LncRNA SENCR靶向miR-206調(diào)控人主動脈夾層血管平滑肌細胞增殖和凋亡

馬潤偉 穆純杰 桂雯婷 鄧瑤 趙敏章 柳民 宋怡

云南省阜外心血管病醫(yī)院1心血管外科，2體外循環(huán)科 （昆明 650102）

主動脈夾層（aortic dissection， AD）是一種發(fā)生在主動脈壁內(nèi)層撕裂的心血管疾病，在世界范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率和病死率［1］。主動脈內(nèi)壁的撕裂導(dǎo)致血液通過撕裂進入血管壁。AD 患者主動脈發(fā)生血管平滑肌細胞丟失、中膜細胞外基質(zhì)降解、炎癥細胞浸潤等病理改變［2］。AD 患者主動脈壁的典型特征包括彈性纖維斷裂和丟失，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）丟失，粘多糖積累［3］。細胞增殖抑制、細胞凋亡、壞死和自噬增強都是導(dǎo)致主動脈壁VSMC 喪失的可能原因［4-5］。VSMC 的增殖和凋亡的動態(tài)平衡在多種心血管疾病中起著重要作用。

在心血管細胞生物學和動脈粥樣硬化的病理過程中，非編碼RNA（ncRNAs）調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細胞和分子過程［6］，包括細胞增殖、侵襲和存活，脂質(zhì)的細胞攝取和外排，促炎和抗炎介質(zhì)的表達和釋放，以及蛋白水解平衡［7］。有報道稱lncRNAs 在冠狀動脈粥樣硬化［8］、擴張型心肌病［9］和心力衰竭［10］等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，平滑肌和內(nèi)皮細胞富集遷移/分化相關(guān)lncRNA（smooth muscle and endothelial cell-enriched migration/differentiation associated lncRNA，SENCR）在冠心病患者外周血中低表達，SENCR 可以抑制平滑肌細胞的增殖、遷移并阻滯細胞周期［11］，穩(wěn)定平滑肌細胞的收縮表型［12］。SENCR 在腹主動脈瘤中表達降低，過表達SENCR 后可以通過抑制VSMC 凋亡和細胞外基質(zhì)降解來抑制腹主動脈瘤的形成［13］。SENCR在高葡萄糖暴露的平滑肌細胞中，其過表達可逆轉(zhuǎn)高葡萄糖對小鼠VSMC 增殖和遷移的影響［14］。因此，研究SENCR 在AD 中的功能和調(diào)控機制，有助于進一步闡明AD 的分子治療靶點。LncRNA 表達異常可靶向調(diào)控miRNAs 在多種疾病，如帕金森病［15］、癌癥［16］中發(fā)揮重要作用。miR-206 通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響肺動脈平滑肌細胞的增殖和凋亡［17］。然而，lncRNA SENCR 靶向miR-206 對AD 的調(diào)控及其相關(guān)作用機制尚不清楚。因此，本研究探討lncRNA SENCR 靶向miR-206 對HVSMC 增殖和凋亡的影響，旨在初步探討SENCR 在主動脈夾層中的表達變化及其對人血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料選取2019 年3 月至2021 年5 月云南阜外心血管醫(yī)院手術(shù)切除的主動脈夾層組織15 例，同時收集同期該院外傷患者正常主動脈血管組織15 例。樣本采集均經(jīng)過患者同意和近親親屬同意。本研究得到云南省阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會批準（編號：2020-032-1）。人主動脈血管平滑肌細胞購買于江蘇齊氏生物科技有限公司。HE 染色試劑盒（G1120）購于北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 檢測試劑盒（C0037）和Annexin V/PI雙染檢測試劑盒（C1062M）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FISH 探針試劑盒購于上海吉瑪；TRIzol（15596018）購于Invitrogen 公司；miRNA 提取試劑盒（RN0501）、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PC4801）和miRNA qPCR 試劑盒（PC6301）購于北京艾德萊生物科技有限公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036Q）和SYBR Green Premix（RR420A）購于Takara 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（E1910）購于Promega 公司。

1.2 HE 染色樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 后，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm。用二甲苯脫蠟2 次，每次5 min；再用梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）復(fù)水，每梯度3 min；蒸餾水浸泡2 min；蘇木精染液染色10 min 后蒸餾水沖洗；分化液分化1 min 后進行流水沖洗5 min；然后伊紅染液進行染色2 min，染色后用梯度乙醇完成脫水，75%、85%、95%、100%乙醇、100%乙醇各浸洗1次，每次1 min。二甲苯透明2 次，每次1 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察拍照。

