間充質干細胞衍生的細胞外囊泡在調控心肌缺血再灌注損傷中的研究進展*

譚景銳， 江永鑫， 王詩源△

（1山東中醫藥大學，山東 濟南 250000；2江高鎮衛生院，廣東 廣州 510080）

缺血性心肌病是我國致死率最高的疾病，且隨著人民生活水平的改善其的發病率仍在不斷攀升[1］。以經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention， PCI）和冠狀動脈旁路移植術為代表的血運重建策略是挽救缺血性心肌病患者生命、改善患者遠期生存質量的有效手段，特別是隨著技術的進步和設備的革新，PCI手術的適用范圍不斷擴大，已經成為最主要的血運重建手段，顯著降低了急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）患者的住院死亡率[2-3］。然而，值得注意的是再灌注策略帶來的缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）損傷也逐漸被研究人員重視，國際上已經把該類情況定義為手術相關性心肌梗死或手術相關性心肌損傷，并指出該類損傷與患者的遠期預后關系密切[4］。因此對于I/R 損傷的治療成為了改善血運重建術后患者遠期預后的有效靶點。

細胞外囊泡（extracellular vehicles， EVs）衍生于神經酰胺和/或轉運所需的內體分類復合體依賴性途徑，在經歷多囊泡體融合后，絕大多數的細胞以胞吐的方式將EVs 分泌至各組織微環境或體液（血液、腦脊液、唾液等）中[5-6］。隨后EVs主要通過與細胞膜融合、內吞、配體-受體相互作用等途徑被受體細胞內化，將其負載的蛋白、核酸、代謝物等物質暴露于受體細胞的胞質中，其中一些小分子發揮了細胞間信息傳遞因子的作用[7-9］。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）具有相對易獲得、高純度、多譜系分化和強大的增殖能力等特點，通過移植MSCs或其衍生物已經被作為一種潛在的抗I/R 損傷策略被廣泛研究[10-11］。MSCs包括多種多功能干細胞，廣泛存在于脂肪、臍帶和骨髓等多種組織中，傳統觀點認為其主要功能是向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等細胞分化，然而越來越多的研究表明MSCs 還通過直接相互作用和旁分泌（直接分泌、產生EVs 等）的形式參與了多種病理生理過程[12-15］。其中EVs 具有低免疫原性和易穿透性等特點，因此當前MSCs 衍生的EVs（MSC-EVs）及其攜帶物在心肌I/R 發生過程中對損傷心肌的調控作用也成為了研究的焦點[16］。

同時，以中草藥為代表的天然藥物在治療I/R 損傷引起的心血管疾病方面具有獨特的優勢，且既往已展現了較好的臨床療效[17-18］。利用天然藥物及其有效成分預處理獲得的MSC-EVs 治療心肌I/R 損傷已經成為一種提高MSC-EVs療效的可行策略。本文將圍繞MSC-EVs 在減輕心肌I/R 損傷中的作用以及天然藥物預處理的MSC-EVs 在干預心肌I/R 損傷中的研究進展進行綜述，為進一步的干細胞和天然藥物減輕心肌I/R損傷的研究提供一定的借鑒。

1 MSC-EVs 在心肌/I/R 中對多種病理途徑的調控作用

1.1 MSC-EVs 調控細胞凋亡對心肌I/R 損傷的影響 凋亡作為一種最經典的細胞程序性死亡是組織響應缺血或氧化等刺激時發生細胞丟失的主要死亡形式[19］。在凋亡的過程中蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）/核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信號通路及其下游的經典凋亡途徑Bcl-2/Bax/caspase-3 信號軸發揮了主要的調控作用[20-21］。有研究顯示，脂肪組織來源干細胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）的EVs（ADSC-EVs）能夠緩解I/R 誘導的小鼠心功能降低，抑制心肌細胞凋亡和細胞肥大[22］。雖然細胞肥大被認為是心肌細胞丟失后存活細胞適應收縮期室壁張力的代償性反應，然而肥大的心肌細胞也是室壁運動異常、順應性差并最終導致心力衰竭的重要原因[23］。機制研究表明，ADSCEVs 中的miR-221/222 能夠通過調控AKT/NF-κB 信號通路抑制I/R 條件下的心肌細胞凋亡，同時螢光素酶報告基因實驗結果顯示，P53 上調凋亡調節因子（p53-up-regulated modulator of apoptosis， PUMA）和ETS 原 癌 基 因1（ETS proto-oncogene 1， ETS-1）是miR-221/222 直接靶點，miR-221/222 通過抑制PUMA和ETS-1 也參與了心肌細胞凋亡和細胞肥大的抑制。因此逆轉心肌細胞凋亡和細胞肥大成為了減輕心肌I/R 損傷的有效協同策略。Sun 等[24］的研究顯示，骨髓MSCs（bone marrow MSCs， BMSCs）的EVs（BMSC-EVs）也通過調控Bcl-2/Bax/caspase-3 凋亡途徑抑制了缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation， H/R）條件下心肌細胞（模擬體內心肌I/R 環境）的凋亡。體內和體外研究均提示BMSC-EVs 對心肌細胞的保護作用依賴于miR-486-5p，而磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog， PTEN）是miR-486-5p 的直接作用靶點。研究認為BMSC-EVs 通過miR-486-5p抑制心肌細胞的PTEN 表達，從而激活磷脂 酰 肌 醇3- 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT信號通路及其下游Bcl-2/Bax/caspase-3通路抑制凋亡過程。因此，利用MSC-EVs 對心肌細胞凋亡的調控有望成為心肌I/R損傷的治療策略。

