外周血受體相互作用蛋白激酶3、混合系列蛋白激酶樣結構域水平與新生兒壞死性小腸結腸炎病情嚴重程度的關系

黃 艷, 梁玉美, 馮燕妮, 楊松媚

(右江民族醫學院附屬醫院 新生兒科, 廣西 百色, 533000)

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)是新生兒時期常見的腸管壞死性疾病,表現為腹脹、嘔吐及便血等癥狀,嚴重時還可發生腸穿孔、敗血癥及多器官功能衰竭,甚至導致死亡[1]。目前臨床尚無有效的生物標志物可用于NEC診斷及病情嚴重程度判斷,因此尋找新的生物標志物對NEC的臨床診治具有重要意義[2]。受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)具有高度保守的絲/蘇氨酸激酶結構域,能夠與具有RIP蛋白同源相互作用結構域的蛋白結合,參與細胞壞死性凋亡、炎癥及腫瘤等生物學過程的調控[3]。研究[4-5]發現, RIPK3表達上調會加重腸道病變組織炎癥反應,促進胃腸道炎癥性疾病進展。混合系列蛋白激酶樣結構域(MLKL)屬于蛋白激酶超家族成員,編碼蛋白包含蛋白激酶樣結構域,能夠與RIPK3相互作用,促進腫瘤壞死因子(TNF)誘導的細胞壞死,與兒童炎癥性腸病關系密切[6-7]。本研究分析NEC患兒外周血RIPK3、MLKL表達情況及其與病情嚴重程度的關系,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2022年1月右江民族醫學院附屬醫院診治的92例NEC患兒納入NEC組。納入標準: ① 根據修正Bell-NEC分級標準[8]確診NEC者; ② 首次診治NEC者; ③ 臨床資料完整者; ④ 家屬對本研究知情并簽署知情同意書者。排除標準: ① 伴有腸閉鎖、腸重復及腸旋轉不良等消化道畸形者; ② 伴有苯丙酮尿癥等遺傳代謝疾病者; ③ 伴有呼吸系統或神經系統等先天性發育異常者。NEC組男55例,女37例; 平均日齡(13.15±2.84) d, 平均胎齡(30.09±3.69)周; 平均出生體質量(1.79±0.41) kg; 有早產史者13例。選取醫院同期診治的60例腹股溝斜疝患兒納入對照組,男32例,女28例; 平均日齡(14.41±2.76) d, 平均胎齡(31.03±3.71)周; 平均出生體質量(1.82±0.42) kg; 有早產史者6例。2組患兒性別、日齡、胎齡、出生體質量、早產史情況比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 NEC嚴重程度評估及分組

根據WALSH M C等[8]1986年制定的修正Bell-NEC分級標準, NEC可分為Ⅰ級(可疑期,全身表現為體溫不穩、心動過緩及嗜睡等,胃腸道表現為輕度腹脹、嘔吐、胃潴留及糞便隱血,影像學表現為輕度腸梗阻)、Ⅱ級(腸梗阻期,全身表現為輕度代謝性酸中毒及血小板減少,胃腸道表現為腹脹、嘔吐、血便及腸鳴音消失等腸梗阻癥狀,影像學表現為腸道擴張、腸梗阻及門脈或腸壁積氣)、Ⅲ級(進展期,全身表現為頻繁呼吸暫停、低血壓等,胃腸道表現為全腹部腹膜炎體征,影像學表現為氣腹、腸穿孔及腹水等)。根據分級結果,將NEC組患兒進一步分為輕度NEC組(Ⅰ級)60例和重度NEC組(Ⅱ～Ⅲ級)32例。

1.3 資料收集方法

收集患兒年齡、性別、日齡、胎齡、出生體質量、早產史、窒息史、宮內窘迫史、產前感染史等臨床資料。記錄NEC組和對照組24 h內的實驗室檢查結果,包括白細胞(WBC)計數、C反應蛋白(CRP)。根據凝血功能5項指標結果和血氣分析結果,判斷患兒是否合并凝血功能障礙和代謝性酸中毒。根據患兒入院后呼吸、心率、體溫、血壓及體格檢查結果和立位腹平片、血細菌培養、血生化指標結果等,評估患兒是否合并氣腹征、呼吸窘迫綜合征(RDS)、敗血癥和多器官功能障礙綜合征(MODS)。

