PCR產(chǎn)物可用于構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù),但需要通過(guò)定量PCR方法精確地調(diào)整多重PCR引物濃度,確保多重?cái)U(kuò)增子表達(dá)量一致。定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括10 μL的2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix (近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司,貨號(hào)：E096-01A),0.2 μL的ROX Reference Dye II ,1 μL F-Primer,1 μL R-Primer,2 μL DNA,5.8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性60 s,95 ℃ 變性20 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán)。

1.5.3 第二輪PCR

PCR反應(yīng)終體系(20 μL)包括4 μL雙蒸水,2 μL第一輪PCR磁珠純化產(chǎn)物作為模板,2.0 μL PCR master mix(近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司,貨號(hào)：E086-YSAA),2 μL Multiplex-Primer(每條特異引物0.5 μmol/L),10 μL Paraffin oil(貨號(hào)：B500301-0500)。第二輪PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃ 變性15 s,60 ℃退火4 min,5個(gè)循環(huán);98 ℃ 變性15 s,65 ℃退火15 s ,72 ℃延伸30 s,18個(gè)循環(huán)。待PCR反應(yīng)程序運(yùn)行結(jié)束后從PCR儀器中取出第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化,磁珠純化條件：取10 μL樣本加10 μL磁珠(樣本與磁珠比例為1∶1)混勻,靜置2 min;置于磁力架30 min,棄上清;添加180 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乙醇,靜置30 s,棄上清,揮發(fā)5 min;添加20 μL TE溶液進(jìn)行洗脫,吹打后脫離磁力架靜置2 min;再次置于磁力架上并吸上清15 μL,保存于潔凈的EP管中。

1.5.4 第三輪PCR

PCR反應(yīng)體系(10 μL)包括6 μL雙蒸水,2 μL第二輪PCR磁珠純化產(chǎn)物(作為模板),4.0 μL AmpliMix(近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司,貨號(hào)：N231-N234A),4 μL Adapter(5 μmol/L),4 μL I5/I7,10 μL Paraffin oil(貨號(hào)：B500301-0500)。第三輪PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃變性15 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,18個(gè)循環(huán);待PCR反應(yīng)程序結(jié)束后從PCR儀器上取出第三輪PCR產(chǎn)物,將329個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物等量混合后振蕩混勻。將混勻后的第三輪PCR產(chǎn)物利用TIANSeq Size Selection DNA Beads試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào)：NG306)進(jìn)行片段分選,再次純化后獲得的PCR純化產(chǎn)物可直接用于后續(xù)測(cè)序反應(yīng),純化條件同第1.5.3節(jié)。

1.6 illumina 平臺(tái)測(cè)序純化后的建庫(kù)產(chǎn)物

由于PCR建庫(kù)孔板數(shù)量限制,將329個(gè)樣本分成4組(樣本數(shù)分別為96、96、96、41)混合PCR產(chǎn)物,純化后上機(jī)測(cè)序(由北京諾禾致源科技股份有限公司完成)。

1.7 二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

二代測(cè)序數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)通常包含index序列、接頭序列和特異序列3個(gè)部分。基于樣本index序列的差異,利用FASTX-Toolkit軟件比對(duì)index序列,根據(jù)index序列差異對(duì)原始數(shù)據(jù)中每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)分;匹配到每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)利用Fastp軟件(v 0.20.1)將接頭序列去掉。運(yùn)用序列比對(duì)軟件BWA(v0.7.17)將去接頭后的序列與SNP對(duì)應(yīng)的參考序列進(jìn)行比對(duì),統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)等位基因的reads數(shù)目,計(jì)算其等位基因比率。將二代測(cè)序數(shù)據(jù)分型結(jié)果以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中SNP基因頻率為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源性評(píng)估結(jié)果

針對(duì)9個(gè)SNP位點(diǎn)的序列評(píng)估其200 bp和400 bp片段在基因組中的同源性情況,結(jié)果顯示在SNP對(duì)應(yīng)的400 bp和200 bp的片段中,rs1801272、rs28399454、rs28399468、rs4986893、rs5031016對(duì)應(yīng)的高同源片段均為4;rs2279343、rs28399499、rs3745274、rs4244285對(duì)應(yīng)的高同源片段均為2。SNP位置處于400 bp片段的中間位置的本地Blast評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表3,SNP位置處于200 bp片段的中間位置的本地Blast評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 SNP對(duì)應(yīng)的400 bp序列同源性評(píng)估Table 3 Homology evaluation of 400 bp sequences corresponding to SNP

表4 SNP對(duì)應(yīng)的200 bp序列同源性評(píng)估Table 4 Homology evaluation of 200 bp sequences corresponding to SNP

由表3、表4可知,表中同源性為4的5個(gè)SNP位點(diǎn)為rs1801272、rs2839945、rs28399468、rs4986893、rs5031016,同源性為2的4個(gè)SNP位點(diǎn)為rs2279343、rs28399499、rs3745274、rs4244285。9個(gè)SNP對(duì)應(yīng)的400 與200 bp的同源片段個(gè)數(shù)均≥2。在試驗(yàn)中將其劃分為高同源區(qū)段SNP位點(diǎn),直接使用新方案對(duì)高同源區(qū)段SNP分型,無(wú)需嘗試普通多重?cái)U(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序。避免在普通擴(kuò)增子靶向測(cè)序的SNP分型中出現(xiàn)高同源區(qū)段SNP無(wú)法被檢測(cè)或檢測(cè)結(jié)果混亂的情況,從而為試驗(yàn)推進(jìn)節(jié)約了大量的時(shí)間和試驗(yàn)材料。

