鐵蛋白自噬在糖尿病及其相關并發癥發病機制中的研究進展

石建梅 王茜茜 韋曉潔

1廣西中醫藥大學基礎醫學院 （南寧 530299）；2廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室（南寧 530299）

糖尿病（Diabetes mellitus， DM）是一組由多種病因引起的以慢性持續性高血糖（hyperglycemia，HG）為特征的終生代謝性疾病，長期代謝紊亂和持續高血糖可逐漸加重患者腎臟、心肌、足部、視網膜、腦血管、神經系統等損傷，從而引發諸多并發癥，目前我國已成為DM第一大國，嚴重危害公眾健康［1-2］。鐵蛋白自噬（Ferritinophagy）是指鐵蛋白水平可以通過靶向鐵蛋白的選擇性自噬過程調節的一種細胞自噬方式，當細胞內鐵離子水平下降時，核受體輔激活蛋白4（nuclear receptor coactivator 4， NCOA4）所介導的自噬受體與鐵蛋白重鏈-1（ferritin heavy chain 1， FTH1）相結合，并被轉送至溶酶體中降解，釋放出游離Fe2+以供機體生理需求。在DM 的HG 條件下，會觸發鐵蛋白自噬相關信號通路，導致鐵蛋白自噬異常，從而影響DM 及其相關并發癥的發生與發展。因此，本文將主要從鐵蛋白自噬的定義、鐵蛋白自噬與鐵死亡的關系、鐵蛋白自噬與DM 及其相關并發癥的關系3 個方面，對鐵蛋白自噬在糖尿病及其并發癥的發病機制中的研究進展進行綜述，為未來在臨床上以鐵蛋白自噬過程為啟發點開發糖尿病及其相關并發癥的靶向治療藥物提供新的視角。

1 鐵蛋白自噬的定義

自噬（autophagy）是一種重要的細胞內降解系統，通過吞噬錯誤折疊的蛋白質、受損的細胞器或胞內的病原體等形成自噬體，而后自噬體與溶酶體部分融合形成自噬溶酶體，利用溶酶體酶去降解受損、老化的細胞器中的內容物，以此保持胞內環境的穩定［3-4］。鐵蛋白自噬是指鐵蛋白的選擇性自噬降解過程，是自噬的一種特殊類型，該過程以NCOA4 作為貨物受體，可與鐵蛋白結合并將其遞送至溶酶體以進行鐵蛋白降解和釋放游離Fe2+，對細胞內鐵的生物利用度至關重要［5］。鐵是人體所需的一種微量元素之一，參與體內的諸多生化反應，所以鐵含量如果不加以調控，便會導致鐵穩態的失衡：過量的亞鐵會通過芬頓反應產生活性氧（reactive oxygen species， ROS），從而導致細胞毒性；過量的鐵以非氧化還原和穩定狀態的Fe3+形式儲存在鐵蛋白中。鐵蛋白是一種細胞內廣泛存在的儲鐵蛋白，由FTH1 和鐵蛋白輕鏈（ferritin light chain， FTL）等24 個亞基組成的復合物，可以積累4 500 個Fe3+，其中，FTH1 的核心螺旋結構可與細胞膜表面受體蛋白結合，而FTL 的核心螺旋結構則會與內體溶酶體蛋白相互作用，并通過自噬途徑來實現鐵蛋白的降解，當胞內游離Fe3+降低，鐵蛋白就會被降解并釋放出大量Fe2+，這一過程就是“鐵蛋白自噬”［6］。簡而言之，細胞內鐵含量水平會影響鐵蛋白的降解釋放，當胞內鐵離子濃度較高的情況下，可引起ROS 的積累，造成鐵死亡；如果細胞內的鐵濃度低于正常值，那么鐵蛋白的降解速度會加快，而過量的鐵離子也會被釋放出來，從而導致鐵蛋白自噬。