1.4 外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA檢測

留取NEC組和對照組患兒入院后24 h內靜脈血約2 mL, 肝素抗凝,加入外周血單個核細胞Ficoll分離液1 mL, 1 500轉/min離心10 min, 吸取中間的單個核細胞的白膜層,同法洗滌細胞2次。采用Trizol法提取總RNA, 使用微量分光光度計(Narodrop2000, 美國賽默飛)檢測總RNA濃度和純度,反轉錄為cDNA后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測。引物由華大公司設計合成,引物序列: RIPK3正向序列5′-ATGTCGTGCGTCAAGTTATGG-3′, 反向序列5′-CGTAGCCCCACTTCCTATGTTG-3′; MLKL正向序列5′-AGGAGGCTAATGGGGAGATAGA-3′, 反向序列5′-TGGCTTGCTGTTAGAAACCTG-3′, GAPDH正向序列5′-CATAGGAAGTGGGGCTACGAT-3′, 反向序列5′-AATTCGTTATCCAGACTTGCCAT-3′。反應條件: 95 ℃預變性5 min, 95 ℃ 變性30 s, 60 ℃退火30 s, 70 ℃延伸34 s, 變性、退火、延伸共40個循環。總體系10 μL: SYBR Green 5 μL, 正向引物、反向引物各0.5 μL, cDNA 1 μL, 雙蒸水3 μL。RIPK3mRNA、MLKLmRNA相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5 組織RIPK3、MLKL蛋白檢測

留取3例接受一期回腸造瘺術治療的NEC患兒的部分NEC回腸組織及二期關瘺時部分正常回腸組織,采用免疫印跡法檢測組織中RIPK3、MLKL蛋白表達。將組織于液氮中研磨后,加入1 mL RIPA裂解液冰上裂解10 min, 蛋白定量后,加入5×Loading buffer后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳(恒壓120 V, 30 min)后,濕法轉膜(恒流250 mA, 90 min), 轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。加5%BSA室溫封閉2 h, 加入RIPK3、MLKL一抗(Abcam公司,貨號ab196436、ab209384), 一抗稀釋比均為1∶1 000, 4 ℃孵育過夜,加入二抗孵育2 h, 采用化學發光法顯色曝光。應用Image J軟件檢測各條帶灰度值,目的蛋白相對灰度值=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 NEC組和對照組外周血和RIPK3、MLKL表達比較

NEC組外周血RIPK3mRNA、MLKLmRNA相對表達量分別為(2.41±0.52)、(3.03±0.64), 高于對照組的(1.02±0.21)、(0.93±0.20), 差異有統計學意義(t=19.668、24.620,P<0.001)。NEC回腸組織中RIPK3、MLKL蛋白相對灰度值分別為(1.20±0.21)、(1.13±0.24), 高于正常回腸組織的(0.34±0.12)、(0.32±0.11), 差異有統計學意義(t=6.159、5.314,P=0.004、0.006), 見圖1。

2.2 相關性分析

Pearson相關分析結果顯示, NEC組患兒外周血RIPK3mRNA與MLKLmRNA相對表達量呈正相關(r=0.623,P<0.001)。

2.3 NEC病情嚴重程度的單因素分析

重度NEC組合并氣腹征、MODS、敗血癥者占比和RIPK3mRNA、MLKLmRNA相對表達量高于輕度NEC組,差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 NEC病情嚴重程度的單因素分析結果

2.4 重度NEC發生的多因素Logistic回歸分析

以是否發生重度NEC為因變量(是=1, 否=0), 以RIPK3mRNA、MLKLmRNA為自變量,以氣腹征、MODS、敗血癥為協變量,進行多因素Logistic回歸分析。分析結果顯示,RIPK3mRNA、MLKLmRNA升高是重度NEC發生的獨立危險因素(P<0.001), 見表2。

表2 重度NEC發生的多因素Logistic回歸分析結果

2.5 RIPK3 mRNA、MLKL mRNA對重度NEC的預測價值

ROC曲線分析結果顯示,外周血RIPK3mRNA、MLKLmRNA聯合預測重度NEC的曲線下面積大于RIPK3mRNA、MLKLmRNA單獨預測,差異有統計學意義(Z=4.127、4.261,P<0.05), 見圖2、表3。

表3 RIPK3 mRNA、MLKL mRNA單獨及聯合應用對重度NEC的預測效能

3 討 論

NEC主要表現為腹脹、嘔吐、精神萎靡等臨床癥狀,由于實驗室檢查指標及影像學檢查缺乏特異性, NEC早期診斷困難,若延誤診治,病情可快速進展,引發腸穿孔、腹膜炎及敗血癥等,危及患兒生命[9]。目前, NEC的主要臨床治療方法為禁食、胃腸減壓、抗生素治療和手術治療。重度NEC患兒若未及時手術,可能發生長段腸道壞死、術后短腸綜合征及營養不良等嚴重并發癥[10]。深入研究NEC的病因和發病機制,尋找新的NEC生物標志物,準確評估病情嚴重程度,對把握NEC患兒的最佳手術時機具有重要的臨床意義。

