腎透明細胞癌患者血清miR-21及miR-27b與預后的關系

陳爽 楊娜 黃禹棟 孔祥豐 李錦濤 唐以眾 馬克雄 張陽陽 張院冬 任承德

青海大學附屬醫院泌尿外科 （西寧 810000）

腎細胞癌是常見的泌尿生殖系統癌癥，死亡率超過30%，根據組織學和分子亞型，透明細胞癌在腎細胞癌中的發病率最高且預后生存較差，嚴重威脅患者的生命安全［1-2］。近些年，隨著細胞減滅性腎切除術及各類生物靶向制劑的快速發展，腎透明細胞癌的治療選擇范圍越來越廣，抗腫瘤效果不斷提升，但現階段死亡率仍居較高水平，因此篩查腎透明細胞癌病理相關生物學因子并及時評估病理進展及預后的關系，更有利于進一步完善腎透明細胞癌的臨床診療方案，進而改善患者預后［3-4］。微小RNA（mircoRNA，miR）是廣泛存在于病毒、人類等各類生物中的非編碼調控基因，可與對應靶細胞的mRNA 結合并阻斷蛋白編碼基因合成，從而調控細胞增殖、分化、代謝、凋亡等生物學過程［5-6］。miR-21、miR-27b 均是癌癥相關基因，目前miR-21 在結腸癌、食管癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中的病理機制已被證實［7-9］；楊旺盛等［10］、宋殿芳等［11］在研究后分別報道了miR-27b 基因在肺癌、宮頸癌中的抑癌作用；趙碩等［12］研究發現miR-27b 在腎癌患者的血清中表達量更高。然而miR-21 和miR-27b 基因表達與腎透明細胞癌病理進展、預后的相關性尚待證實。本研究篩選我院收治的118 例腎透明細胞癌患者進行前瞻性研究，初步淺析miR-21和miR-27b基因表達與腎透明細胞癌預后的相關性，為后續臨床實踐制定個體化治療策略、監測治療反應及評估預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料篩選2019 年2 月至2021 年4 月青海大學附屬醫院收治的118 例腎透明細胞癌患者作為研究對象，其中女48 例，男70 例；年齡35 ～67 歲，平均（49.15 ± 4.02）歲；Fuhrman 分級：Ⅰ級36 例、Ⅱ級41 例、Ⅲ級41 例；病理分期Ⅰ期18 例、Ⅱ期30 例、Ⅲ期58 例、Ⅳ期12 例；腫瘤最大徑2.51 ～ 11.04 cm，平均（5.03 ± 1.16）cm；淋巴結轉移60 例，未轉移58 例；其中病理分期Ⅰ期、Ⅱ期48 例患者均行細胞減滅性腎切除術切除腫瘤病灶。納入標準：（1）符合《腎細胞癌指南》［13］中腎透明細胞癌的臨床診斷，經手術或病理穿刺活檢確診；（2）年齡＞ 18 歲；（3）Fuhrman 分級Ⅰ-Ⅲ級；（4）病理分期Ⅰ-Ⅳ期；（5）Karnofsky 功能評分＞ 60 分；（6）患者簽訂知情同意書。排除標準：（1）合并其他腫瘤；（2）非原發病灶；（3）合并全身嚴重感染或多器官衰竭；（4）免疫功能缺陷；（5）腎結石；（6）妊娠、哺乳期女性；（7）精神病。另選取院內同期健康體檢患者118 例作為對照組，女50 例，男68 例；年齡39 ～ 65 歲，平均（49.03 ± 3.97）歲，年齡、性別與腎透明細胞癌組患者比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。該研究通過院內醫學倫理會審核。

1.2 血清miR-21 及miR-27b 檢測方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）法［14］檢測所有受試者血清miR-21 及miR-27b 表達：患者入組24 h內（術前），采集受試者肘靜脈血2 ～ 4 mL，加入離心機3 000 r/min 高速離心12 min 后（離心半徑R = 13.5 cm），吸取上清液，待檢。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）提取總RNA，使用Hifair?V Reverse Transcriptase 逆轉錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）逆轉錄后行PCR 擴增。PCR 儀選用寰熙醫療器械有限公司ViiA 7 Dx 定量熒光PCR擴增儀。以CT 值為基礎，2-△△CT法計算miR-21 及miR-27b 表達水平。miR-21 及miR-27b 以U6（正向引物：5′-CTAGCTAGATGACCTCTGCTGAC-3′， 反向引物：5′-TCAGCTATCACTGTGTATGCTCA-3′）作為內參對照，miR-21 正向引物序列：5′-CACATCACACCGTATGCAGTGAG-3′，反向引物：5′-CACTATGTCTCGTCACGTCGATC-3′；miR-27b 正向引物序列：5′-TGCATCGATTCCGATGATGCCAG-3′，反向引物：5′-GTCACTTACTGATGCTATCCGTA-3′。