1.2 MSC-EVs 調控細胞焦亡對心肌I/R 損傷的影響 核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體/caspase-1/消皮素D（gasdermin D， GSDMD）是細胞焦亡的經典途徑。NLRP3 炎癥小體由NLRP3、含caspase 募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain， ASC）和caspase-1 組成，該途徑在I/R 條件下激活，焦亡執行蛋白GSDMD能夠被NLRP3炎癥小體中的活化caspase-1 切割裂解，GSDMD 切割后的N 端（GSDMD-N）可組合嵌入細胞膜中誘導心肌細胞腫脹、膜破裂、炎癥因子釋放，進而發生細胞炎性死亡[25］。而越來越多的研究表明MSC 來源的EVs能夠通過抑制細胞焦亡改善多組織的再灌注損傷[26］。Yue 等[14］的研究顯示，GSDMD基因是miR-182-5p 的直接作用靶標，BMSCs依賴于EVs 中的miR-182-5p 抑制心肌細胞GSDMD表達而發揮保護心肌細胞的作用，隨后研究人員使用MSC-EVs 干預H/R 的心肌細胞或尾靜脈注射MSC-EVs入I/R小鼠體內，研究MSC-EVs對心肌細胞再灌注損傷的作用，結果表明MSC-EVs 能夠通過miR-182-5p 下調GSDMD 的表達抑制I/R 誘導的心肌細胞焦亡從而減輕心肌再灌注損傷，同時該研究顯示miR-182-5p 抑制了炎癥小體相關蛋白ASC 和caspase-1 的表達但對NLRP3 的表達沒有影響，這表明BMSC-EVs 中的miR-182-5p 通過調 控NLRP3 的結合蛋白而抑制NLRP3 炎癥小體，從而發揮抑制心肌細胞焦亡的作用。此外，也有研究表明，BMSC-EVs 能通過miRNA 直接調控NLRP3 的表達從而影響焦亡過程。Tang 等[27］報告了BMSC-EVs 能夠依賴于miR-320b 而抑制H/R 誘導的大鼠心肌細胞焦亡過程，NLRP3基 因 是miR-320b 的 直 接 靶 點，BMSC-EVs 通過miR-320b 直接抑制了H/R 條件下心肌細胞的NLRP3/caspase-1 途徑，減輕了心肌細胞焦亡和再灌注損傷。這些研究表明，BMSC-EVs 對I/R 狀態下心肌細胞焦亡過程的調節具有多成分、多靶點的特點。

