m6A修飾調控酶及其結合蛋白在細胞自噬中作用的研究進展*

陳思琪， 郭帥杰， 周明學

（首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京市中醫藥研究所，北京 100010）

自噬可消除細胞內錯誤折疊或聚集的蛋白質、清除受損的細胞器以及降解不必要的細胞成分，對于維持細胞功能和新陳代謝十分重要[1］。自噬水平的異常在癌癥、心血管、呼吸系統和神經退行性病變等疾病的發病機制中起到重要作用[2］。在過去幾十年，對自噬的研究主要集中在自噬的調控機制及自噬基因的生物學功能[3-4］。近年來研究表明，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine， m6A） RNA 甲基化作為真核生物中最普遍和最保守的轉錄后RNA 修飾，可通過介導多種自噬相關基因的轉錄和轉錄后調控，從而影響多種疾病的進展[5］。m6A 修飾過程是動態且可逆的，其調控主要依賴于m6A甲基轉移酶、m6A去甲基化酶和m6A 結合蛋白[6］。為此，本綜述主要對m6A 修飾調控酶及其結合蛋白調控自噬的研究進展進行文獻梳理和總結分析，以期對相關領域研究者提供參考。

1 m6A修飾簡介

表觀遺傳學是研究非核苷酸序列改變的情況下，基因表達可遺傳變化的一門遺傳學學科。RNA甲基化修飾是轉錄后水平的表觀遺傳調控方式的一種，m6A 修飾是其中具有代表性的。m6A 修飾指腺嘌呤堿基（A）的第6 位氮原子發生甲基化，存在于幾乎所有類型的RNA 中，是真核生物中最豐富的RNA 甲基化修飾。此外，甲基化修飾可通過影響RNA 的剪接、輸出、亞細胞定位、翻譯、穩定性和衰變來調節真核轉錄組[7］。

2 m6A 修飾調控酶及其結合蛋白在細胞自噬中的作用

2.1 m6A 甲基轉移酶對自噬的調節作用 甲基轉移酶包括甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase-like protein 3， METTL3）、METTL14、Wilms 瘤蛋白1 相關蛋 白（Wilms tumor 1-associated protein， WTAP）、KIAA1429 等，主要作用是催化mRNA 上的堿基發生m6A 修飾[6］。METTL3 是具有催化活性的亞基，含有S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine， SAM）結合結構域，該結構域可將甲基從m6A-甲基化底物轉移到腺苷的第6 位氮原子[8］。METTL3 和METTL14 形成穩定的異二聚體復合物，而WTAP 與異二聚體復合物相互作用，確保其位于富含剪接因子的核斑點中并觸發催化活性[9］。總之，這些蛋白并不是各自孤立的，而是會形成復合物共同行使催化功能。

2.1.1 METTL3 METTL3作為m6A 甲基轉移酶，直接參與調節m6A 水平的改變[10］。在非小細胞肺癌細胞中，METTL3通過促進自噬途徑的關鍵蛋白自噬相關蛋白5（autophagy-related protein 5， ATG5）和ATG7的表達來增強自噬[11］。同樣的，在人主動脈平滑肌細胞中，通過慢病毒轉染過表達METTL3可增強ATG5和ATG7的蛋白表達，促進自噬體形成，從而抑制細胞的增殖、遷移和從收縮表型向合成表型的轉換[12］。但是，在成纖維細胞樣滑膜細胞中，隨著骨關節炎的進展，由METTL3 介導的m6A 修飾水平上升，ATG7 的表達水平卻降低，從而抑制自噬的發生[13］。在小鼠胚胎成纖維細胞中，METTL3的下調減弱了m6A修飾水平，從而抑制了YT521-B同源結構域家族蛋白3（YT521-B homology domain family protein 3，YTHDF3）招募真核起始因子3A（eukaryotic initiation factor 3A， eIF3A）和eIF4B 來促進叉頭框蛋白O3（forkhead box protein O3， FOXO3）翻譯介導的自噬流[14］。在肺泡上皮細胞中，激活METTL3 介導的NAD 依賴性組蛋白脫乙酰酶sirtuin 1 （Sirt1） mRNA的甲基化，促進了Sirt1 mRNA 的穩定性，降低了Sirt1蛋白表達水平，進而導致自噬通量受損[15］。在非酒精脂肪性肝病小鼠模型中，METTL3介導的m6A 甲基化修飾通過靶向Rubicon（RUN domain beclin-1 interacting and cysteine-rich containing protein） mRNA，調節Rubicon 的蛋白表達水平，從而參與調節肝臟自噬和脂質代謝[16］。在缺氧/復氧誘導的心肌細胞中，METTL3過表達可以催化轉錄因子EB（transcription factor EB， TFEB） mRNA在3'端的殘基處發生m6A修飾，降低了TFEB 的蛋白表達水平，從而抑制自噬通量[17］。綜上所述，METTL3 可通過介導m6A 修飾，調節自噬相關蛋白的表達水平，從而影響自噬。