2.2 測(cè)序結(jié)果

2.2.1 二代測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

結(jié)合329個(gè)樣本,對(duì)9個(gè)高同源SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型,二代數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果顯示Q20>90%、Q30>85%,均符合illumina官方的二代測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增子測(cè)序深度分布圖如圖3所示。

圖3 Gatk3軟件分析所得4組數(shù)據(jù)中的9個(gè)SNP位點(diǎn)測(cè)序深度Fig.3 Sequencing depth of 9 SNP loci in 4 groups of data analyzed by Gatk3 software

由圖3可知,所有的SNP位點(diǎn)平均測(cè)序深度均大于1000,9個(gè)SNP的測(cè)序深度存在一定的偏差,但均能滿足SNP位點(diǎn)的精確檢出要求。

采用多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲二代測(cè)序建庫(kù)技術(shù)對(duì)高同源區(qū)段SNP分型時(shí),利用Bio-Linux 8.04搭建的生信平臺(tái)分析二代測(cè)序數(shù)據(jù)。由圖4可知,檢出的SNP測(cè)序深度總體在1 400和8 100之間波動(dòng),其中rs28399454、rs28399468、rs4244285、rs4986893、rs5031016測(cè)序深度偏高,rs1801272、rs2279343、rs28399499、rs3745274測(cè)序深度偏低。對(duì)比SNP同源性與對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的測(cè)序深度發(fā)現(xiàn),SNP對(duì)應(yīng)的片段同源性大小與測(cè)序深度的相關(guān)性不顯著。

圖4 4組數(shù)據(jù)中9個(gè)SNP位點(diǎn)的平均測(cè)序深度與同源性Fig.4 Average sequencing depth and homology of 9 SNP loci in 4 sets of data

2.2.2 二代測(cè)序擴(kuò)增子等位基因比率

對(duì)329個(gè)樣本的9個(gè)高同源區(qū)段的SNP進(jìn)行檢測(cè),二代測(cè)序數(shù)據(jù)顯示共獲得2 928個(gè)SNP位點(diǎn)信息,分型結(jié)果如圖5所示。

圖5 329個(gè)樣本的9個(gè)高同源SNP的等位基因分布情況Fig.5 Allele distribution of 9 highly homologous SNP in 329 samples

由圖5可知,多重長(zhǎng) PCR 捕獲二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè) 329 例人血液基因組高同源 SNP的9 個(gè)高同源 SNP 位點(diǎn)rs1801272、rs2279343、rs28399454、rs28399468、rs28399499、rs3745274、rs4244285、rs4986893、rs5031016的基因頻率分別為A1.0、A/G0.74/0.26、C1.0、C1.0、T1.0、G/T0.826/0.174、G/A0.721/0.279、G/A0.953/0.047、A/G 0.988/0.012。二代測(cè)序數(shù)據(jù)顯示共獲得2 928個(gè)SNP位點(diǎn)信息,測(cè)序成功率為 98.885 6%。通過(guò)HWE法則計(jì)算所得SNP基因頻率結(jié)果與PCR-LDR設(shè)置經(jīng)驗(yàn)性閾值計(jì)算出的基因頻率結(jié)果一致,表明SNP基因頻率計(jì)算無(wú)誤。

2.3 二代測(cè)序擴(kuò)增子等位基因比率與NCBI中千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)基因頻率比對(duì)

多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序?qū)Ω咄磪^(qū)段SNP分型中的位點(diǎn)等位基因頻率的分析結(jié)果與千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)基因頻率比對(duì)結(jié)果如表5所示。

表5 二代測(cè)序329個(gè)樣本的高同源SNP分型結(jié)果與千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)基因頻率對(duì)比

由表5可知,千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中rs1801272、rs2279343、rs28399454、rs28399468、rs28399499、rs3745274、rs4244285、rs4986893、rs5031016基因頻率依次為A/T1.0、A/G0.665/0.335、C/T1.0、C/A0.978/0.022、T/C1.0、G/T0.747/0.253、G/A0.708/0.292、G/A0.919/0.081、A/G 0.847/0.153。多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子測(cè)序所得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)基因頻率誤差值均在 0.15 以內(nèi),二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果可靠。通過(guò)該方案能夠完成高同源區(qū)段SNP的準(zhǔn)確、快速分型。

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究通過(guò)在線Blast篩選高同源SNP片段,利用設(shè)計(jì)的長(zhǎng)PCR引物對(duì)含9個(gè)SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列進(jìn)行高校靶向捕獲。經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增和測(cè)序,成功檢測(cè)2 928個(gè)SNP,測(cè)序成功率高達(dá)98.89%。基因型頻率分析中,將等位基因雜合子為15%～85%,分型結(jié)果與千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致,誤差不超過(guò)0.15。同時(shí),研究結(jié)果還表明同源性高低不是影響SNP位點(diǎn)測(cè)序深度的因素。

因此,本研究結(jié)合本地Blast評(píng)估同源性,采用Oligo7.6和Primer3-py軟件進(jìn)行引物互作分析,有效提高多重PCR的成功率。建立了一個(gè)專(zhuān)注于高同源區(qū)段SNP分型的多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序方案。該方案提出生信前處理、多重引物互作和多重長(zhǎng)PCR靶向捕獲測(cè)序的新流程,成功解決了靶向高通量測(cè)序SNP分型中的脫靶問(wèn)題,大幅節(jié)約了試驗(yàn)時(shí)間和材料成本,為二代測(cè)序SNP分型做了重要的補(bǔ)充。