1.3 MSC-EVs 調控細胞鐵死亡對心肌I/R 損傷的影響 鐵死亡是一種依賴于鐵離子的氧化性細胞死亡形式，其在細胞死亡具體途徑中不同于壞死、凋亡和自噬[28］。鐵死亡發生時細胞內的谷胱甘肽依賴性抗氧化系統被破壞（如谷胱甘肽過氧化物酶4 下調），脂酰CoA 合成酶4 等脂質活化酶上調導致脂質活性氧的堆積，從而誘導細胞氧化性死亡[29］。同時，以氧化應激為主要病理機制之一的心肌I/R 損傷也存在著鐵死亡的參與[30］。Zhang 等[31］使用BMSC-EVs 能夠將lncRNA miR9-3 宿主基因（miR9-3 host gene，miR9-3hg）遞送給H/R 條件下的小鼠心肌細胞并抑制鐵死亡過程，miR9-3hg 通過靶向結合Pumilio RNA結合家族成員2（Pumilio RNA binding family member 2， PUM2），抑制其表達；過氧化物氧還酶6（peroxiredoxin 6， PRDX6）被證實是保護細胞免于鐵死亡的重要蛋白之一，蛋白免疫共沉淀實驗顯示PUM2 與PRDX6 蛋白之間存在相互作用；而在使用BMSCEVs 抑制心肌細胞的PUM2 后PRDX6 的表達量升高，可見BMSC-EVs 通過miR9-3hg 靶向調控心肌細胞的PUM2/PRDX6 信號通路抑制H/R 誘導的心肌細胞鐵死亡，從而減輕再灌注損傷[32］。Song 等[33］報道了二價金屬轉運體1（divalent metal transporter 1，DMT1）在I/R 小鼠心肌中顯著上調并且DMT1 的過表達促進了心肌細胞的鐵死亡過程；螢光素酶報告基因實驗提示DMT1 是miR-23a-3p 的直接靶點；人臍帶MSCs（human umbilical MSCs， hUMSCs）的EVs（hUMSC-EVs）干預H/R 心肌細胞能夠顯著抑制心肌細胞DMT1 的表達并抑制鐵死亡過程，機制研究提示hUMSC-EVs 攜帶的miR-23a-3p 抑制了心肌細胞DMT1，下調了細胞鐵死亡，進而減輕H/R損傷。

1.4 MSC-EVs 調控細胞自噬對心肌I/R 損傷的影響 自噬是一個高度保守的細胞內程序，其主要有3種形式（巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬），其中以巨自噬在疾病中的作用被研究得最為廣泛和深入[34］。細胞能夠通過自噬將細胞質中老化和損傷的成分（蛋白、脂質、受損細胞器等）回收降解，因此在一定范圍內自噬主要作為一種細胞存活機制，然而它也會在一些無法代償的致命性刺激下促進細胞的死亡，被稱為自噬細胞死亡[35-37］。而自噬的動態平衡對于缺血性心肌病中心肌細胞的最終走向也至關重要。BMSCs與H9C2心肌細胞共培養能夠抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡和自噬活性；進一步的研究提示miR-143-3p 在BMSC-EVs 中高表達，BMSC-EVs 能夠通過miR-143-3p 靶向抑制心肌細胞檢查點激酶2（checkpoint kinase 2， CHK2）的表達，CHK2 與自噬效應蛋白beclin-1 形成的CHK2/beclin-1 信號通路在促進自噬中發揮重要作用，因此miR-143-3p 對CHK2/beclin-1 通路的抑制保護心肌細胞免于再灌注下過度自噬導致的損傷[38-39］。在抗I/R 損傷的研究中，除了保護心肌細胞以改善心功能外，通過改善心臟微血管內皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）以維持對缺血區域的供血也是治療I/R 的重要策略[40］。Diao等[41］的研究表明，hUMSC-EVs能夠通過lncRNA UCA1 （urothelial cancer associated 1）競爭性與CMECs的miR-143結合，從而上調由miR-143抑制的Bcl-2/beclin-1 信號軸，因此抑制了CMECs 的凋亡和自噬過程，并增強細胞活力。這體現了MSCEVs能夠通過多途徑對心臟微環境中的多種細胞產生保護作用，在I/R的防治中具有較高的應用潛力。

