用于檢測食品中生物胺熒光探針研究進(jìn)展*

張弓，林華

（福建師范大學(xué)，福建 福州 350117）

食品安全是全球消費(fèi)者和衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，包括美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration,FDA）、歐洲食品安全局（European Food Safety Authority,EFSA）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）的主要關(guān)注點(diǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，有200多種疾病通過食物傳播給人類，大多數(shù)人在不知不覺中感染了食源性疾病。肉、魚、蝦、奶、蛋等食物含有豐富的蛋白質(zhì)，但是在儲存和運(yùn)輸過程中，這些食物容易變質(zhì)，蛋白質(zhì)發(fā)生微生物脫羧，產(chǎn)生生物胺，因此，可將生物胺的水平用于評估食品新鮮度和微生物污染水平。過量食用外源性生物胺可導(dǎo)致食物中毒，引起頭痛、惡心、腹瀉、心悸、血壓變化、呼吸窘迫等過敏反應(yīng)，可能危及生命[1]。因此，必須嚴(yán)格檢查食品的新鮮度。

為減少因食用生物胺而導(dǎo)致的食物中毒的發(fā)生，需要開發(fā)可靠且靈敏的方法來測量這些食源性污染物的水平。傳統(tǒng)的生物胺檢測方法主要采用電化學(xué)法、比色法和色譜法（如離子色譜法和液相色譜法），電化學(xué)方法操作快速且簡單，但通常對分析物的選擇性較差。比色法依靠指示劑顏色的變化來區(qū)分分析物，但食品本身的顏色通常會干擾比色分析[2]，雖然色譜法是一種高度準(zhǔn)確的分析物檢測方法，但樣品預(yù)處理繁瑣且耗時，儀器和日常試劑消耗昂貴[3]。

與前面提到的分析方法相比，熒光探針具有很高的靈敏度，對其分析物具有出色的選擇性，便于攜帶，并提供快速的光學(xué)響應(yīng)。為了測定這些食源性污染物，在過去的幾十年里，在調(diào)整探頭的光學(xué)特性方面取得了重大進(jìn)展。因此，本文總結(jié)了為測量各種食品樣品中的生物胺而開發(fā)的各種熒光探針的識別位點(diǎn)、工作機(jī)制、性能和應(yīng)用，討論了設(shè)計用于選擇性檢測生物胺的熒光探針的方向、挑戰(zhàn)和前景。

1 用于生物胺的熒光探針

1.1 基于開環(huán)反應(yīng)的熒光探針

Jia 等[4]用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）和原卟啉Ⅸ(ProtoporphyrinⅨ,PpIX）修飾了纖維素的活性羥基，制備了一系列發(fā)光材料（圖1）。PpIX作為內(nèi)部參比，產(chǎn)生以670 nm為中心的熒光發(fā)射帶，在生物胺存在下，異硫氰酸熒光素的羥基去質(zhì)子化以誘導(dǎo)分子內(nèi)開環(huán)反應(yīng)，從而產(chǎn)生在525 nm處發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的異硫氰酸熒光素。因此，隨著生物胺濃度的增加，材料發(fā)出的熒光顏色逐漸由紅色變?yōu)榫G色，異硫氰酸熒光素結(jié)合材料可以準(zhǔn)確檢測5.0～25000 mg/kg范圍內(nèi)的生物胺。此外，通過利用纖維素基材料優(yōu)異的生物相容性和可加工性，將比例熒光探針摻入纖維素中，以測量蝦和蟹中生物胺的濃度，因此，熒光纖維素材料顯示出作為智能標(biāo)簽監(jiān)測海鮮新鮮度的能力。