2.1.2 METTL14 METTL14 是m6A 甲基轉移酶復合體的另一亞基，含有催化m6A 形成的SAM 結合位點，METTL14 與METTL3 可結合形成異二聚體，從而增強催化m6A 生成的能力[18］。在用人絨毛膜促性腺激素刺激的睪丸間質細胞（Leydig cells， LCs）中，METTL14表達降低引起的m6A 修飾水平下降可影響Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1A（protein phosphatase Mg2+/Mn2+dependent 1A， PPM1A）轉錄本的穩定性和翻譯效率，降低鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶激酶2（calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2， CAMKK2）的蛋白表達，進而增強自噬水平，促進LCs從睪丸間質干細胞分化為成熟睪丸間質細胞，從而減少睪酮的合成[19］。骨髓間充質干細胞產生新的成骨細胞缺陷是骨質疏松癥發展的一個重要病理過程，在骨髓間充質干細胞中，METTL14對破骨細胞分化具有負調控作用，METTL14過表達可通過調節beclin-1 表達從而誘導自噬水平的上升[20］。在口腔鱗狀細胞癌細胞中，自噬被激活時，METTL14 表達上調，并影響細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能是通過METTL14 降低eIF4G1 mRNA 穩定性來實現的[21］。上述研究表明，METTL14 介導的m6A 修飾可調控自噬水平，并與疾病進展密切聯系。

2.1.3 WTAP WTAP 與METTL3 和METTL14 形成蛋白復合物，其缺失會導致甲基轉移酶復合物的RNA 結合能力降低[22］。WTAP 調節自噬的報道還尚少。在肝癌細胞中，WTAP 蛋白表達水平降低可激活自噬，通過降低肝激酶B1（liver kinase B1， LKB1）mRNA 的m6A 修飾水平，導致LKB1 穩定性增加而促進其表達，降低了下游AMPK 的磷酸化水平，從而上調自噬水平并抑制細胞增殖[23］。在人結腸癌細胞中，WTAP 的表達水平升高，其潛在的下游靶點是細絲蛋白A（filamin A， FLNA）。WTAP 通過調節FLNA mRNA 3'端非翻譯區的m6A 修飾來抑制FLNA 的表達；沉默WTAP基因對自噬的抑制可被沉默FLNA基因逆轉，因而WTAP 通過m6A 依賴性調節FLNA mRNA 的穩定性來阻礙自噬[24］。上述研究表明，WTAP 介導的m6A 修飾主要通過調控自噬上游信號蛋白發揮調節自噬的作用。

m6A 甲基轉移酶自噬調節作用及其機制的總結見表1。

表1 m6A甲基轉移酶對自噬的調節作用及其分子機制Table 1. Regulatory effects of m6A methyltransferases on autophagy and their molecular mechanisms

2.2 m6A 去甲基化酶對自噬的調節作用 在真核生物中，m6A 去甲基化酶主要包括脂肪量及肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein， FTO）和ALKB 同源物5（ALKB homolog 5， ALKBH5）等。FTO 和ALKBH5 的主要作用是對已發生m6A 修飾的堿基進行去甲基化，這兩種去甲基化酶的發現表明了m6A修飾是一個動態和可逆的過程[25］。

2.2.1 FTO FTO 是首個被證實的m6A 去甲基化酶，是非血紅素Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依賴的ALKB 家族雙加氧酶的同源物，可以催化RNA 去甲基化，在轉錄后發揮功能[26］。FTO 蛋白部分定位于核斑點，核RNA 分子上的m6A 是FTO 的生理底物[27］。FTO 在核心結構域上與ALKB 蛋白家族相似，但是C段獨有的長loop結構使得FTO可以對發生甲基化的RNA進行去甲基化修飾[28］。在最近的一項研究中，FTO基因沉默后的脂肪細胞中ATG5 和ATG7 mRNA 的m6A修飾水平上升，從而激活YTHDF2 介導的mRNA 衰變，導致蛋白表達降低，最終抑制了自噬和脂肪生成[29］。而另一項研究顯示，在腎透明細胞癌細胞中，抑制FTO基因表達可靶向ATG5 和ATG7 而增強自噬流，其發揮作用的中間環節為FTO 通過m6A-胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白2（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2， IGF2BP2）依賴性途徑降低了鹽誘導激酶2（salt-inducible kinase 2， SIK2）mRNA 的穩定性[30］。在角質細胞中，慢性低水平砷暴露抑制了自噬水平，促進FTO 蛋白的穩定性，從而上調了FTO 的表達水平并降低了m6A 修飾水平，這是誘導惡性轉化和腫瘤發生的重要條件[31］。在人髓系白血病細胞中，腫瘤蛋白p53 誘導型核蛋白2（tumor protein p53-inducible nuclear protein 2，TP53INP2）通過FTO 介導的m6A 修飾上調并通過核磷蛋白1（nucleophosmin 1， NPM1）易位到細胞質中，在細胞質內TP53INP2 通過LC3-ATG7 的相互作用增強了自噬活性，并進一步促進白血病細胞的存活[32］。上述研究表明，FTO 作為m6A 去甲基化酶，在疾病中發揮重要作用，并可通過調節自噬相關蛋白發揮調控自噬水平的效應。

