諾獎得主阿諾德的新方向：培育優化酶

編譯/舒愉棉

弗朗西斯 · 阿諾德（Frances Arnold）因開創性的酶定向演化技術而獲得2018年諾貝爾化學獎，該技術使酶能被應用于橫跨醫藥、消費品、農業、燃料和化學品生產的可持續化學領域。阿諾德現任加州理工學院化學工程、生物工程和生物化學專業的萊納斯 · 鮑林教授[加州理工學院為紀念著名科學家萊納斯 · 鮑林（Linus Pauling）而命名的教授職位]。2021年，現任美國總統拜登任命她為總統科學技術顧問委員會（PCAST）聯合主席。阿諾德曾被美國前總統奧巴馬授予美國國家技術與創新獎章。在2023年國際卓越研究論壇上，她圍繞用于工程改造酶從而賦予其新功能的演化工藝做學術報告。在本次采訪中，她與《美國科學家》（American Scientist ）雜志主編費內拉 · 桑德斯（Fenella Saunder）探討她最新的研究成果。

弗朗西斯·阿諾德

如何為“定向演化”這一概念下定義？

20世紀80年代，當我開始從事蛋白質工程師這一工作時，沒人知道獲得優化蛋白質的規則是什么——優化意味著蛋白質能夠執行人類感興趣而非攜帶它的生物體感興趣的功能。沒人知道氨基酸序列與蛋白質功能之間的映射關系，我們也不知道這在酶中是什么情況，更不知道哪些編碼能產生特定功能。如今我們知道了怎么解讀DNA，能對DNA測序；我們知道了怎么寫入DNA，能合成DNA；我們知道了怎么編輯DNA。但我們不知道如何組合DNA，而這個問題在演化中已經被解決得非常非常好了。所以為了克服我們對DNA序列和編碼在酶中的作用幾近一無所知，我決定采用已經被證明非常有用的自然進程——演化。我所做的，就是主導酶的演化。

定向演化早在20世紀80年代就通過分子生物學的技術實現了。我將這三種技術湊到了一起：因易出錯從而能在基因中制造突變的PCR技術（聚合酶鏈式反應，一種復制DNA的方法）、能將這些突變基因整合到微生物中并且能表達出突變蛋白質的DNA重組技術以及能半高通量進行篩選的技術。首臺能夠觀察96孔板的光譜儀問世于20世紀80年代末，因此我將這些零件拉扯到一起，開始篩選突變蛋白庫并尋找有益突變，再將這些反饋到迭代了的流程中，即酶的演化優化。你猜怎么著？效果非常好。

自然選擇產生的并不總是最佳的適應產物，而是那些剛好能承受選擇壓力的生物。這是否是定向演化能產生新功能的一部分原因呢？

誠然，要是沒有進步的空間，演化也不會行得通，對吧？如果你已經處于最佳狀態了，那么給予任何干預都不會起作用，這樣要走上坡路就很難。但是如果人為改變了適配標準，那么全景圖譜中其他部分峰值的相關適配度就被降低了，這就為進一步優化創造了空間。人為改變適配標準就是我們在讓酶演化從而去完成一些非自然任務（就是那些酶普遍不熱衷去完成的任務）時所做的事情，這至關重要。我們通常發現改進酶的天然功能或自然環境很困難，但通過改造酶，讓它們去完成一些自然所賦予不同的任務時，事情就真的很簡單了。

在靶向突變區域時，您是否并非隨機引入突變，而是融合了您對蛋白質和生物酶的博學廣識呢？

人們以為自己掌握了規則（或者至少是一部分規則），所以常常傾向這樣去做。但這不就把驚喜給排除在外了嗎？所以，當我們嘗試要改變底物特異性時，我們確實常常會靶向生物酶的活性位點。但我們也注意到，當進行隨機突變時，我們會發現其他額外的有益突變，這些突變的效果我們能觀察到，卻無法解釋。如果不進行更廣泛地觀察，你就會錯過學習和意外收獲的機會。

每個人都傾向于靶向突變，因為篩選所有的酶變異體很痛苦，而人們認為自己已知的優于隨機的。但有時候我們已知的并不優于隨機的，這就是有意思的部分了。

當您發現了自己無法解釋的有益突變，這是否意味著理論的不完整呢？

讓我們試著把視角帶回到20世紀80年代。那時候的理論非常有限，對吧？我們所用來了解突變效應的工具極為有限。人們會說，好吧，蛋白質的表面對于其功能而言并不重要，諸如此類的話。但是這些更多的是經驗法則而不是任何詳細的理論。我認為咱們的經驗法則顯然是錯誤的。利用這一點，我發現有益突變會存在于人們以為不重要的蛋白質區域。這讓人們更加堅定“演化是位好老師”這一觀點?；诶碚撊ピO計好的酶仍然很困難。