圖1 基于開環(huán)反應(yīng)的熒光探針圖

1.2 基于逆邁克爾加成加成的熒光探針

Wang 等[5]合成了一種基于氮雜氟硼二吡咯結(jié)構(gòu)的探針3（圖2），用于檢測生物胺，其中生物胺與親電硼反應(yīng)，導(dǎo)致硼-氮鍵解離并隨后水解探針3，從而破壞氮雜氟硼二吡咯的共軛結(jié)構(gòu)，從而淬滅探針的熒光（圖2）。加入生物胺后，探針3的吸收光譜出現(xiàn)快速（響應(yīng)時間＜1 min）和大藍(lán)移（130 nm），熒光猝滅高達(dá)99%，因此，探針3可以用作監(jiān)測魚類腐敗的高靈敏度熒光探針。在隨后的一份報告中，該小組還發(fā)表了用于檢測食品中生物胺的探針4的開發(fā)，該探針也使用硼-氮鍵作為識別位點(diǎn)[6]。探針4在生物胺存在下發(fā)生氮雜-邁克爾加成和硼-氮鍵解離，然后水解產(chǎn)生二酮吡咯和雜芳香族乙腈副產(chǎn)物（圖2）。添加生物胺后，探針4熒光的顏色從綠色變?yōu)辄S色。將探針4加載到濾紙上可以對生物胺蒸氣進(jìn)行比色檢測，并可以目視監(jiān)測蝦的新鮮度。使用相同的策略，開發(fā)了另一種氮雜硼二吡咯基乙烯熒光探針5[7]，用于生物胺的比色和熒光檢測，以監(jiān)測蝦的新鮮度。

圖2 基于逆邁克爾加成的熒光探針圖

1.3 基于親核取代的熒光探針

Zhu 等[8]基于7-二乙氨基香豆素的合成探針6，用于檢測生物學(xué)相關(guān)的伯二胺（即尸胺和腐胺），伯二胺直接與探針6形成共價修飾的加合物，在475 nm處產(chǎn)生藍(lán)色發(fā)射帶（圖3）。探針6能夠?qū)ι锵嚓P(guān)的伯二胺進(jìn)行比色和熒光檢測，具有出色的選擇性和 209 nmol/L的LOD。此外，將探針6加載到試紙上成功地實(shí)現(xiàn)了在24 h內(nèi)對魚類中的尸體堿和腐胺的目視監(jiān)測。

圖3 基于親核取代的熒光探針在生物胺的作用下發(fā)生的化學(xué)過程

Meng 等[9]開發(fā)了一種用于檢測氨蒸氣的熒光開啟探針7（圖3）。氨水解使探針7能夠識別氨蒸氣，其中氨在O-苯并惡唑鍵處發(fā)生親核芳香取代反應(yīng)，釋放香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，導(dǎo)致445 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度增加，熒光顏色從無色變?yōu)樗{(lán)色（圖3）。探頭7對生物胺表現(xiàn)出高靈敏度和低檢出限（3.82 mg/kg）。此外，7項(xiàng)在監(jiān)測魚類新鮮度和熒光防偽油墨方面取得了優(yōu)異的成績。

Jiang 等[10]構(gòu)建了基于氰基丙烯酰吩噻嗪的比率熒光探針8，用于生物胺。生物胺型的伯胺在氰基丙烯酰基團(tuán)的芐基碳上與2個分子8發(fā)生雙反克腦文蓋爾縮合反應(yīng)（Knoevenagel縮合反應(yīng)），形成雙-席夫堿化合物（圖3）。當(dāng)加入尸體素時，8的熒光從紅色到綠色發(fā)生了藍(lán)移，探針對尸體堿表現(xiàn)出高選擇性、快速響應(yīng)時間（＜15 s）、高靈敏度（46 nmol/L）和低檢測線（8.65 mg/kg）。此外，包含8個智能標(biāo)簽的智能標(biāo)簽與智能手機(jī)配對，用于數(shù)字檢測魚類的尸體水平。Zeng和合著者使用類似的策略開發(fā)了探針9（圖3）[11]。

