優質強筋春小麥種質篩選及高分子量谷蛋白序列分析

劉穎 劉泮旭 潘萍萍 張家寧 劉丹 袁卉馥

摘? ? 要：小麥是重要的口糧作物，加工品質的遺傳改良是小麥育種的重要目標之一。為了豐富小麥加工品質育種的基因資源，本研究在收集的種質資源中篩選出農藝性狀優良的SG-1、SG-2和SG-3，并對其進行加工品質分析和籽粒儲藏蛋白組成分析，并評估它們在育種上的利用價值和方式，使用SDS-PAGE、A-PAGE、高分子量谷蛋白亞基編碼基因測序、SDS沉降值分析等技術，對這些小麥品種的籽粒儲藏蛋白亞基組成進行分析。研究發現，SG-1攜帶非優質的高分子量谷蛋白亞基Dx2+Dy12，而SG-2和SG-3攜帶優質的高分子量谷蛋白亞基Dx5+Dy10。在醇溶蛋白方面，3份資源都檢測到了γ-1型醇溶蛋白，但只有SG-3檢測到了γ-2型醇溶蛋白。加工品質分析顯示，SG-1的加工品質優于天津推廣的優質強筋春小麥品種津強6號。高分子量谷蛋白亞基序列分析發現，SG-1和SG-3在By8亞基存在序列變異，表明盡管它們在SDS-PAGE水平上亞基類型一致，但在DNA序列上仍然存在變異。本研究結果初步解釋了攜帶優質亞基的小麥品種在加工品質上表現不佳的原因可能是DNA序列存在差異。同時，研究人員還發現攜帶非優質亞基但具有優良加工品質的SG-1，說明SG-1可能存在其他能夠提升小麥加工品質的機制。本研究拓寬了小麥加工品質育種的基因資源，并為加工品質形成機制的解析提供了新的資源和理論依據。

關鍵詞：小麥；籽粒儲藏蛋白；高分子量谷蛋白；醇溶蛋白；加工品質

中圖分類號：S326? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.01.002

The Identification of Spring Wheat Germplasm for End-use Quality and Sequence Analysis of High Molecular Weight Glutenin Subunits

LIU Ying1， LIU Panxu2，PAN Pingping3，ZHANG Jianing4，LIU Dan2，3，YUAN Huifu1

（1.Hebei North University，Zhangjiakou， Hebei 075000 China; 2.Tianjin Zhongtiandadi Technology Company Limited，Tianjin 300384，China; 3.Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding，Tianjin Crop Research Institute，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300384，China;? 4. Hebei Normal University of Science & Technology， Qinhuangdao， Hebei 066000， China）

Abstract： Enhancing the end-use quality of wheat is a major goal in wheat breeding since wheat is an essential food crop. This study examined three accessions， SG-1， SG-2， and SG-3， which showed excellent agronomic traits among the collected germplasm resources， in order to improve the genetic resources for wheat end-use quality. The study investigated their the protein content of seeds stored for storage， end-use quality， ways of utilization and breeding values， end-used quality， and SDS-PAGE， A-PAGE， gene sequencing of genes encoding high molecular weight glutenin subunits， and SDS sedimentation value analysis were used to examine the composition of seed storage protein subunits in different wheat varieties. The results revealed that SG-1 carried the high molecular weight glutenin subunit Dx2+Dy12， whereas SG-2 and SG-3 carried the high molecular weight glutenin subunit Dx5+Dy10. In terms of gliadin， Gli-γ1 was found in all three varieties， however only Gli-γ2 was found in SG-3. The end-use of quality of SG-1 was found to be superior to that of Jinqiang 6， a wheat variety with good end-use quality. Sequence analysis of high molecular weight glutenin subunits identified variation in the By8 subunit of SG-1 and SG-3， indicating that although they shared identical subunits， there was still variation in the sequence. This variation in sequence could potentially explain the poorer performance in end-use quality observed in varieties carrying elite high-quality subunits. Interestingly， the researchers also noted that SG-1， despite carrying a non-premium subunit， exhibited elite end-use quality. This suggests the existence of alternate pathways by which SG-1 can improve wheat end-use quality. Overall， this study expands the genetic resources accessible for wheat end-use quality breeding while also providing new resources and a theoretical basis for studying the mechanism of wheat end-use quality improvement.