1.3 熒光原位雜交（FISH）檢測針對SENCR 目的基因、陽性對照18S 及陰性對照，探針序列如下：SENCR probe 基因DNA 序列（5'-3'）：CTGGCTGAATGAGGAGCAATGTGGCTG；18S probe：CTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTC。將人血管平滑肌細胞按2 × 104細胞/孔的密度將貼壁細胞接種于24 孔板中，按照FISH 試劑盒說明書進行實驗操作，實驗結(jié)束后將細胞爬片細胞面朝下蓋在載玻片上于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 RT-qPCR 檢測組織中SENCR 和miR-206 的表達水平分別提取組織和細胞中總RNA 和miRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。建立RT-qPCR 反應(yīng)體系，循環(huán)擴增40 次。引物序列如下，SENCR：FCAGCCAGAAAGGACTCCAACTCC，R-GGAGGCAGCTGGTGCTGAAAG；miR-206：F-TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG；U6：F-CTCGCTTCGGCAGCACA；GAPDH：F-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，RGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT。SENCR 表達水平以GAPDH為內(nèi)參，miR-206表達水平以U6為內(nèi)參。所得循環(huán)值通過2-ΔΔCt法計算SENCR 和miR-206 表達水平。

1.5 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染分別用過表達質(zhì)粒pc-DNA3.1-SENCR 和空載體pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染HVSMCs。轉(zhuǎn)染后分為：正常細胞為Control 組、轉(zhuǎn)染空載體細胞為NC 組、轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SENCR 細胞為SENCR 組對轉(zhuǎn)染結(jié)果進行驗證。轉(zhuǎn)染方法簡述如下：將處于對數(shù)生長期的HVSMCs 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，觀察每孔細胞融合度達80%時進行細胞轉(zhuǎn)染。用50 μL 無血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒及5 μL Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染試劑，室溫輕輕混勻后放置5 min；然后室溫輕輕將稀釋后的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混勻后室溫靜置20 min，然后將混合液加入細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h 后收集細胞進行后續(xù)檢測。

1.6 CCK-8 細胞增殖檢測將HVSMCs 細胞消化后制成細胞懸液，以每孔100 μL 接種于96 孔板預(yù)培養(yǎng)24 h，同時設(shè)置空白組和對照組。沿細胞培養(yǎng)板板壁向每孔加入100 μL 的CCK-8 溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培2 h，使用酶標儀測量各孔的吸光值。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集細胞后添加結(jié)合緩沖液溶液400 μL，然后加入Annexin VFITC 溶液5 μL，混合均勻以后，放在4 ℃避光條件孵育15 min；再加入PI 溶液10 μL，同在4 ℃避光條件孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.8 生物信息學和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烆A(yù)測和驗證SENCR 的靶基因通過生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan 預(yù)測miR-206 與SENCR 基因的結(jié)合位點。將NC 或miR-206 mimic 和psiCHECK2 或SENCR-WT 或SENCR-MUT 熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染HVSMCs。48 h 后，根據(jù)熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟檢測每組HVSMCs 細胞的相對熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學方法采用 GraphPad Prism 5.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FISH及HE染色FISH檢測結(jié)果顯示，SENCR定位于細胞核與細胞質(zhì)（圖1）。且SENCR 在正常的主動脈組織中表達較高，而在夾層組織中表達顯著降低（P＜ 0.001，圖2A、B）。正常血管組織和夾層組織的病理形態(tài)相比，正常主動脈組織表現(xiàn)為完整、連續(xù)的主動脈結(jié)構(gòu)（內(nèi)膜、中膜和外膜），而AD 組血管中膜大量變性，形成空腔，纖維紊亂，內(nèi)膜與中膜分離（圖2C）。

圖1 FISH 檢測SENCR 在HVSMCs 中的定位和表達情況Fig.1 Localization and expression of SENCR in HVSMCs detected by FISH

圖2 SENCR 在正常主動脈及夾層組織中的表達情況Fig.2 Expression of SENCR in normal aorta and dissection

2.2 過表達SENCR 對HVSMC 細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，SENCR 組中SENCR 的表達水平顯著提高（P＜ 0.001，圖3A）。在24、48、72 h，SENCR 組細胞活力明顯低于NC 組（P＜ 0.001，圖3B），說明SENCR 基因過表達能夠有效抑制血管平滑肌細胞的增殖活力。

圖3 SENCR 表達對HVSMC 細胞增殖的影響Fig. 3 The effect of SENCR expression on the proliferation of HVSMC cells

2.3 過表達SENCR 對 HVSMCs 細胞凋亡的影響與NC 組相比，過表達SENCR 后，HVSMCs 細胞表現(xiàn)出明顯的細胞早期凋亡（P＜ 0.001，圖4）。

圖4 SENCR 表達對HVSMC 細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of SENCR expression on apoptosis of HVSMCs

2.4 SENCR 和miR-206 的在夾層中表達及相關(guān)性分析與正常組相比，SENCR 在主動脈夾層中表達下調(diào)（P＜ 0.01，圖5A），而miR-206 在主動脈夾層中表達顯著上調(diào)（P＜ 0.01，圖5B）。在主動脈夾層組織中，SENCR 與miR-206 表達呈負相關(guān)（P＜ 0.01，圖5C）。

圖5 SENCR 和miR-206 在夾層組織中的表達及SENCR 轉(zhuǎn)染驗證Fig.5 Expression of SENCR and miR-206 in Sandwich Tissue and Verification of SENCR Transfection