2.2.2 ALKBH5 ALKBH5 是ALKB 家族中第二個被發現具有m6A 去甲基化酶活性的成員。ALKBH5定位在細胞核內亞細胞器核小斑，可通過對m6A 去甲基化來調控mRNA 的出核和代謝，且ALKBH5 在精子細胞中表達最多[33］。ALKBH5 對細胞增殖、侵襲、轉移等生物過程都有影響[34］。在缺血/再灌注心肌細胞中，ALKBH5過表達可逆轉METTL3 抑制自噬的作用，并且ALKBH5 受TFEB 的反向調節，可以與其啟動子結合從而激活轉錄[17］。人絨毛膜促性腺激素刺激的LCs 激活了自噬導致睪酮的合成減少與ALKBH5 的上調有關，并且依賴轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白ε（CCAAT/enhancer-binding protein epsilon， CEBPE）和TFEB 與其基因啟動子的結合而增強[19］。在上皮性卵巢癌中，ALKBH5 的表達上升降低了自噬水平，可能是通過激活mTOR 信號通路和促進Bcl-2 和beclin-1 的相互作用來發揮抑制自噬的功能[35］。在壓力誘導的髓核細胞中，ALKBH5 水平的下調導致FAK 家族激酶200 kD 相互作用蛋白（FAK family kinase 200 kD interacting protein， FIP200）mRNA 的甲基化水平上升，從而減弱自噬，最后致使細胞凋亡[36］。上述研究表明，ALKBH5介導的m6A修飾可調控自噬水平的改變，并且TFEB 的轉錄調節很可能是其中的關鍵環節。

m6A 去甲基化酶自噬調節作用及其機制的總結見表2。

表2 m6A去甲基化酶對自噬的調控作用及其分子機制Table 2. Regulatory effects of m6A demethylases on autophagy and their molecular mechanisms

2.3 m6A 結合蛋白對自噬的調節作用 m6A 結合蛋白可識別并結合到m6A 位點，結合蛋白的有效識別可以調控mRNA 加工和代謝功能。RNA pull-down實驗已經鑒定了多種閱讀蛋白，包括YTH 結構域的蛋白、核不均一核糖核蛋白、真核起始因子等。這些結合蛋白的功能主要包括特異性結合m6A 甲基化區域，削弱與RNA 結合蛋白同源結合以及改變RNA 二級結構從而改變蛋白與RNA的互作[37］。

2.3.1 YTHDF1 YTHDF1 可通過與翻譯起始因子相互作用和促進核糖體負載從而提高mRNA 的翻譯效率作用[37］。YTHDF1 可通過與m6A 修飾的ATG2A和ATG14 mRNA 結 合，促 進ATG2A 和ATG14 的 翻譯，從而促進自噬，加重肝細胞癌的進展[38］。在非酒精脂肪性肝病小鼠模型中，雖然METTL3 直接與Rubicon mRNA 結合并介導m6A 修飾，從而抑制自噬的作用，但是YTHDF1 在其中扮演著與Rubicon mRNA相互作用并促進其穩定性關鍵的作用[16］。在肝纖維化的發生發展中，YTHDF1 通過識別beclin-1 編碼區內的m6A 結合位點來促進beclin-1 mRNA 的穩定性，從而激活自噬[39］。并且已有研究指出，雙氫青蒿素可以靶向這一途徑而緩解肝纖維化[40］。上述研究表明，YTHDF1 可通過調節自噬相關基因的翻譯與穩定性來影響自噬水平。

2.3.2 YTHDF2 相較于YTHDF1，YTHDF2 對m6A有更強的結合能力，可以通過識別m6A 使所在的mRNA和非編碼RNA降解[41］。在脂肪細胞FTO基因沉默后，具有較高m6A 水平的ATG5 和ATG7 轉錄物被YTHDF2 捕獲，這導致mRNA 降解和蛋白表達減少，從而減少自噬和脂肪生成[29］。抑制谷氨酰胺代謝會導致自噬的激活，減弱了抗腫瘤作用。在一項研究中，抑制結直腸癌細胞谷氨酰胺代謝通過減弱m6A 修飾和YTHDF2 介導的mRNA 衰變來促進轉錄激活因子4（activating transcription factor 4， ATF4）mRNA 的表達，進而導致ATF4 誘導的自噬增強[42］。上述研究表明，YTHDF2 通過與自噬相關基因的結合并影響mRNA的降解而實現調控自噬的作用。