1.3 評估指標（1）血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細胞癌患者及健康對照中的表達；（2）不同病理分期、Fuhrman 分級腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達及相關性；（3）血清miR-21及miR-27b 表達與腎透明細胞癌患者生存預后分析。

1.4 統計學方法采用SPSS 軟件v.19 進行統計學分析，以（±s）表示正態分布的計量資料，采用t檢驗。重復測量資料比較采用重復測量方差分析，差異有統計學意義則進行兩兩比較，采用SNK-q檢驗。計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。采用Spearman 相關性分析法分析血清miR-21及miR-27b 表達水平與病理分期、Fuhrman 分級的相關性。Kaplan-Meier 分析與對數秩檢驗用于生存分析，行Log-rank χ2檢驗。P＜ 0.05 提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細胞癌患者及健康對照中的表達腎透明細胞癌組患者的血清miR-21 及miR-27b 表達量均高于健康對照組（P＜ 0.05）。見表1。

表1 血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細胞癌患者及健康對照中的表達分析Tab.1 Expression analysis of serum miR-21 and miR-27b in renal clear cell carcinoma patients and healthy controls x ±s

2.2 不同病理分期腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達及相關性

2.2.1 不同病理分期腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達Ⅲ期患者的血清miR-21表達量高于Ⅰ期（P＜ 0.05），Ⅳ期患者的血清miR-21 表達量高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期（P＜ 0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的血清miR-27b 表達量逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同病理分期腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達分析Tab.2 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different pathological stages±s

表2 不同病理分期腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達分析Tab.2 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different pathological stages±s

注：與Ⅰ期比較，aP ＜ 0.05；與Ⅱ期比較，bP ＜ 0.05；與Ⅲ期比較，cP ＜ 0.05

血清miR-27b相對表達量2.31 ± 0.36 2.89 ± 0.39a 3.11 ± 0.41ab 5.32 ± 0.59abc 135.345 0.001病理分期Ⅰ期（n = 18）Ⅱ期（n = 30）Ⅲ期（n = 58）Ⅳ期（n = 12）F值P值血清miR-21相對表達量7.09 ± 1.31 7.81 ± 1.69 8.49 ± 1.46a 12.06 ± 2.91abc 23.502 0.001

2.2.2 病理分期與血清miR-21 及miR-27b 表達的相關性病理分期與血清miR-21 及miR-27b 表達均呈正相關（r= 0.546、0.684，P＜ 0.001）。

2.3 不同Fuhrman 分級腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達及相關性

2.3.1 不同Fuhrman 分級腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達Fuhrman 分級Ⅰ、Ⅱ級、Ⅲ級患者的血清miR-21、miR-27b 表達量逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 不同Fuhrman 分級腎透明細胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表達分析Tab.3 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different Fuhrman grades±s

表3 不同Fuhrman 分級腎透明細胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表達分析Tab.3 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different Fuhrman grades±s

注：與Ⅰ級比較，aP ＜ 0.05；與Ⅱ級比較，bP ＜ 0.05

Fuhrman分級Ⅰ級（n = 36）Ⅱ級（n = 41）Ⅲ級（n = 41）F值P值血清miR-27b相對表達量2.64 ± 0.38 2.97 ± 0.37a 3.81 ± 0.46ab 81.198 0.001血清miR-21相對表達量7.31 ± 1.38 7.74 ± 1.50a 10.39 ± 2.51ab 31.098 0.001

2.3.2 Fuhrman 分級與血清miR-21 及miR-27b表達的相關性Fuhrman 分級與血清miR-21 及miR-27b 表達均呈正相關（r= 0.550、0.769，P＜0.001）。

2.4 血清miR-21 及miR-27b 表達與腎透明細胞癌患者生存預后分析根據患者的血清miR-21 及miR-27b 中位表達分為miR-21 高表達組（n= 59）和低表達組（n= 59），miR-27b 高表達組（n= 59）和低表達組（n= 59）。隨訪結束均未失訪，隨訪時間6 ～ 24 個月，中位隨訪時間為18 個月，miR-21 高表達組死亡13 例，低表達組死亡4 例，兩組生存曲線比較差異有統計學意義（Log-rank χ2= 5.926，P= 0.015）；miR-27b 高表達組死亡12 例，低表達組死亡5 例，兩組生存曲線比較差異有統計學意義（Log-rank χ2= 3.695，P= 0.045）。見圖1-2。

圖1 血清miR-21 表達與腎透明細胞癌患者生存預后分析Fig.1 Analysis of serum miR-21 expression and survival prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

圖2 血清miR-27b 表達與腎透明細胞癌患者生存預后分析Fig.2 Analysis of serum miR-27b expression and survival prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