您的發現是否類似于演化計算，即這些程序有時候會開發出來看似并不重要、但如果將其刪除代碼就無法工作的片段呢？

是的，我認為我們都有一個共同的元素：意外驚喜。兩個領域都找到了很難進行逆向工程的解決方案。在蛋白質領域，逆向工程被稱為生物化學：人們嘗試理解為什么一個序列具有特定的功能以及這個功能是如何演化的。即使我們掌握適應性突變，這件事對于實驗室演化而來的酶而言與自然演化而來的酶一樣難以做到，我們知道突變是什么，但試圖理解它們正在做什么依舊具有挑戰，更別提要做預測了。演化計算也存在一些相同的特征。

您是如何將機器學習引進實驗室的？

定向演化的強大之處在于它的穩定性，并且對解決許多問題都非常管用，是一款很普適的程序性技術。缺點則是速度慢且令人痛苦。你不得不制造出所有的突變，然后不得不檢測所有的突變，因為絕大多數突變并非有益因而還必須得棄用，爾后常常還不得不重復好幾輪上述步驟。這些執行起來非常冗長沉悶。

我們夢寐以求的是可以做規模小一些的實驗，可能的話，不使用相同的突變范式獲得數據，然后將數據與我們對蛋白質的了解結合起來——多序列比對、演化語言模型、結構、分子動力學模擬——并從中學習。我們會使用多模態模型來根據我們在每一輪中學習到的信息來預測下一組應該制作的變異體序列是什么。這就是我們的夢寐以求，也是我們目前正在努力實現的目標。如今，我們死磕這個問題已經好些年了，嘗試測試不同的機器學習過程來看哪些過程有優勢且在哪種條件下具有優勢。不過我們也已經發現了，良好而傳統的定向演化是非常棒的基準線，在很多問題面前都難以被撼動。

自20世紀80年代您開始這項工作至今，技術已經發生了如此多的改變，您是否不得不讓自己和工序一道基于當今可供使用的技術來進行適應和調整呢？

我熱愛工具，作為工程師，我會抓住任何有用的新工具。有許多工具并沒有什么用處，所以真正的訣竅在于知道哪些工具能提供更好的信息，創建更好的數據庫，等等，然后我會很樂意使用這些工具。舉個例子，如今我們可以使用質譜進行中通量篩選，這在過去我們無法做到，現在我們甚至可以使用液相色譜質譜（LCMS）來識別優化后的酶。我們能通過不同的方式制造突變酶庫。別人也開發出了非常強大的連續演化工具，這些沒有像我在20世紀八九十年代描述的那樣普適，但對于特定問題它們更強大。所以被開發出來的不只有工具，還有運用演化來設計的全新模式。

有了定向演化，自上而下式的基于設計構建蛋白質的方法是否還有一席之地呢？

就采用定向演化而言，工作人員總是需要有一個起始點，而這個起始點必須表現出充分的所需功能或與之相近的功能，并且可供測量評估，從而可以對其進行改進。我們常常被卡在找到這個起始點。所以蛋白質設計可能的最大好處之一就是創造一個蹩腳的生物酶，而這個生物酶可以成為定向演化改進的起始點，因此這便有了一個將兩種技術完美融合的案例。蛋白質設計還將人帶入與自然界全然不同的序列空間，也將人帶入不同的功能空間。如今真正的挑戰是如何設計擁有我們所需新功能的酶或蛋白質。如果你能做到這一點，你大概就能用這種設計所得的酶來通過定向演化進行改造了。

定向演化是如何幫助減少化工業產生的廢棄物呢？

這就是我所研究的主要關注焦點。對我來說，酶及產生酶的微生物的亮點之處在于它們能利用可再生富集資源并將其轉化為大量漂亮的化學產物與材料。我們只是淺嘗輒止地訓練微生物和演化它們所生產的酶來為我們做到這些。化學工藝可以完全被酶法工藝取代，如今已經有一些很好的案例。例如，默克公司因其證明能在制藥過程中大幅減少廢棄物產生而獲得了美國環境保護署（EPA）頒布的綠色化學挑戰獎，具體做法便是不再使用有毒重金屬，而是采用酶。微生物會為了獲取糖分而生產這些絕妙的催化劑，這于未來而言有著美好的前景。