2.3.3 YTHDF3 YTHDF3 可調節mRNA 的翻譯和降解[43］。在饑餓誘導的自噬中，YTHDF3 通過識別FOXO3 mRNA 終止密碼子周圍的m6A 修飾位點并招募eIF3A 和eIF4B，從而促進FOXO3的蛋白翻譯。大量翻譯產生的FOXO3 蛋白隨后進入細胞核，促進一系列目的基因的轉錄，從而促進自噬[14］。上述研究表明，YTHDF3 可通過影響自噬相關基因的翻譯來調節自噬水平。然而，對YTHDF3 調控自噬的相關研究目前還較少。

2.3.4 YTHDC1 YTHDC1 可促進RNA 的剪切和翻譯[44］。在高糖刺激的角質細胞中，YTHDC1 的下調驅動了細胞核中泛素結合蛋白p62 mRNA的降解，從而抑制自噬，導致細胞凋亡增加和愈合能力受損[45］。上皮膜蛋白3（epithelial membrane protein 3，EMP3）是一種腫瘤抑制因子，其下調可能是乳腺癌化療耐藥的原因。在乳腺癌細胞中，EMP3可以阻斷Akt-mTOR 信號激活從而誘導自噬，同時EMP3 還可下調YTHDC1 的表達[46］。上述研究表明，YTHDC1可能具有影響自噬水平的作用，但目前還尚未有研究證明其可直接與自噬相關基因結合并發揮調節作用。

m6A 結合蛋白自噬調節作用及其機制的總結見表3。

表3 m6A結合蛋白對自噬的調控作用及其分子機制Table 3. Regulatory effects of m6A-binding proteins on autophagy and their molecular mechanisms

3 總結與展望

自噬和m6A 修飾水平的改變會干預細胞的生命活動，改變人類疾病的發生發展，對疾病的診斷和治療有著重要的意義。隨著研究的深入，m6A 修飾與自噬之間的相互作用逐漸引起關注。m6A 修飾調控酶主要靶向調節自噬基因的m6A 修飾從而影響自噬水平（圖1）。

Figure 1. Regulatory effects of m6A modification regulatory enzymes and their binding proteins on autophagy. The red squares are m6A methyltransferases， the green squares are m6A demethylases， the yellow squares are m6A-reading proteins， the blue ellipse are autophagy-related genes， and the pink ellipses are autophagy gene upstream regulatory proteins.圖1 m6A修飾調控酶及其結合蛋白在自噬中的調控作用

但是，m6A 修飾與自噬之間明確的調控關系還有待討論。一方面是m6A 修飾水平與自噬水平在既往的研究中尚存爭議。如同樣是通過影響ATG5 和ATG7甲基化水平介導的自噬水平改變中，一項研究表明沉默FTO介導的m6A 修飾水平升高會導致ATG5 和ATG7 的表達降低進而抑制自噬，而另一項研究則指出敲減FTO后m6A 修飾水平降低導致ATG5 和ATG7 的表達升高而增強自噬。另一方面，m6A 修飾調控酶調節自噬的具體機制同樣存在爭議，比如METTL3 的上調在骨關節炎、急性肺損傷、脂肪肝和心梗等疾病中可以下調自噬水平，而在肺癌中，這種關系卻是相反的。因此，探明m6A 修飾調控酶與自噬之間的調節機制是十分必要的。此外，m6A 甲基化酶KIAA1429 與自噬之間的關系仍是空白。去甲基化酶只報道了FTO 和ALKBH5，仍有更多m6A 去甲基化酶待發現從而補充完善m6A 修飾調控過程。m6A 結合蛋白的研究對于揭示m6A 的生物功能具有不可或缺的作用，然而目前通過結合蛋白與自噬的調控還比較局限于YTH 結構域的蛋白，期待將來能有更為多元的研究。

綜上所述，眾多的證據證明了m6A 修飾對調節自噬具有重要作用，m6A 修飾對自噬的促進或抑制水平主要取決于甲基轉移酶和去甲基化酶所動態調節的m6A 水平，而對靶標基因m6A 修飾和功能的影響，很大一部分還需要甲基化結合蛋白的參與才能完成。盡管目前研究人員在這一方面做出了可喜的進展，但是它仍然是一個新興的領域。m6A 修飾調控自噬的確切、具體、可控的分子機制亟待挖掘。