2 鐵蛋白自噬的基本步驟

鐵蛋白自噬過程主要包括3 個步驟：一是NCOA4 與鐵蛋白的特異性結合；二是鐵蛋白在自噬溶酶體中的降解；三是Fe2+的釋放。MANCIAS等［7］在2014 年通過對純化的自噬體進行蛋白質組學分析發現NCOA4 作為介導鐵蛋白至自噬溶酶體中進行降解的受體，其C 末端與鐵蛋白FTH1 表面的精氨酸殘基R23 結合，促使與鐵蛋白結合的鐵離子釋放成為游離鐵，并將此過程被命名為“鐵蛋白自噬”（ferritinophagy）。在研究中，研究者們發現NCOA4 是一種包含4 個結構域的蛋白質，即NCOA4α、NCOA4β、NCOA4-N 末端和NCOA4-C 末端4 個結構域，鐵蛋白僅與NCOA4α 和NCOA4-C末端結合，因為這兩個片段上存在含鐵蛋白高度特異性結合位點；W497、I489、S492、L494 和L498是NCOA4 與鐵蛋白結合的重要殘基，特別是當NCOA4 與FTH1 的結合時，I489/W497 是鐵蛋白自噬過程中不可缺少的兩個殘基；不僅如此，FTH1-R23 對于鐵蛋白與NCOA4 的結合也是至關重要的，當FTH1-R23 發生基因突變時，鐵蛋白就無法與NCOA4 結合，這說明在鐵蛋白自噬過程中，NCOA4 和FTH1-R23 是必不可少的結構［8-9］。鐵缺乏的狀態下，NCOA4 通過與鐵蛋白FTH1 亞基特異性結合，形成NCOA4-Ferrin 復合體，將鐵蛋白送入溶酶體進行降解，與自噬相關因子8（autophagy related gene，ATG8）結合后，逐步形成自噬溶酶體，使胞內Fe2+含量升高，最終介導鐵蛋白自噬并增加細胞中的鐵含量［10］；而當鐵過量時，NCOA4 與HERC2 泛素連接酶結合并通過蛋白酶體降解，但HERC2 泛素連接酶僅在胞內鐵處于高水平時才與NCOA4 結合［9］。綜上所述，鐵蛋白自噬是一個極其復雜的過程，此過程，FTH1 和NCOA4 是不可缺少的兩個關鍵物質，這些蛋白在維持細胞內環境穩定及許多生理病理過程中發揮著關鍵作用。鐵蛋白自噬具體機制如圖1。

圖1 鐵蛋白自噬機制圖Fig.1 Mechanism of ferritinophagy

3 Fe2+水平是啟動鐵蛋白自噬的關鍵環節

鐵是各種細胞生化反應所必需的微量元素，在細胞中常以Fe2+和Fe3+兩種形式存在。其中，亞鐵具有高反應性，參與各種細胞生化反應，比如氧化磷酸化、代謝物合成和氧運輸等。然而，過量的亞鐵會通過芬頓反應產生ROS，從而導致細胞毒性，引起鐵死亡；胞中多余的鐵將以非氧化還原和穩定狀態的Fe3+形式儲存在鐵蛋白中；當細胞因生化反應對Fe2+的需求增加時，鐵蛋白將發生自噬，而后Fe2+被降解釋放到細胞質中［3］。因此，鐵含量在胞內必須受到嚴格調控。鐵蛋白自噬是一種經NCOA4 介導，鐵蛋白被降解，而后釋放Fe2+的自噬過程，該過程可以增加胞內游離鐵的利用率，由此可見，鐵蛋白自噬過程不僅受細胞內Fe2+含量的調節，而且Fe2+水平是啟動鐵蛋白自噬的關鍵環節［5］。尤其是在鐵缺乏的條件下，FTH1 表面的精氨酸殘基R23 可與溶酶體上的NCOA4 結合并將其遞送至自噬體，繼而轉運至溶酶體，形成自噬溶酶體，鐵蛋白經降解后，Fe2+被釋放以補充鐵水平［11］。由此可見，大多數鐵離子都儲存在鐵蛋白中，而鐵蛋白會在需要時被溶酶體降解，并釋放游離鐵，從而啟動鐵蛋白自噬過程。

