地榆皂苷Ⅱ抑制結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡的體外實驗研究

鐘新強, 陳 康, 杜 恒, 肖海鵬, 陸艷軍, 吳安定

(湖北省黃岡市中心醫院, 1. 胃腸外科, 2. 藥劑科, 湖北 黃岡, 438000)

結腸癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一,近年來全球發病率、病死率顯著提升[1-2]。中國結腸癌的發病率和病死率僅次于肺癌和胃癌[3]。結腸癌多發于男性,發病高峰年齡段為40～50歲[4]。早期結腸癌可通過內鏡微創治愈,然而早期無典型的臨床癥狀,缺乏有效的診斷策略[5]。多數結腸癌患者確診時已為中晚期,已發展為轉移性結腸癌,臨床治療以手術為主,多數患者臨床預后較差。中藥的多種活性成分可對抗腫瘤增殖,開發安全高效的抗腫瘤中藥已成為目前研究的熱點[6]。地榆皂苷Ⅱ是從地榆中分離出來的具有抗氧化應激、抗潰瘍、促進細胞凋亡和抗腫瘤作用的三萜皂苷類化合物,可有效改善放化療造成的外周血細胞減少癥狀[7]。細胞中蛋白激酶B (AKT)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信號通路是機體內細胞生存的重要信號通路之一,與腫瘤細胞增殖及細胞凋亡密切相關[8]。本研究探討地榆皂苷Ⅱ對結腸癌細胞株HT-29增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用,并探討其作用機制是否與調控AKT/PI3K信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株: 人結腸癌細胞株HT-29購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。將HT-29細胞株復蘇,用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中進行培養,每2～3 d換1次培養液,用胰蛋白酶消化傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

1.1.2 實驗藥物: 地榆皂苷Ⅱ(純度>98.0%)購自上海純優技術有限公司。地榆皂苷Ⅱ用二甲基亞砜(DMSO)配成100 mmol/L母液,分裝后于-20 ℃保存。實驗前用培養液配成所需濃度(DMSO終濃度< 0.1%)。

1.1.3 主要試劑: DMSO購自美國Sigma公司; DMEM培養液和胎牛血清購自美國Gibco 公司; CCK-8試劑盒和異硫氰酸熒光黃(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒,購自武漢亞科因生物科技有限公司; Transwell小室購自美國Corning公司; 0.25%胰蛋白酶液、RIPA細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司; TRIzol試劑、RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司; β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記的IgG抗體(二抗)、SDS-PAGE凝膠配制試劑和SDS蛋白上樣緩沖液,購自碧云天技術(上海)有限公司; 逆轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司; AKT抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)抗體、PI3K抗體、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗體購自英國Abcam 公司; Caspase-9抗體、Cleaved-Caspase-9抗體、Caspase-3抗體和Cleaved-Caspase-3抗體購自美國CST公司; PVDF膜和ECL化學發光底物,購自美國Millipore 公司。AKT、PI3K、Caspase-3、Caspase-9和GAPDH引物均由廣州銳博生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.1.4 主要儀器: MS204TS/02型電子分析天平,購自瑞士Mettler Toledo公司; 3111型CO2恒溫培養箱、Legend Micro17R型低溫高速離心機和NanoDrop 8000型超微量分光光度計,購自美國Thermo Fisher Scientific公司; IX73-DP80型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司; NovoCyte D3000型流式細胞儀購自美國Agilent Technologies公司; Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀購自瑞士Roche公司; Milli-Q IQ7003型超純水系統購自德國Merck公司; Trans-Blot Turbo型Western-blot 電泳儀、轉膜儀和ChemiDoc MP化學發光凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞增殖實驗: 將HT-29細胞懸液接種于96孔培養板,加入地榆皂苷Ⅱ(終濃度為0、1、5、10、20、40、60和80 μmol/L)培養24 h或48 h, 每孔加入CCK-8溶液10 μL繼續培養1 h, 用分光光度計檢測每孔在450 nm波長處的光密度(OD)值,計算各濃度榆皂苷Ⅱ對HT-29細胞增殖的抑制率(IR)。IR=(OD空白組-OD藥物組)/OD空白組×100%。

1.2.2 細胞遷移實驗: 將HT-29細胞懸液接種于6孔板內,培養至細胞完全貼壁后用200 μL槍頭劃垂直劃痕,于顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,更換為含地榆皂苷Ⅱ(終濃度為0、5、10和20 μmol/L)的新鮮培養基培養48 h, 顯微鏡下觀察劃痕彌合情況并拍照,計算相對遷移率。相對遷移率=(初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.2.3 細胞侵襲實驗: Matrigel膠經無血清培養基稀釋后預涂覆于Transwell上室,待膠完全凝固后, Transwell下室加入含地榆皂苷Ⅱ(終濃度為0、5、10和20 μmol/L)的完全培養基600 μL。將對數生長期的HT-29細胞懸液分別按照1×105個/mL在Transwell上室中加入100 μL細胞懸液。上室和下室用聚碳酸酯膜隔開,放入恒溫培養箱內(37 ℃和5%CO2)培養48 h。取出上室并棄掉培養液,沖洗后用棉簽擦去細胞與Matrigel膠,固定細胞,結晶紫染液染色,在倒置顯微鏡下選取5個視野計數穿過小室的細胞數并計算每個視野的平均細胞數,計算各組相對侵襲率。相對侵襲率=(試驗組侵襲細胞數量/空白組侵襲細胞數量)×100%。