Key words： wheat; seed storage protein; high molecular weight glutenin; gliadin; wheat end-use quality

小麥（Triticumaestivum L.）是重要的口糧作物，為全球五分之一的人口提供了能量和蛋白質^[1]。小麥粉可以形成獨特的面筋蛋白，且依據面筋蛋白含量、質量不同，能夠被加工成類型多樣的面食品，如面包、餃子、蛋糕和餅干等^[2]。由于面食品的口感、外觀等綜合表現是由小麥品種的加工品質特性決定的，因此加工品質遺傳改良是小麥育種的重要育種目標。

小麥籽粒的面筋蛋白主要由谷蛋白和醇溶蛋白組成，是影響小麥加工品質的重要因素，在品質遺傳改良中發揮了至關重要的作用^[3]。谷蛋白是能夠溶解于酸或者堿溶液的蛋白質；醇溶蛋白主要溶解于醇類物質^[4]。二者被認為是重要的籽粒儲藏蛋白，約占籽粒蛋白含量的80%。小麥谷蛋白與小麥醇溶蛋白通過蛋白質之間的相互作用形成面筋^[5]，其中谷蛋白決定了面團的彈性，醇溶蛋白決定了面團的延展性和粘性^[6]。因此，谷蛋白和醇溶蛋白參與形成的面筋蛋白質量與小麥的營養品質及加工品質密切相關。

目前對于谷蛋白的研究相對清楚，依據谷蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上的遷移速率不同，將遷移速率慢的蛋白亞基（分子量為80 ～120 KDa）稱為高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS），遷移速率快的（分子量為20 ～45 KDa）稱為低分子量谷蛋白亞基（LMW-GS）。高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）由第一部分同源群染色體長臂上的Glu-1A、Glu-1B、Glu-1D座位編碼，每個座位編碼2個連鎖的基因，分別為x和y基因。因此，高分子量谷蛋白編碼基因數量有限，共6個編碼基因，為1Ax、1Ay、1Bx、1By、1Dx、1Dy。其中，1Ay不表達，1Ax在部分材料中表達^[7]。因此，在一個小麥材料中，通常可以檢測到4～5個高分子量谷蛋白亞基表達^[8]。低分子量谷蛋白（LMW-GS）編碼基因位于第一同源群的短臂上，由多個成簇的基因編碼^[9]。目前明確Dx5+Dy10高分子量谷蛋白亞基對為優異的亞基，攜帶該亞基對的材料烘焙品質優于攜帶Dx2+Dy10亞基對的材料。同時含有1Ax、1Bx7^OE的材料烘焙品質優良。大部分優質小麥材料的籽粒高分子量谷蛋白組成為1Ax、1Bx7^OE+1By8、1Dx5+1Dy10。這些材料為品質育種的重要親本資源。

根據醇溶蛋白在A-PAGE電泳圖譜上的相對遷移速率可以將醇溶蛋白分為α/β、γ、ω3類^[10]。其中α/β型醇溶蛋白占醇溶蛋白總量的55%^[11]。由于α、β在電泳圖譜上的位置及結構相似，且都為含硫量較高的蛋白質，一般不做區分^[3]。γ型醇溶蛋白占醇溶蛋白總量的30%，其含硫量較低^[12-13]。ω型醇溶蛋白不含硫，且在電泳圖譜上的遷移速率最慢，其相對分子量最大，但是占醇溶蛋白總量最少，僅占其總量的15%^[14]。α/β、γ型醇溶蛋白由于含有半胱氨酸等含硫氨基酸又被稱為富硫醇溶蛋白，而ω型醇溶蛋白不含半胱氨酸和甲硫氨酸，其氨基酸組成的80%為脯氨酸、苯丙氨酸和谷氨酰胺，因此被稱為貧硫醇溶蛋白^[15]。目前認為降低醇溶蛋白含量能夠提升小麥加工品質。前人研究表明，同時增加面粉中的α/β、γ、ω型醇溶蛋白的含量縮短了面團的形成時間，降低了面包高度，增加了面團的延展性^[16]。同時，研究發現，增加ω型醇溶蛋白比增加等量的α/β型醇溶蛋白能夠降低面粉加工品質^[16]。通過基因編輯技術敲除部分γ型醇溶蛋白，顯著提升了小麥加工品質。關于醇溶蛋白對加工品質的研究還不夠深入，限制了醇溶蛋白在品質遺傳改良中的利用。