2.5 SENCR 靶向調(diào)控miR-206通過生物信息學數(shù)據(jù)庫分析顯示，SENCR 的潛在靶基因可能是miR-206（圖6A）。共轉(zhuǎn)染SENCR-WT 和miR-206模擬物的細胞相對熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染SENCR-WT 和miR-206 對照物的相對熒光素酶活性降低（P＜ 0.01，圖6B）。共轉(zhuǎn)染SENCR-MUT 和miR-206 模擬物的細胞相對熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染SENCR-MUT 和miR-206 對照物的無顯著差異（P＞ 0.05，圖6B）。在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SENCR 過表達質(zhì)粒的HVSMCs 中，上調(diào)SENCR 可顯著降低miR-206 的表達（P＜ 0.001，圖6C）。

圖6 SENCR 與miR-206 靶點結(jié)合情況Fig.6 Binding of SENCR to miR-206 targets

3 討論

主動脈平滑肌細胞是構(gòu)成動脈血管壁的主要細胞，HVSMC 的功能作用及穩(wěn)定狀態(tài)在AD 中發(fā)揮著重要作用［18］，因此明確HVSMC 增殖和凋亡的分子機制在AD 治療中具有重要意義。研究［19］顯示，lncRNA 表達異常是介導(dǎo)主動脈平滑肌細胞增殖、凋亡等功能障礙，誘發(fā)主動脈夾層的關(guān)鍵因子。研究［20］發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動脈瘤患者的血液中l(wèi)ncRNA HIF1A-AS1 的表達水平與顱內(nèi)動脈瘤呈正相關(guān)，HIF1A-AS1 過表達可抑制血管平滑肌細胞的增殖。LncRNA H19 在AD 患者胸主動脈組織中異常高表達，可通過競爭結(jié)合并抑制miR-193b-3p 來調(diào)控平滑肌細胞功能并參與AD 的發(fā)展進程［21］。本研究顯示，SENCR 在主動脈夾層組織中的表達顯著降低，提示AD 發(fā)展可能與SENCR 異常表達有關(guān)。為分析SENCR 在AD 中的功能，本研究轉(zhuǎn)染SENCR 到HVSMC 并分析其增殖和凋亡的作用及潛在調(diào)控機制。

SENER 是在血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞中特異表達的lncRNA，位于11 號染色體上，是白血病病毒整合I（FLI1）基因的反義lncRNA，是細胞質(zhì)lncRNA，可分為合成型和收縮型2 種亞型［22］。研究報道，SENCR 過表達可以抑制血管平滑肌細胞的增殖［11］、遷移和表型轉(zhuǎn)換［23］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)SENCR 主要在血管平滑肌細胞的胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達，SENCR 在主動脈夾層患者組織中的表達量明顯低于健康者，其在主動脈夾層的形成過程中可能發(fā)揮負調(diào)控作用。調(diào)控HVSMC 的增殖和凋亡，是研究心血管疾病，如腹主動脈瘤的預(yù)防、診療和預(yù)后的有效方法［24］。本實驗通過轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒使SENCR 在人主動脈平滑肌細胞中過表達，發(fā)現(xiàn)SENCR 過表達會顯著抑制HVSMC 增殖，這與前人研究表明SENCR過表達對HVSMC的抗增殖作用一致。SENCR異常表達導(dǎo)致AD發(fā)生可能與其低表達促進主動脈血管平滑肌細胞過度增殖，使主動脈發(fā)生重塑有關(guān)。以上研究表明，SENCR 可能成為主動脈夾層診斷的生物標志物，調(diào)控SENCR 表達可能是AD 治療的重要干預(yù)措施。

LncRNA-miRNA-mRNA 軸在AD 發(fā)展進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［25］。在心血管疾病中，LncRNA 可以通過與靶基因miRNA 結(jié)合，負向調(diào)控靶基因miRNA 的表達，參與血管平滑肌細胞的凋亡、增殖等［26-27］。本研究顯示，本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測，SENCR 的靶基因miRNA 可能是miRNA-206。雙熒光素酶報告基因驗證SENCR 可靶向結(jié)合miRNA-206。研究［15］發(fā)現(xiàn)，miR-206 可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響肺動脈平滑肌細胞的增殖和凋亡。本研究檢測到miR-206 在AD 中表達顯著上調(diào)。Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在AD 中SENCR 與miR-206 表達呈負相關(guān)，SENCR 過表達導(dǎo)致miR-206 表達下調(diào)，表明SENCR 可通過靶向負調(diào)控miRNA-206 的表達而影響HVSMC 的增殖和凋亡。因此，靶向調(diào)控SENCR/miR-206 途徑可能是AD 的潛在治療策略。

綜上所述，本研究表明主動脈夾層患者組織中SENCR 表達顯著降低，SENCR 與主動脈夾層的形成及發(fā)展密切相關(guān)。過表達SENCR 可通過降低miRNA-206 表達水平，抑制血管平滑肌細胞的增殖并促進凋亡，但SENCR/miR-206 軸在AD 中發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游靶基因還需進一步研究。本研究對SENCR 在HVSMC 中的功能研究為AD 的發(fā)生機制及預(yù)測提供了新的方向。