1.2.4 細胞凋亡實驗: 將HT-29細胞接種于6孔板內,加入地榆皂苷Ⅱ(終濃度為0、5、10和20 μmol/L)處理48 h, 采用0.25%胰酶消化并收集細胞,以PBS沖洗3遍,將細胞懸浮在結合緩沖液500 μL內,然后加入Annexin V-FITC和PI進行染色,室溫下避光培養15 min, 加入Binding Buffer工作液。用流式細胞儀在488 nm下進行檢測,利用Novo Express軟件進行分析。

1.2.5 定量聚合酶鏈反應(qPCR)實驗: 將HT-29細胞懸液接種于6孔板內,加入地榆皂苷Ⅱ(終濃度為0、5、10和20 μmol/L)培養48 h, 采用0.25%胰酶消化并收集各組細胞,用PBS清洗細胞后采用TRIzol試劑提取RNA。采用超微量分光光度計測定260 nm和280 nm處的OD值(OD260 nm/OD280 nm: 1.8～2.0)。參照逆轉錄試劑盒說明書,將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件為: 37 ℃, 15 min; 85 ℃, 5 s; 4 ℃ 10 min。取cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL和滅菌水8.5 μL組成的反應體系按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書進行qRT-PCR。PCR條件: 95 ℃變性15 s, 60 ℃ 退火60 s, 72 ℃ 60 s, 共40個循環, 72 ℃延展5 min。以GAPDH作為內參,采用2-△△Ct法計算AKT、PI3K、Caspase-3和Caspase-9mRNA的相對表達量。

1.2.6 Western blot實驗: 將HT-29細胞懸液接種于6孔板內,加入地榆皂苷Ⅱ(終濃度為0、5、10和20 μmol/L)培養48 h, 0.25%胰酶消化并收集細胞,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min, 離心,收集上清液。BCA法進行蛋白定量, -20 ℃保存。將蛋白樣品煮沸變性,取50 μg于SDS-PAGE凝膠電泳,然后轉移至PVDF膜,于室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h, TBST溶液洗膜(10 min/次×3次),分別加入AKT抗體、p-AKT抗體、PI3K抗體、p-PI3K抗體、Caspase-9抗體、Cleaved-Caspase-9抗體、Caspase-3抗體和Cleaved-Caspase-3抗體于4 ℃培養過夜,TBST洗膜3次,加入二抗室溫反應1 h。TBST洗膜3次,用ECL plus試劑發色液顯色,采用Chemi-Doc Imaging System進行檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 地榆皂苷Ⅱ對結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用

地榆皂苷Ⅱ(0、1、5、10、20、40、60和80 μmol/mL)與結腸癌HT-29細胞培養24 h或48 h均對HT-29細胞增殖產生顯著抑制作用(P<0.05), 且具有劑量依賴性,見表2。

表2 地榆皂苷Ⅱ抑制結腸癌HT-29細胞增殖作用的測定結果 %

2.2 地榆皂苷Ⅱ對結腸癌HT-29細胞遷移能力的影響

地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)具有顯著抑制結腸癌HT-29細胞遷移的能力(P<0.05), 且具有劑量依賴性,見表3。

表3 地榆皂苷Ⅱ抑制結腸癌HT-29細胞遷移作用的測定結果

2.3 地榆皂苷Ⅱ對結腸癌HT-29細胞侵襲能力的影響

地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可劑量依賴性顯著抑制HT-29細胞的侵襲能力(P<0.05), 見表4。

表4 地榆皂苷Ⅱ抑制結腸癌HT-29細胞侵襲作用的測定結果

2.4 地榆皂苷Ⅱ對結腸癌HT-29細胞凋亡的影響

地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可顯著促進HT-29細胞凋亡(P<0.05), 并呈劑量依賴性,見表5。

表5 地榆皂苷Ⅱ促進結腸癌HT-29細胞凋亡作用的測定結果

2.5 地榆皂苷Ⅱ對結腸癌HT-29細胞中AKT/PI3K信號通路相關mRNA表達的影響

地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可劑量依賴性降低HT-29細胞中AKT和PI3KmRNA的表達,增加Caspase-3和Caspase-9mRNA的表達,差異有統計學意義(P<0.05), 見表6。