那在您看來，這些酶是否很快就會得到廣泛使用呢？

其實，酶已經是一門大生意了。很多酶已經出現在了消費品中。在你的洗衣粉里有各種酶，在各種生產工藝里有各種酶，乙醇產物里或者制造高果糖玉米糖漿過程中有酶和微生物。各種大規模工藝過程都用上了酶。

其實，我們對化學工藝的環境友好性和可持續性要求越高，就越要為產生的廢棄物付出代價——于社會而言要為這些廢棄物付出真正的代價，因此對于任何使用這些產品的人而言，產生這些廢物都應該付出代價——我們越是讓生產商將這些代價內化，我們就越會見到酶被采用。人們會自然地向這一點轉變。舉例來說，這就是為什么默克公司轉向生物催化的原因，因為他們不想每生產一公斤藥品就產生數百公斤廢棄物。處理這些廢棄物的代價是高昂的。所以我看到這一改變正在發生。我們身處于轉變的初始階段，但我希望，在接下來的十年或二十年里，我們能見證更多的轉變，那些從當前需要靠“壞屬性”的化學試劑來完成的工藝轉向使用好的酶的轉變。

定向演化是否能讓酶在極端環境下工作？

能。降解聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料的酶已經演化到十分堅韌，因此能在高溫或極限條件下的工業降解過程中工作。纖維素酶的熱穩定性也得到了提升，因此能在原料流黏度較低而動力學較高的條件下將纖維素降解為糖。幾乎所有的工業案例和工藝都受益于讓酶變得更具耐受性，因為這樣酶的使用壽命也往往更長，從而降低了成本。

我的意思是，即使是洗衣粉里的酶也得有耐受性，對吧？畢竟誰想在充滿了表面活性劑和漂白劑種種的洗衣機里工作呢？這些酶必須得是非常能忍的“小狗皮膏藥”。

碳封存也是一個很好的例子。酶工程公司Codexis證實他們能制造一種能在接近100攝氏度作業的碳酸酐酶，并且在這一溫度下工藝成效會好得多，而酶的作業環境惡劣到令人驚訝的程度。酶的耐受力比人們想象的還要強得多。當然，它們同時也會非常小，有時候表現得也會很糟糕。

演化后的酶是否會被用于可再生能源生產呢？

2004年，我聯合其他人創辦了一家名為Gevo的公司，就是通過可再生植物資源生產液體燃料。該公司于2011年上市，目前仍在營業。我們擁有利用玉米和農業廢棄物生產異丁醇的技術。然而，石油價格暴跌，玉米價格暴漲，靠這個根本賺不到錢。如果我們不將二氧化碳成本內部化，要與地下開采出的能源競爭十分困難。市面上有很多很棒的技術?？稍偕掖既缃癖挥脕碇圃靽姎馊剂希⑶疫€有其他許多可能用途。但最重要的是，除非我們真正考慮到從石油中制造這些燃料的環境氣候成本，否則生物工藝很難與之競爭。

但我認為將生物學和生物世界里的化學引入我們人類的化學世界，未來是非常光明的，反之亦然！我們可以從化學家所做過的工作中學習，并將其用于教授生物學如何去執行全新的化學任務。所以我們有許多可以相互學習的東西。這是一個全新的領域，對社會發展有巨大的潛力。

您的學術之路并非一步到位，而您也似乎對打破常規毫無保留。在您看來這些偏好是否有助于您在研究中的創新呢？

我認為助我創新的是我愿意嘗試各種新事物的意愿。我擁有機械與航空航天工程學士學位和化學工程的博士學位。我必須學習一些生物學知識。我曾旅居世界各地，在讀研究生之前做過很多不同類型的工作。我不害怕學習新事物、做新事情，也不害怕以不同于標準的視角看待問題。老實說，如果你要走出去做一些全新的事，你需要具有一定程度的無畏，并且能接受批評，不會在做特立獨行之事所帶來的負面關注下崩潰。所以我認為，20世紀70年代我所做過的不符合當時對女性定義的標準的事情為后來的我決定在一個當時尚不存在的領域里從事研究提供了優勢。

很多人就我的諾貝爾獎獲獎之旅發問，好像這樣能指明他們自己的道路。要我說，并不存在唯一的道路——你走你自己的路。你必須成為你自己，而不是去模仿其他人。我的意思是，于我自己而言，有趣的道路就是不要與他人相同。好的道路就是擁抱自己的獨一無二，去做自己的與眾不同。

資料來源 American Scientist