RIPK3是程序性細胞死亡通路的重要因子,作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,其能夠磷酸化MLKL的蘇氨酸357位點和絲氨酸358位點,參與促壞死復合物的形成,導致細胞程序性壞死的發生[3]。近期研究[11]發現, RIPK3能促進腸道上皮細胞凋亡,與炎癥性腸病、腸道惡性腫瘤等疾病關系密切。本研究中, NEC患兒外周血RIPK3mRNA表達升高,且NEC回腸組織中RIPK3蛋白表達升高,提示RIPK3參與NEC的發生。研究[12]發現, NEC患兒腸黏膜上皮屏障功能喪失,腸道微生物、脂多糖等有害刺激能夠促進腸黏膜上皮細胞中TNFAIP3相互作用蛋白3的表達,其能夠與去泛素化酶A20相互作用,促進RIPK3蛋白K63位點去泛素化,增強RIPK3蛋白穩定性,引起RIPK3表達升高。本研究發現,RIPK3mRNA表達與NEC病情嚴重程度有關,且RIPK3mRNA升高是重度NEC發生的獨立危險因素,提示RIPK3可促進NEC病情進展。研究[13]表明, RIPK3能夠直接激活炎癥小體,進而活化天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶1,誘發腸道上皮細胞的程序性壞死,而腸上皮屏障破壞可導致腸道共生細菌移位入血,引發嚴重膿毒敗血癥。此外, RIPK3還能夠促進TNF-α、白細胞介素(IL)-1β等促炎細胞因子釋放,引起干細胞生態位功能失調及先天免疫感知受損,使腸道潘氏細胞、杯狀細胞數量減少和功能受損,腸道微生物菌群失調和免疫系統過度激活,加重NEC病情[14]。由此提示, RIPK3參與NEC的發生與發展過程,或可作為新的NEC生物標志物。

MLKL編碼基因位于16q23.1, 編碼蛋白是一種激酶樣蛋白,包含N基端4個螺旋束結構域和C端的激酶樣結構域,磷酸化激活的MLKL能夠結合細胞膜表面的磷脂酰肌醇,改變細胞膜通透性,使細胞膜完整性喪失,啟動壞死性凋亡[15]。研究[16]表明, MLKL能夠促進細胞膜穿孔復合體形成,導致腸黏膜上皮細胞的壞死性凋亡,在腸道缺血再灌注損傷、炎性腸病中發揮著重要的調節作用。本研究中,NEC患兒外周血MLKLmRNA、NEC回腸組織中MLKL蛋白表達均升高,提示MLKL可能參與NEC的發生。NEC中MLKL表達上調的機制與TNF-α的表達調控有關。研究[17]表明, NEC壞死腸壁組織分泌大量TNF-α, 其能夠促進腸黏膜上皮細胞中RIPK3的活化和聚合,上調并磷酸化激活MLKL。本研究中,NEC患兒外周血MLKLmRNA表達與病情嚴重程度有關,且MLKLmRNA升高是重度NEC發生的獨立危險因素,提示MLKL升高可加重NEC病情。分析其機制,MLKL能夠通過寡聚化促進鈣離子或鈉離子內流,引起細胞毒性,還能夠增加線粒體活性氧的產生,誘導腸黏膜上皮細胞的壞死性凋亡,加重腸黏膜上皮細胞損傷[18]。此外, MLKL能夠促進壞死的腸黏膜上皮細胞釋放IL-1β、IL-8等促炎細胞因子,并作為損傷相關分子模式激活先天性和適應性免疫細胞,促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1、NOD樣受體家族含pyrin結構域3炎癥復合物的活化,加重腸壁組織壞死,導致NEC疾病進展[19-20]。

本研究中, NEC患兒外周血RIPK3mRNA與MLKLmRNA呈顯著正相關,提示兩者在NEC中發揮協同作用。RIPK3、MLKL作為壞死性凋亡通路的關鍵效應因子,在NEC疾病進展中發揮重要的協同效應。RIPK3的磷酸化激活能介導MLKL蛋白構象的改變,促進MLKL的磷酸化激活,應用RIPK3抑制劑GSK840則能夠抑制MLKL的磷酸化激活,而阻斷RIPK3/MLKL可能有助于逆轉NEC的病情進展[21]。本研究ROC曲線分析結果顯示,外周血RIPK3mRNA、MLKLmRNA聯合應用對重度NEC具有較高的預測價值,提示兩者聯合檢測在重度NEC診斷中的優勢大于單項檢測。本研究還發現,外周血RIPK3mRNA、MLKLmRNA聯合預測重度NEC的特異度低于單獨預測,分析原因,不同NEC患兒的病因、疾病發生發展機制存在差異,且2個指標在NEC疾病進展中的效應不同,從而降低了聯合檢測的特異度。臨床醫生可根據外周血RIPK3mRNA、MLKLmRNA水平對NEC患兒病情嚴重程度進行評估,同時參考臨床表現及其他實驗室檢查結果,從而早期診斷重度NEC患兒并予以積極治療,避免嚴重并發癥的發生。

綜上所述,RIPK3mRNA、MLKLmRNA在NEC患兒外周血中表達升高,且表達水平與患兒病情嚴重程度有關,參與NEC的發生與發展。外周血RIPK3mRNA、MLKLmRNA升高是重度NEC發生的獨立危險因素, 2項聯合檢測對重度NEC的發生具有較高的預測價值。但本研究仍存在不足之處,例如納入樣本量有限,病例選擇可能存在偏倚,有待今后擴大樣本量開展更深入的研究對結論加以驗證。