表6 結腸癌HT-29細胞中AKT/PI3K信號通路相關mRNA表達水平的測定結果

2.6 地榆皂苷Ⅱ對結腸癌HT-29細胞中AKT/PI3K信號通路蛋白表達的影響

地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可劑量依賴性降低HT-29細胞中p-AKT和p-PI3K蛋白的表達,并增加Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白的表達,差異有統計學意義(P<0.05), 見表7。

表7 地榆皂苷Ⅱ調節結腸癌HT-29細胞中AKT/PI3K信號通路蛋白表達水平的測定結果

3 討 論

結腸癌是臨床最常見惡性腫瘤之一,且近年來發病率和病死率呈逐年上升的趨勢。由于結腸癌早期癥狀不明顯,并且缺乏早期診斷手段,侵襲性高且易轉移,臨床確診時多數患者已經發展為中晚期,治療效果較差。目前,結腸癌的治療方法主要為手術切除、化學治療和物理治療等。雖然手術治療為結腸癌的首選方案,但是中晚期患者多數不適宜接受手術治療,常以放化療或藥物控制腫瘤的發展[9]。

傳統中藥中發現很多有效成分,可以抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲,誘導腫瘤細胞凋亡并且選擇性地針對惡性增殖基因的有效靶點,成為腫瘤治療的新策略。地榆為薔薇科植物地榆或長葉地榆的干燥根,其中以地榆皂苷I和地榆皂苷Ⅱ為代表的三萜皂苷類是地榆中重要的生物活性成分之一。地榆皂苷是從地榆中分離提取出來的一類具有明顯藥理活性的三萜皂苷類化合物,主要包括地榆皂苷I和地榆皂苷Ⅱ。地榆皂苷Ⅱ除了具有升高紅細胞、收縮血管、抗真菌等藥理作用外[10], 還對多種腫瘤細胞具有抑制作用。吳澤承等[11]研究顯示,地榆皂苷Ⅱ對人舌鱗癌細胞CAL27的增殖能力具有抑制作用。王振龍等[12]研究顯示,地榆皂苷Ⅱ對于乳腺癌細胞具有抑制作用,其可通過激活線粒體凋亡途徑誘導乳腺癌細胞凋亡。此外,地榆皂苷Ⅱ通過抑制AKT/PI3K信號通路活性有效抑制鼻咽癌細胞的增殖[13], 通過抑制AKT/PI3K信號通路激活線粒體凋亡途徑促進神經母細胞瘤SK-N-SH細胞凋亡[14]。目前對于地榆皂苷Ⅱ是否對結腸癌細胞TH-29增殖、遷移和侵襲具有抑制作用及其作用機制國內鮮有報道。

腫瘤細胞的無限增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤主要生物學特性,復發、轉移是結腸癌相關死亡的主要原因,而復發轉移與結腸癌細胞上述生物學特性密切相關。已有研究[15]顯示,地榆皂苷可劑量依賴性抑制結腸癌細胞HCT-116和SW-480細胞的增殖。本實驗結果顯示,地榆皂苷Ⅱ可劑量依賴性抑制結腸癌細胞HT-29的增殖、遷移和侵襲能力。細胞凋亡是機體常見的正常生理過程,正常情況下可通過清除受損或多余的細胞保證機體的正常生長發育。腫瘤的產生由細胞增殖和死亡失衡導致,其中細胞凋亡受到抑制是非常重要的原因。本實驗結果顯示,地榆皂苷Ⅱ可劑量依賴性促進結腸癌細胞HT-29的凋亡。

AKT/PI3K信號通路是機體內細胞生存的重要信號通路之一,該信號通路的激活可促進腫瘤細胞增殖及抑制細胞凋亡,與結腸癌發生及發展密切相關。Caspases是在細胞凋亡中發揮關鍵作用的酶家族[16]。Caspase-9是凋亡級聯效應上游的主要啟動因子, Caspase-3被認為是Caspase家族成員中最重要的凋亡執行者,而Caspase-3 活化又主要依靠凋亡啟動因子Caspase-9 的激活[17]。抑制AKT/PI3K信號通路的過度激活可促進Caspase-9活化從而上調Caspase-3的活性,最終誘導細胞凋亡[18]。本研究結果顯示,地榆皂苷Ⅱ可劑量依賴性降低結腸癌細胞HT-29中AKT和PI3KmRNA的表達,增高Caspase-3和Caspase-9mRNA的表達,并且可劑量依賴性地降低結腸癌細胞HT-29中p-AKT和p-PI3K蛋白的表達,增加Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白的表達,說明地榆皂苷Ⅱ發揮作用可能與促進AKT和PI3K蛋白磷酸化、Caspase-3和Caspase-9蛋白活化而調節AKT/PI3K信號通路有關。

綜上所述,地榆皂苷Ⅱ可抑制結腸癌細胞HT-29的增殖、遷移、侵襲,促進細胞凋亡,可能與通過促進AKT和PI3K蛋白磷酸化、Caspase-3和Caspase-9蛋白活化而調節AKT/PI3K信號通路有關。