4 鐵蛋白自噬與鐵死亡的關系

多項研究發現，NCOA4 介導鐵蛋白自噬過程是細胞中可用鐵的反饋調節機制，NCOA4 的激活會增加細胞中可用鐵的含量［8，12］。這種調節不是單向的，細胞內鐵水平也會影響鐵蛋白自噬通量［7］。例如在鐵充足或急性鐵過載條件下，E3 泛素蛋白連接酶2 以泛素依賴性方式介導NCOA4 的降解，通過減少鐵蛋白吞噬通量從而平衡鐵水平［9］；在鐵缺乏的條件下，NCOA4 與E3 泛素蛋白連接酶2 結合減弱，NCOA4 蛋白酶體減少，繼而導致NCOA4 水平升高，細胞內游離鐵的含量增高，從而促進鐵蛋白自噬。另外，GRYZIK 等［13］在研究中發現，每個鐵蛋白復合物可以結合多達24 個NCOA4 分子，NCOA4 的含量高低是決定鐵蛋白自噬通量的關鍵要素，因此有研究將NCOA4 確定為鐵死亡的關鍵調節因子，當NCOA4 耗盡時可減少細胞中的游離鐵和氧化應激反應，同時增加谷胱甘肽水平［7，14］。此外，鐵蛋白自噬可介導多種細胞的鐵死亡過程。有研究［15-16］表明，過量的鐵蛋白自噬可以使神經元中產生大量的游離鐵，從而造成溶酶體中的鐵過載，從而引起溶酶體中的脂質過氧化應激，加速神經元的鐵死亡，從而引起阿爾茨海默病和帕金森病等多種神經系統疾病。有動物研究證實，在SAH 大鼠模型中，鐵蛋白自噬可降解神經元中的鐵蛋白，造成細胞內鐵穩態破壞，促進神經元鐵死亡，加重蛛網膜下腔出血后早期腦損傷［17］。此外，在腫瘤細胞中激活鐵蛋白自噬誘導Fenton 反應，胞內ROS 水平升高，進而誘導細胞鐵死亡［18-19］。上述研究提示，鐵蛋白自噬所致的鐵超載是鐵死亡的直接驅動因素。

5 鐵蛋白自噬在糖尿病及其相關并發癥發病機制中的研究進展

5.1 鐵蛋白自噬與糖尿病在糖尿病發展進程中，葡萄糖代謝與鐵代謝密切相關，當胰島素分泌不足或胰島素抵抗時血液中葡萄糖升高，在高血糖狀態下會導致鐵超負荷，引起鐵蛋白自噬，過量的鐵不僅會使胰島素發生抵抗，而且其可通過fenton 反應催化有毒的羥基自由基產生，導致ROS積聚，從而誘導氧化應激，最終誘發鐵死亡［20-21］。研究［20］發現，桑葉提取物隱綠原酸（cryptochlorogenic acid， CCA）對糖尿病模型大鼠的血糖、血鐵含量、脂質過氧化物積累及胰島損傷均有濃度依賴性改善作用，其可通過激活XC-/GPX4/NRF2 通路，抑制NCOA4活化，繼而阻止高糖誘導的胰島細胞鐵死亡，最終對糖尿病起到保護作用。高糖高脂飲食會損害小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性；相較于野生型小鼠，FTH1 基因敲除小鼠脂肪組織鐵含量明顯降低，脂肪組織中炎癥細胞因子、浸潤性巨噬細胞和氧化應激反應亦明顯減少，同時小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性得到改善，提示鐵自噬底物FTH1介導的鐵代謝紊亂可能是肥胖和糖尿病的始動因素［21］。HAMAD等［22］通過分析糖尿病患者胰島鐵代謝基因表達譜發現，糖尿病患者胰島中FTH1、FTL 表達高于非糖尿病人群，體外過表達FTH1、FTL 可誘導胰島細胞INS-1 中ROS 累積，導致胰島細胞死亡，使胰島素分泌減少。通過此研究，我們可以猜想鐵蛋白自噬導致糖尿病發生發展的機制可能為：各種原因引起的高血糖誘發FTH1、FTL 的高表達，引起鐵蛋白自噬后釋放過量的鐵，從而誘導胰島細胞INS-1中ROS累積，從而誘導氧化應激，然后誘發鐵死亡，最終導致胰島細胞死亡，使患者發生糖尿病；而糖尿病則進一步加劇了高血糖的發生，使病情進一步發展。若通過尋找有效抑制FTH1、FTL 的過表達的靶向藥物，便可間接調控鐵蛋白自噬，進而延緩DM 的發展。