1.5 MSC-EVs 調控巨噬細胞M1/M2 極化對心肌I/R損傷的影響 越來越多的研究表明，I/R 損傷伴隨著心臟微環境中的炎癥級聯反應，其中巨噬細胞在調控心臟微環境的炎癥中發揮重要的作用[42］。在損傷早期巨噬細胞主要以促炎表型的M1為主，發揮去除細胞碎片的作用，而后巨噬細胞逐漸向抗炎表型M2極化，M2 在分泌抗炎性因子的同時還分泌諸多生長因子參與了傷口的愈合和瘢痕組織的形成過程[43-44］。Zhao等[45］觀察到，心肌注射BMSC-EVs除了顯著改善I/R 小鼠心功能、減少心肌梗死面積外，還顯著抑制了心肌組織的炎性浸潤，同時心肌組織和血清的促炎因子白細胞介素6 的水平降低而抑炎因子白細胞介素10 水平升高。進一步的研究表明，BMSC-EVs能夠被巨噬細胞內化并依賴于miR-182 促進巨噬細胞的M2 極化，其具體機制為BMSC-EVs 中的miR-182能夠直接作用于Toll樣受體4的轉錄本而抑制其表達，進而下調了髓樣分化因子88/NF-κB 信號通路并上調PI3K/AKT 信號通路從而促進巨噬細胞M2 極化，最終發揮調控I/R 條件下心肌組織炎癥平衡、減輕再灌注損傷的作用。此外，Shen等[46］發現，心肌注射BMSC-EVs能夠通過調控巨噬細胞的M2極化改善I/R 模型小鼠心功能，而抑制BMSCs 的miR-21-5p 表達后這種功效被抑制，提示BMSC-EVs調控心肌中巨噬細胞的M1/M2 平衡也與miR-21-5p 密切相關。這些研究表明，MSC-EVs 對巨噬細胞M1/M2 平衡的調控依賴于多種EVs 成分的協調作用，而這種動態平衡影響了心肌I/R損傷的程度，因此利用MSC-EVs調控巨噬細胞從而減輕I/R損傷需要更全面的視角。

MSC-EVs 調控多種病理途徑以減輕心肌I/R 損傷的總結見圖1。

Figure 1. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vehicles attenuate myocardial I/R injury by regulating multiple pathological pathways.圖1 間充質干細胞外囊泡通過調控多種病理途徑減輕心肌I/R損傷

2 天然藥物干預MSC-EVs對心肌I/R損傷的調控

雖然天然藥物直接應用于治療疾病的療效已經有諸多循證依據，但部分成分口服利用度差、細胞攝取率低、活性成分不穩定等問題，限制了天然藥物制劑的標準化應用和研究[47-48］。然而，通過天然藥物及其有效成分干預MSC 獲得的富含天然藥物成分的EVs不僅可利用EVs的特點有效解決上述問題，并且具有促進MSC-EVs的分泌、提高對心肌I/R損傷的療效等多種優勢。Deng 等[49］報道，與BMSCs 共培養能夠提高H/R條件下心肌細胞活力并抑制細胞焦亡，經鳶尾素（irisin）預處理的BMSCs（irisin-BMSCs）對細胞活力的保護作用更加明顯，而使用EVs分泌抑制劑后irisin-BMSCs保護心肌細胞的能力顯著降低，表明irisin-BMSCs是通過EVs提高心肌細胞的抗細胞焦亡和氧化應激能力。隨后以分離irisin-BMSCs所得的EVs（irisin-BMSC-EVs）干預H/R 條件下的心肌細胞證實了這一結論，同時機制研究顯示irisin-BMSC-EVs 通過抑制NLRP3炎癥小體途徑發揮調控心肌細胞焦亡和氧化應激的作用。另外，Fu 等[50］報道，BMSC-EVs接受冬凌草素預處理后其保護心臟的效果尤為明顯，機制研究顯示BMSC-EVs能夠上調I/R模型大鼠心肌或H/R 條件下H9C2 心肌細胞自噬相關蛋白（beclin-1、ATG13等）表達，下調凋亡相關蛋白（Apaf1、Bax等）表達，從而抑制心肌細胞凋亡。而冬凌草素預處理能夠加強BMSC-EVs對I/R條件下上調心肌細胞自噬和下調細胞凋亡的作用，從而減輕了心肌再灌注損傷。

3 結語

隨著研究的不斷深入，MSCs及其EVs在心肌I/R損傷中的重要作用被不斷發現。而與依賴于MSCs的歸巢能力不同，MSCs 衍生的EVs 具有直接攜帶有效成分參與病變組織調控的優勢。此外，天然藥物的干預具有促進EVs分泌、提高MSC-EVs中治療成分多樣性和負載量等優勢。在本綜述中，MSC-EVs通過調控多種細胞的多種生物途徑對I/R損傷的心肌產生保護作用，并且天然藥物的干預能夠提高MSC-EVs 對于心肌I/R 損傷的療效。然而，BMSC-EVs 和天然藥物活性成分對心肌I/R 損傷的調控仍然是一個多途徑、多靶點的過程，當前研究仍缺乏全面的了解并且尚未應用于臨床，因此需更多研究人員進行更多的臨床前研究，發掘BMSC-EVs和其天然藥物干預衍生物更大的臨床價值，豐富臨床中防治心肌I/R損傷的策略。