1.4 以酯鍵為識別位點(diǎn)的熒光探針

Jeon 等[12]合成了一種BODIPY衍生物12，其中酯鍵用作生物胺的識別位點(diǎn)。在甲胺存在下，伯胺與12酯發(fā)生酰基取代反應(yīng)，釋放出探針作為相應(yīng)的BODIPY羧酸鹽（圖4），結(jié)果發(fā)射峰（546 nm）和熒光強(qiáng)度增加了3000倍，熒光的顏色在5 min內(nèi)從黃色變?yōu)榧t色。該探頭已成功用于目視監(jiān)測魚類的新鮮度。

圖4 探針12—探針15的結(jié)構(gòu)式

Zhang 等[13]制備了一種7,7'-(乙酰氧基)-3,3'-(對亞苯基)雙(香豆素)熒光探針13，用于檢測生物胺蒸氣。乙氧羰基作為供體基團(tuán)并抑制分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，使探針具有強(qiáng)烈的熒光，與氨反應(yīng)后，除去乙?；?，將探針轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的供電子苯酚（圖4）。因此，隨著氨濃度的增加，445 nm處的發(fā)射帶逐漸增加，LOD達(dá)到6.85 mg/kg。此外，熒光探針13還成功用于監(jiān)測魚類新鮮度和熒光防偽油墨。

Bao 等[14]以苯并噻唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，以酯鍵為識別位點(diǎn)，合成了一種基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）的熒光探針14。苯并噻唑的乙?；种屏薊SIPT，淬滅了探針的熒光，然而，當(dāng)暴露于氣態(tài)胺時，胺與乙?；磻?yīng)，將其轉(zhuǎn)化為游離羥基，從而啟用ESIPT并產(chǎn)生熒光（圖4）。熒光探針14作為響應(yīng)生物胺的開啟探針，在514 nm處產(chǎn)生發(fā)射帶和較大的Stokes位移（180 nm），并且對生物胺高度敏感，LOD為12.7 mg/kg。此外，將探針摻入瓊脂凝膠中，成功用于檢測魚的新鮮度。

Gao 等[15]合成了探針15，該探針基于2-(2-羥基苯基)喹唑啉-4(3H)-酮支架，其中酯組作為生物胺的識別位點(diǎn)。探針15中的苯氧基和乙酰基抑制了分子內(nèi)氫鍵，從而阻斷了激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移并淬滅了本征熒光。當(dāng)暴露于生物胺蒸氣時，探針與胺發(fā)生氨解反應(yīng)，裂解氧-乙酰基鍵并釋放2-(2-羥基-苯基)-4-(3H)-喹唑啉酮，從而使分子內(nèi)氫鍵恢復(fù)熒光（圖4）。結(jié)果，分子內(nèi)氫鍵恢復(fù)，并觀察到強(qiáng)熒光。暴露于氨時，探針15發(fā)出亮綠色熒光。氨的LOD為8.4 mg/kg，在監(jiān)測魚類新鮮度方面取得了優(yōu)異的結(jié)果。

2 結(jié)語

食品安全因其對公眾健康和安全的影響而受到全世界的高度關(guān)注，不斷優(yōu)化和創(chuàng)新食品監(jiān)控工具是其核心保障。用于檢測生物胺的大多是有機(jī)小分子熒光探針，其結(jié)構(gòu)多樣，在溶液中表現(xiàn)出優(yōu)異的傳感性能，但是，這些小分子大多只能在溶液中起作用，缺乏便攜性和實(shí)用性。因此，開發(fā)可靠、快速、準(zhǔn)確和便攜式的分析方法來檢測食品中的污染物存在和量化水平變得尤為重要，為了使小分子探針能夠監(jiān)測氣態(tài)的生物胺，可以通過靜電紡絲技術(shù)將探針加載到納米纖維素薄膜中。納米級或微米級的表面結(jié)構(gòu)有利于生物胺的吸收和超靈敏檢測。綜上所述，未來可以考慮以下方向：⑴應(yīng)根據(jù)不同的熒光顏色變化，開發(fā)同時檢測食品中生物胺污染物的存在和濃度的探針；⑵ 將熒光探針物理或化學(xué)加載到智能材料上以制備便攜式智能標(biāo)簽。