5.2 鐵蛋白自噬與糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）DN 是糖尿病患者最常見的微血管并發癥，其發病率在T1D 患者、T2D 患者中約為30%和40%，早期有報道顯示，DM患者腎臟微血管的改變可引起糖尿病腎病［23］。現有證據［24］表明，鐵蛋白自噬是DN 發病機制中的關鍵環節，其可通過破壞細胞鐵穩態參與DN 的發展進程。研究［11］發現，DN 模型大鼠腎臟組織可見鐵死亡的典型特征表現，例如鐵含量增加、氧化應激及脂質過氧化等。足細胞是腎臟組織的重要固有細胞，其結構完整是維持腎小球濾過功能的前提條件。研究［25］證實，足細胞是高糖作用的主要靶細胞，高糖刺激下足細胞內ROS 累積明顯，Fe2+水平增高，而GPX4、FTH1 表達減少；銀杏葉有效成分銀杏內酯B 可通過上調GPX4、FTH1 表達，減少高糖誘導的足細胞損傷，并改善DN 模型小鼠腎臟組織病理學變化，減少腎組織鐵含量及尿白蛋白含量，這表明，在DN 中鐵死亡的發生與鐵蛋白自噬引起的鐵超負荷有關。鐵與DN 的病理生理過程有著密切的聯系，當出現鐵過載時，過多的鐵會誘發通過芬頓（Fentom）反應產生大量ROS，引發一系列氧化應激反應及激活多種細胞因子、轉錄因子和炎癥介質，引起腎小球細胞外基質沉積，最終導致腎纖維化；它還會降低機體的抗氧化能力，進一步加重腎損傷，加速DN 的發展［26］。腎小管損傷是DN 的主要病理學改變。研究［27］發現，高糖誘導下腎小管上皮細胞HK-2 增殖活性減弱，同時NCOA4 表達升高、GPX4 表達降低；無論在體內或體外，毛蕊異黃酮均對腎小管上皮細胞具有保護效應，其可通過調節NCOA4、GPX4 表達，抑制鐵蛋白自噬，減少細胞內ROS 累積及脂質過氧化反應程度，繼而改善高糖介導的腎小管上皮細胞鐵死亡。綜上所述，我們或許可以得到一個結論：在HG 環境下，會出現ROS過度積累、鐵超載、NCOA4水平升高，而GPX4、FTH1 表達減少，最后導致腎損傷，從而加速DN 的發病進展，因此當使用靶向藥物調控鐵蛋白自噬過程時，相關因子水平可得到有效緩解。雖說諸多研究顯示，鐵蛋白自噬在DN 的發病機制中起重要作用，但相關靶向藥物作用于鐵蛋白自噬中的某條信號通路或者某個相關因子的機制卻未有詳盡的闡明，這也為未來探尋鐵蛋白自噬在DN 的發病機制中的作用提供了一個全新的思路。

5.3 鐵蛋白自噬與糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy， DCM）DCM 是糖尿病的嚴重并發癥和死亡原因，可導致12%的糖尿病患者出現心力衰竭和死亡。有研究證實，經鐵蛋白自噬所激活的鐵死亡與DCM 心肌細胞損傷密切相關，動物研究顯示，造模12 周后DCM 模型小鼠心功能障礙明顯，主要表現為心肌組織纖維化、心臟泵血功能減弱，同時心肌細胞出現大量鐵死亡，ROS累積、內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）加劇；亞精胺可調控ERK1/2 信號通路，抑制NCOA4 介導的鐵蛋白自噬，減少心肌細胞脂質過氧化和鐵死亡，逆轉高糖介導的心肌損傷過程［28-29］，這說明通過調控ERK1/2 信號通路可對心肌細胞產生保護作用，阻止細胞發生鐵蛋白自噬。在另外一項研究［29］中發現，相較于正常對照組，DM 模型大鼠血糖明顯升高，心肌組織FTH1、NCOA4、LC3-Ⅱ表達及鐵含量上調；去鐵胺處理1 周后可降低糖尿病大鼠血糖及心肌損傷標志物cTnI 水平，抑制心肌組織NCOA4 表達，進而改善心肌細胞損傷。以上實驗研究均表明在HG 的刺激下，心肌細胞的均會受到不同程度的損傷，并伴隨著鐵蛋白自噬相關因子水平的升高，但經相關藥物調控后，可使鐵蛋白的選擇性貨物轉運體NCOA4 表達受到抑制，最終抑制鐵蛋白自噬降解，使心肌細胞受到保護。那么尋找更多的靶向藥物來調控鐵蛋白自噬，進而達到細胞保護作用，延緩DCM 的病程變得越來越重要。