目前，天津市農業科學院保有一批加工品質優良的小麥資源。本研究通過鑒定其高分子谷蛋白亞基組成、醇溶蛋白亞基組成、籽粒性狀等信息，評價其用于小麥品質育種的可能性及利用方式，為豐富天津地區小麥品質育種基因資源提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為SG-1、SG-2、SG-3、津強11號、津強6號、中國春共6份小麥種子，由天津市農業科學院農作物研究所提供，于2023年種植于天津市農業科學院農作物研究所試驗地（117° E，39° N），株距1.5 cm，行距25 cm，行長2 m。

1.2 試驗方法

1.2.1 谷蛋白的提取及鑒定 （1）將小麥種子研磨成粉末后轉移到2.0 mL離心管中。

（2）加入1 600 μL提取液A（7.5 mL異丙醇+4.5 g NaI）制成懸浮液，之后放入烘箱中，溫度設置65 ℃，提取1 h，期間每隔10 min搖晃振蕩1次，1 h后轉入離心機10 000 r·min^-1離心3 min，棄上清液。

（3）重復步驟（2）1次。

（4）在上述沉淀中加入4 00 μL提取液B（25 mL異丙醇+4 mL Tris-HCl pH=0.8+10 g SDS+2 g DTT），充分渦旋后，放于烘箱中，溫度設置65 ℃，提取1 h。期間每隔10 min搖晃振蕩1次。

（5）加入400 μL提取液C（25 mL異丙醇+4 mL Tris-HCl pH=0.8+10 g SDS+1.4 mL VP），充分渦旋混勻，放于烘箱中，溫度設置65℃，提取30 min，之后轉入離心機，10 000 r·min^-1離心5 min。

（6）將上述800 μL上清液吸出，轉移到新的2.0 mL離心管中，編號一一對應，并加入400 μL提取液D（62.5 mL Tris-HCl pH=6.8+5 mL β-巰基乙醇+20 mL甘油+2 g SDS+0.2 g 溴酚藍），充分渦旋混勻。

（7）下層膠的制備：使用PAGE凝膠快速制備試劑盒（由上海雅酶生物科技有限公司提供），2個燒杯各加入15 mL下層膠溶液12.5%+15 mL下層膠緩沖液，充分混勻后加入300 μL促凝劑，充分混勻，倒入兩板之間（液體距離梳齒約1 cm）。

（8）上層膠的制備：使用PAGE凝膠快速制備試劑盒（由上海雅酶生物科技有限公司提供），另外2個燒杯中各加入5 mL上層膠溶液+5 mL彩色上層膠緩沖液（彩色上層膠緩沖液使用前搖勻），充分混勻后加入100 μL促凝劑，充分混勻倒入兩板之間插上梳子。

（9）拆下膠板，耳板一側朝內安裝到電泳設備上。

（10）加入1X SDS-PAGE電極液（表1），電極液沒過膠孔。

（11）點樣：從左往右上樣，上樣3 μL。

（12）跑膠：將電泳設備轉移到電泳槽中，加入1X電極液。電線連接電泳設備和電泳儀，電極兩端顏色保持一致。電壓設置120 V，時間5 h。

（13）起膠、染色：考馬斯亮藍R-250染液（表2）沒過膠面，染色20 min。

（14）脫色、讀帶。

1.2.2 醇溶蛋白提取及鑒定 （1）將種子研磨成粉末放入2.0 mL離心管中。

（2）加入400 μL醇溶蛋白提取液（表3），90°放置在搖床上，室溫下200 r·min^-1，搖晃1 h，再加入400 μL loading buffer（表4），12 000 r·min^-1離心2 min。