3 討論

腎透明細胞癌是腎細胞癌中最普遍和最具侵襲性的亞型，約占所有腎細胞癌的70%，臨床上大約1/3 的腎透明細胞癌患者在初次診斷時已出現轉移，而四分之一的局部疾病患者在根治性手術切除后會同樣出現復發性轉移，且轉移后腎透明細胞癌的發生總是與高死亡率密切相關［15-17］。此外盡管抗血管生成治療和免疫療法顯著改善了腎透明細胞癌轉移患者的預后，但許多患者不可避免地會產生耐藥性，因而導致治療失敗，生存預后較差［18］。因此，鑒于腎透明細胞癌的高發病率和死亡率，篩選高敏性生物學指標評估患者病理預后，進而嘗試調整臨床治療干預方案，成為近些年腎透明細胞癌研究中的重要方向之一。

miR 作為內源基因編碼的單鏈RNA 分子，具有阻斷蛋白編碼基因、調節缺氧和血管生成的功能，與腫瘤細胞增殖及血管新生關聯密切［19］，且近幾年國內研究中針對各類miR 及其上下游特定基因在消化道腫瘤、呼吸道腫瘤、泌尿系統腫瘤等領域的研究逐漸增多，針對miR 的水平檢測已然相對成熟。筆者以此為切入點，選取現階段研究中已證實在多種實體瘤中表達異常的癌癥因子miR-21 及miR-27b，分析并嘗試建立其與腎透明細胞癌的關聯性，為臨床實踐中腎透明細胞癌的診療及預后評估提供指導。本研究結果顯示，腎透明細胞癌組患者的血清miR-21 及miR-27b 表達量均高于健康對照組，提示血清miR-21 及miR-27b 在腎透明細胞癌中出現高表達，可能在腎透明細胞癌中發揮促癌作用。WOLF 等［20］在針對腎透明細胞癌的建模及治療的研究中提出，腎透明細胞癌的特征是控制缺氧信號通路發生基因突變，導致代謝失調、血管生成增強、瘤內異質性和有害的腫瘤微環境串擾，特定基因表達的抑制或激活可能有助于攻克長期治療失敗的障礙，進而提高腎透明細胞癌患者的生存率。YAO 等［21］研究表明miR-27b 可通過抑制PPARγ 基因通路，加重缺氧誘導的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能障礙。此外，SITU 等［22］在一項關于血管內皮生長因子與腎細胞癌的表達、預后、基因調控網絡及調控靶點的研究中提出，腎細胞癌中相關靶標miR-21 的表達與腫瘤血管生成增強有關，且與CD8+T 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及中性粒細胞的免疫細胞的浸潤有關。因此，本研究分析，腎透明細胞癌患者的病理進展與miR-21 及miR-27b 表達量升高有關，與miR-27b 介導的下丘腦-垂體-腎上腺軸信號通路與miR-21 調節的腫瘤血管生成有關。

本研究預后生存分析得出，不同血清miR-21及miR-27b 水平的腎透明細胞癌患者的生存預后差異顯著，可以看出血清miR-21 及miR-27b 表達量越高則總生存預后期越短，研究分析可能與血清miR-21 及miR-27b 表達促進腎透明細胞癌的增殖、遷移有關。MEN 等［23］在對磷酸賴氨酸磷酸組氨酸無機焦磷酸磷酸酶基因靶向共表達microRNA 在RCC 機制中的探究中發現，miR-21 可促進腎細胞癌增殖、上皮-間質轉化、侵襲，且可能是腎透明細胞癌患者的獨立預后生物學標志物。PUE 等［24］在分析舒尼替尼治療腎透明細胞患者的治療反應性及生存預后的報告中顯示，miR-27b 表達在長期緩解者與原發性難治性患者中差異顯著。因此通過對腎透明細胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 的研究，有助于進一步指導后續microRNA 的臨床抗腫瘤治療及評估預后。病理分期和Fuhrman 分級分別作為評估腎透明細胞癌病理進展及預后的客觀指標，對提示患者的病情嚴重程度及預后具有重要的參考價值。本研究進一步對不同病理分期及Fuhrman 分級的腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達進行比較，結果發現隨著病理分期及Fuhrman 分級的升高，患者的血清miR-21 及miR-27b 水平整體上呈升高趨勢，且表現出統計學差異，研究分析腎透明細胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表達可提示患者的病情進展及預后生存狀況，但具體病理機制仍需后續研究中不斷完善證實。

綜上所述，腎透明細胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表達水平可反映患者的病情進展及預后生存情況。但本研究為單中心樣本對照研究，納入樣本量有限，且對miR-21、miR-27b 與腎透明細胞癌病理進展的機制分析尚待深入，且后續研究中仍需完善多中心、大樣本隨機對照組研究，進一步證實本研究結論。