5.4 鐵蛋白自噬與糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer， DFU）DFU 是一種難治性慢性創傷，約有19% ～ 34%的糖尿病患者會發生DFU，其病死率高達40%，嚴重的感染發作及截肢是導致DFU患者死亡的主要原因，隨著DM 患病率的增加以及社會人口老齡化等多因素的影響下，DFU的患病率也在逐漸升高［30-31］。在高糖誘導的糖尿病小鼠模型中發現，糖尿病傷口組織中的鐵蛋白表達明顯上調，NCOA4 的蛋白質表達顯著降低，FTH1 mRNA 表達也降低，這表明可以通過調節NCOA4 的表達來改變衰老細胞中的細胞內鐵蛋白和鐵離子，繼而減少鐵蛋白自噬過程，促進傷口的愈合［32］。此外，有研究［33］證實芍藥苷具有減輕氧化應激，增加細胞增殖，減少細胞凋亡以及增加VEGF 和TGF-β1 的表達的作用，其可通過激活Nrf2 途徑來加速DFU患者傷口愈合的能力。上述研究說明鐵蛋白自噬過程與DFU密切相關，深入探尋鐵蛋白自噬在DFU發病機制中的作用，可為DFU 的靶向治療提供新思路。

5.5 鐵蛋白自噬與糖尿病性腦血管病（diabetic encephalopathy， DE）DE 是DM 中樞神經系統并發癥之一，DE 被定義為DM 引起的認知障礙和大腦神經生理或結構改變，它與中樞神經系統的退化和功能障礙密切相關，DE 主要表現為學習和記憶障礙，最終可能導致癡呆；目前DE 的發病機制尚未完全闡明，但DE 與腦血管異常、氧化應激和胰島素異常有關已得到證實［34］。有研究［35］顯示，DM 患者的長期高血糖刺激可能會導致腦毛細血管異常，并改變血腦屏障的腦內皮細胞功能，這些微血管變化可能會引起慢性或隱性腦缺血，導致認知能力下降；另外HG 影響下，腦組織通過多元醇和己糖胺途徑增加對葡萄糖的吸收、使ROS 水平失衡以及產生高級糖基化蛋白，從而導致認知障礙，促進DE 的進展。帕金森病（PD）是一種進行性神經系統疾病，其神經病理學特征是易損腦區的多巴胺能神經元丟失，尤其是黑質上的神經元；當鐵離子發生超負荷時，可誘發多巴胺能神經元的毒性，并促進α-突出核蛋白聚集，從而引發以NCOA4 介導的鐵蛋白自噬降解，釋放過量的鐵離子，最終導致細胞鐵死亡；動物研究顯示，通過抑制PD 小鼠模型NCOA4 的表達，可降低鐵蛋白自噬的降解，減少細胞內鐵含量的增加，脂質ROS也隨之減少，最終防止細胞鐵死亡，該研究［15］表明鐵蛋白自噬所引發的鐵死亡與多巴胺能神經元的神經毒性有關，通過抑制細胞鐵蛋白自噬可有效防止細胞發生鐵死亡，這可能是未來防止PD 的新策略。