（3）在30 mL預制膠溶液（表5）中加入75 μL H2O2，用藍槍頭快速攪拌均勻并倒入兩板之間，插好梳子。待燒杯中殘留的膠液凝固后，拔掉梳子。

（4）加入1× A-PAGE電極液（表6，20×電極液用前稀釋為1×電極液），電極液沒過膠孔。

（5）點樣：從左往右上樣，上樣3 μL。

（6）跑膠：電壓設置500 V，時間40 min。

（7）起膠、染色：考馬斯亮藍R-250染液（表2）沒過膠面，染色15 min。

（8）脫色、讀帶：將膠塊從染液中撈出，放入清水中，脫色后讀帶記錄、拍照。

1.2.3 高分子量谷蛋白亞基鑒定 根據已經公布的中國春參考基因組、10+genome參考基因組上的高分子量谷蛋白的序列設計1Bx，1By，1Dx，1Dy編碼基因的特異性擴增引物，對高分子量谷蛋白編碼基因進行擴增（表7）并測序，使用DNAMAN軟件進行序列比對分析。

1.2.4 SDS-沉降值測定 （1）稱取面粉樣品（2.00±0.01）g，于35 mL平底玻璃試管中。

（2）加入16.7 mL的溴酚藍工作液，加上塞子。將面粉與溶液混勻，放到沉降值測定儀上搖勻5 min。

（3）加入16.7 mL 1 ∶ 50乳酸-SDS工作液，蓋上塞子，上下顛倒混勻，將試管放置于搖床上震蕩5 min。

（4）從搖床上取下試管，立即將其豎立在水平桌面上，靜置5 min，迅速讀取沉淀物體積，即為SDS-沉降值。

2 結果與分析

本研究通過在天津市農業科學院歷年收集的農家種中篩選出了3個農藝性狀優良的春小麥新資源，為了明確上述農家種在小麥加工品質中的利用價值，進行了谷蛋白亞基分析、醇溶蛋白帶譜分析、高分子量谷蛋白基因型分析、加工品質初步分析。

2.1 高分子量谷蛋白組成

為了明確SG-1、SG-2、SG-3是否含有優質谷蛋白亞基，本研究以天津主栽的優質強筋春小麥津強11號和公布了參考基因組序列信息的春小麥品種中國春為對照，通過SDS-PAGE電泳分析SG-1、SG-2和SG-3的谷蛋白亞基組成。津強11號的高分子量谷蛋白亞基由1Ax2*、1Dx5+1Dy10、1Bx7^OE+1By8組成，由于其高分子量谷蛋白亞基均為優質亞基，其加工品質優于大部分春小麥栽培品種。中國春的高分子量谷蛋白亞基由1Axnull、1Dx2+1Dy12、1Bx7+1By8組成。結果表明，SG-1、SG-2、SG-3在Glu-1A座位上均不表達，未檢測到谷蛋白亞基條帶。Glu-1B座位上SG-1和SG-3為1Bx7+1By8亞基，SG-2為1Bx7+1By9亞基。Glu-1D座位上SG-2和SG-3為1Dx5+1Dy10優質亞基，SG-1為1Dx2+1Dy12亞基。SG-1、SG-2和SG-3在低分子谷蛋白區域存在條帶變異（圖1）。

2.2 醇溶蛋白組成

由于醇溶蛋白影響面團的延展性，影響小麥加工品質。本研究通過酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）對SG-1、SG-2、SG-3的醇溶蛋白亞基組成進行分析（圖2）。與低分子量谷蛋白亞基組成類似，SG-1、SG-2、SG-3的醇溶蛋白亞基變異豐富，各不相同。在ω區，SG-1和SG-2條帶一致，但是SG-3呈現不同的亞基分布。在γ區，SG-1、SG-2、SG-3均可檢測到γ1條帶，但SG-3還可以檢測到γ2條帶。α區SG-1、SG-2、SG-3的醇溶蛋白亞基各不相同，與中國春相比，組成不同，可能為小麥加工品質育種提供豐富的基因資源。

2.3 SDS-沉降值分析

由于SG-1、SG-2、SG-3在籽粒儲藏蛋白組成上各不相同，可能在加工品質上存在差異，為了進一步鑒定SG-1、SG-2、SG-3在小麥加工品質中的差異，本研究通過微量SDS沉降值來評價SG-1、SG-2、SG-3的加工品質。結果表明，SG-1、SG-2、SG-3的沉降值分別為24.8、20.3、21.9 mL，目前天津地區優質強筋小麥津強6號的沉降值為23.2 mL（圖3）。這說明本批次材料中SG-1的加工品質超過津強6號，可作為品質育種提升的候選親本。

2.4 高分子量谷蛋白序列信息分析

為了明確各個材料的序列信息，本研究通過設計特異性引物克隆1Dx、1Dy12、1Bx、1By基因，由于未能設計出1Bx位點的特異引物，僅對1Dx、1Dy12、1By基因進行分析。1By位點克隆結果表明，雖然SG-1和SG-3在SDS-PAGE上都呈現By8亞基，但是序列分析在第78位氨基酸存在1個脯氨酸（P）和亮氨酸（L）的差異，在第264位氨基酸存在甘氨酸（G）和精氨酸（R）的差異，同時在279～340的氨基酸區間上存在大量的序列差異（圖4）。這說明雖然氨基酸遷移速率接近，但是氨基酸序列不一致，也可能導致品質存在差異。測序表明，SG-2的By9型亞基和SG-1的By8型亞基主要是在320～340區間內連續丟失了15個氨基酸，導致SDS-PAGE的遷移速率不同。SG-2和SG-1在第350位氨基酸存在甘氨酸（G）和丙氨酸（A）的差異。

SDS -PAGE分析表明，SG-2和SG-3為Dx5型亞基，SG-1為Dx2型亞基。序列分析表明，SG-2和SG-3編碼的亞基序列一致。測序表明，Dx5和Dx2亞基長度分別為847 aa和838 aa，相差9個氨基酸殘基，差異主要位于第18位、第173位、第182位、第201位、第337位、第430位、第589位、第599位、第636位、第650位、第720位和第756位氨基酸，Dx2型亞基在599～607區間連續丟失9個氨基酸，在623～634區間分別連續丟失12個氨基酸（圖5）。Dy亞基序列分析表明，SG-2和SG-3編碼的亞基序列一致，Dy10和Dy12亞基長度分別為647 aa和657 aa，相差10個氨基酸殘基，差異主要位于第130位、第186位、第215位、第264位、第300位、第393位、第491位、第546位、第551位、557位、第581位和第612位氨基酸。SG-1在77-78區間連續丟失2個氨基酸，SG-2和SG-3在200～205、229～234均丟失6個氨基酸（圖6）。

2.5 籽粒表型分析

白粒小麥的商品性高于紅粒小麥，天津地區主栽的強筋春小麥均為紅粒品種，急需利用白粒優質強筋資源提升商品性。本研究在收集到的籽粒中，篩選到2個白粒資源SG-1和SG-3（圖7-A、圖7-C）。籽粒性狀分析表明，SG-1、SG-2、SG-3的籽粒長度分別為0.70、0.66、0.76 cm；籽粒寬度分別為0.38、0.37、0.41 cm（圖7-B、圖7-D）。SG-1、SG-2、SG-3籽粒長度、寬度正常，可以作為白粒資源用于春小麥品質改良。

3 討論與結論

由于目前強筋春小麥主栽品種多為紅粒，商品性較差。白粒主栽品種津強7和津強12雖籽粒顏色為白色，但其加工品質達不到強筋小麥標準^[17-18]。在育種上通常采用強強聯合的方式配置雜交組合。因此，目前缺少強筋白粒資源。本研究鑒定到的SG-1材料SDS的沉降值為24.8 mL，高于天津主栽的強筋品種津強6號的沉降值23.2 mL。SG-1在育種中可能是可以利用的強筋白粒春小麥新資源，可與新創制的資源配置組合，提升新資源的綜合農藝性狀。