5.6 鐵蛋白自噬與糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）隨著糖尿病的發生率在世界范圍內越來越高，DR 也隨即成為了DM 最常見和最嚴重的眼部并發癥［23］，是糖尿病患者視力障礙和失明的主要原因，大約有75%的DR 患者出現不可逆的視力喪失［36］。DR 發病過程中有著諸多病理變化，但其早期主要以血管細胞丟失、血管滲漏以及血-視網膜屏障（blood-retinal barrier， BRB）遭到破壞為病理特征，而越來越多的研究［36］顯示，氧化應激以及炎癥在DR 的發生發展中起著重大作用。例如，在一項以人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19 建立DR 模型的研究表明，在DR 和氧化應激期間，會發生線粒體應激和損傷，這些應激和損傷需通過線粒體自噬消除，而新線粒體的生物合成需要鐵蛋白自噬參與；而通過人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19 建立的模型發現，HG 導致受損的線粒體通過線粒體自噬流向溶酶體，同時激活鐵蛋白自噬并釋放Fe2+，游離的Fe2+與H2O2通過芬頓反應通過產生過量的ROS，攻擊膜脂質，從而破壞BRB 的膜完整性并導致血管滲漏［37］。這表明在HG 和DR 的雙重條件下，會出現線粒體損傷及其功能障礙，與此同時觸發鐵蛋白自噬，導致ROS 和Fe2+的過度累積，從而加重DR 視網膜的損傷，最終加速了DR 的病程進展，這明確了鐵蛋白自噬參與DR 的發生發展的事實，但其參與DR 的具體機制未得到進一步明確。這也為未來尋找防治DR 的靶向藥物提供了一個思路，比如探索鐵蛋白自噬參與DR 的某條具體信號通路或某個特定信號靶標，從而尋找通過調控鐵蛋白自噬的信號通路或相關因子的藥物來延緩DR 的病程。另外，有研究［38］表明，Ferritinophagy 作為鐵死亡的關鍵調節過程，其在DR 的發病機制中發揮著重要作用，并且該研究通過采用GSE146615 數據集鑒定出了8 個潛在的鐵蛋白自噬相關差異表達基因，即HERC2、ATG16L1、WDR45、BCAT2、FBXW7、BECN1、TNF 和ATG7，其結果證實BECN1 是DR 中鐵蛋白自噬的潛在靶標并推測ATG7 和BCAT2 也參與DR 的鐵蛋白自噬過程。由此研究我們可得知，雖然已知多個鐵蛋白自噬相關差異表達基因參與了DR 的病程進展，但這些基因參與DR 的具體機制及作用尚未得到近一步驗證，因此還需要更多的相關研究來闡明這些相關基因在DR 中的作用。

5.7 鐵蛋白自噬與糖尿病自主神經病變（diabetic autonomic neuropathy， DAN）DAN是DM患者的一種嚴重且常見的并發癥，但它是DM 中最不為人知并了解的并發癥之一，DAN 是DM 伴發的周圍性多發性神經病的一種亞型，可累及整個自主神經系統（ANS），它表現為一個或多個器官系統，例如心血管系統、胃腸道系統、泌尿生殖系統、泌尿生殖系統及出汗異常等，DAN 的臨床癥狀通常要等到DM 發作后很長時間才會出現。有研究［39］顯示，在DAN中以心臟自主神經系統病變（diabetic cardiovascular autonomic neuropathy， DCAN）危害最大，DCAN 會引起無痛性心機梗死，甚至死亡。HG被認為是引發CAN的罪魁禍首，HG 導致線粒體功能發生障礙，ROS 形成，并誘導DNA 損傷，經過一系列途徑，最終引起腺嘌呤核苷三磷酸耗竭、自主神經脫髓鞘和神經元死亡，最終出現典型的CAN；不僅如此，HG 還會干擾神經元的再生，活性氧增加可能通過抑制自主神經節突觸的傳遞，增加致命性心律失常及心梗后猝死的風險［40］。目前針對鐵蛋白自噬在DAN 的發病機制中的作用研究鮮少，針對鐵蛋白自噬通路防治DAN 的靶向藥物還尚未完全開發，對此，以鐵蛋白自噬為出發點，尋找防治DAN的藥物或是一個有望探尋的視角。

6 總結

糖尿病及其相關并發癥的發病機制復雜，臨床上尚無有效的防治手段，已成為重大的公共衛生問題。大量證據表明，鐵蛋白自噬與糖尿病及其相關并發癥密切相關，但目前針對鐵蛋白自噬的調控機制、信號網絡及對疾病影響的研究尚處于起步階段，未來仍需進一步探索鐵蛋白自噬的分子生物學機制及信號調控網絡，以期為糖尿病及其相關并發癥的靶向治療提供新思路和新方向。