研究表明，谷蛋白與醇溶蛋白的含量比例（Glu/Gli）影響小麥加工品質^[19]。同時醇溶蛋白和谷蛋白含量之間存在回補效應，即當醇溶蛋白含量降低時可能伴隨谷蛋白含量的升高^[20]。因此，醇溶蛋白含量降低能夠提升小麥加工品質^[20]。SG-1、SG-2在γ區中僅含有γ-1醇溶蛋白，缺失γ-2醇溶蛋白。SG-1由于缺少γ-2亞基，因而具備良好的小麥加工品質。

高分子量谷蛋白亞基對加工品質起到了重要的作用^[21]。通過SDS-PAGE對高分子量谷蛋白亞基進行劃分，不能獲得序列變異信息。通過基因序列分析發現，雖然SG-1和SG-3在Glu-1B基因座位攜帶1By8亞基^[22]，但是序列存在差異。Glu-1D基因座位序列沒有檢測出序列差異，可能是B基因組起源復雜，而D基因組起源相對單一^[23]。因此，未來需要建立一種可以在基因層面快速鑒定谷蛋白組成的方法，如芯片、標記等檢測方法。

目前，強筋小麥的主要遺傳機制在于Glu-1D基因座位攜帶優質的高分子量谷蛋白亞基1Dx5+1Dy10^[24]。強筋春小麥除了攜帶1Dx5+1Dy10優質亞基外，在Glu-1B基因座位攜帶1Bx7^OE亞基^[25]。這些亞基的使用提升了小麥的加工品質，但是也造成了遺傳資源狹窄的困境，小麥加工品質再次提升存在瓶頸。因此，需要引入新的基因資源，提升小麥加工品質。本研究發現了SG-1，雖然其加工品質優良，但是其高分子量谷蛋白亞基在Glu-1D基因座位攜帶的是非優質的高分子量谷蛋白亞基1Dx2+1Dy12。因此，其優質強筋的產生機制可能是醇溶蛋白引起的。在今后的研究中，本課題組計劃對SG-1的籽粒胚乳進行全長轉錄組測序，獲取其籽粒儲藏蛋白轉錄本，進而解析其優質機理，用于小麥加工品質改良。同時對新創制的資源進行轉錄本測序，明確新資源在品質育種中的利用潛力。

由于SG-1不在Glu-1A位點攜帶1Axnull，其基因不表達，可以通過與天津主栽的優質強筋材料津強11號和津強6號進行雜交，在F2代中通過SDS-PAGE篩選攜帶Glu-1A2*、1Dx5+1Dy10、1Bx7^OE+1By8亞基的材料，同時利用A-PAGE對醇溶蛋白進行篩選，過濾醇溶蛋白亞基較多的后代，創制超強筋新資源，選育白粒、優質、強筋新品種。

本研究初步解釋了攜帶優質亞基的品種在加工品質上表現不佳的原因可能是氨基酸序列存在差異。同時，筆者發現，攜帶非優質亞基但具有優良加工品質的SG-1。這說明SG-1可能存在其他能夠提升小麥加工品質的機制。

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收稿日期：2023-11-21

基金項目：“錫雜麥”小麥新品種栽培關鍵技術研發（XMZD202301）

作者簡介：劉穎（1998—），女，河北張家口人，在讀碩士生，主要從事小麥品質育種研究。

同等貢獻作者簡介：劉泮旭（1985—），男，天津人，高級農藝師，主要從事小麥種子推廣研究。

通訊作者簡介：劉丹（1989—），女，河北滄州人，副研究員，博士，主要從事小麥基因挖掘與功能驗證相關研究。

袁卉馥（1970—），女，河北承德人，教授，碩士生導師，主要從事作物栽培研究。