高雄激素誘導多囊卵巢綜合征表觀遺傳機制的研究進展*

梁夢夢， 趙 燕， 張艷新， 邵欣欣， 陳 聰△， 郝文慶

（1山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2濟南市疾病預防控制中心，山東 濟南 250021；3山東中醫藥大學中醫文獻與文化研究院，中醫藥經典理論教育部重點實驗室，山東 濟南 250355；4山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東 濟南 250355；5巨野縣中醫醫院，山東 巨野 274900）

多 囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以雄激素過多、排卵功能障礙和多囊卵巢為特征的代謝紊亂性生殖內分泌疾病[1］。根據全國臨床大數據流行病調查顯示，該病在育齡女性中的發病率為5.6%，其中無排卵性不孕的女性占75%，是引起育齡女性無排卵性不孕的主要原因[2］。當前，臨床常以促排卵、降低血雄激素水平、緩解胰島素抵抗等藥物，以及手術進行治療。

因PCOS 明顯的異質性、遺傳性，當前對其發病機制的研究尚未達成統一共識，認為主要與遺傳、下丘腦-垂體-卵巢軸異常、胰島素抵抗、雄激素過量等關系密切[3］。其中，表觀遺傳紊亂在該病的發生發展過程中發揮著核心作用，由宮內或產后不利環境引起的表觀遺傳變化對胎兒出生后的PCOS 樣癥狀或相關臨床改變具有引發作用[4］。高雄激素性妊娠是PCOS胎兒起源的主要因素，通過表觀遺傳突變導致子代青春期PCOS 的發病幾率增加[5］。表觀遺傳是指DNA 序列沒有發生改變，但是基因表達卻發生了通過細胞有絲分裂或減數分裂可遺傳的變化，并最終導致基因表型的改變[4］，是連接早期生命特征及后期表型轉變的重要機制，是臨床PCOS女性及其子代疾病表征的重要遺傳途徑。因此，本文聚焦高雄激素誘導PCOS表觀遺傳機制的研究進展，以期為PCOS的治療和診斷提供參考。

1 雄激素誘導PCOS模型及表觀遺傳機制的研究

PCOS 的發生伴隨著的顯著病理特征是雄激素升高，但是高雄激素與PCOS發病的具體相關性尚未明確，因而領域內專家提出了“雄激素致病”假說[6］。該假說指的是，幼兒過早暴露于高雄激素環境下，會使得成年以后的卵巢功能出現不同程度的PCOS 表征，這些表征是基因差異性表達的結果。可進行干預的常見雄激素有雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone， DHEA）和丙酸睪酮（testosterone propionate， TP）。有報道表明，雄激素于產前或產后干預，通過招募不同的啟動子和增強子調控DNA 表達，從而導致表觀遺傳改變及成年后出現病理改變[7］，研究角度主要有組蛋白修飾、DNA 甲基化、非編碼RNA 等（表1）。在動物模型中，猴子是反映疾病病理相對較為全面的物種，并且雌猴于自然狀態下同樣會發生高雄激素的癥狀[8］。小鼠模型可以為PCOS 提供分子層面的病理研究，如PCOS誘導的神經-內分泌改變。

表1 雄激素誘導的PCOS模型表觀遺傳及相關基因Table 1. Epigenetic and related genes in androgen-induced PCOS models

Table 1. (continued)

1.1 基于組蛋白修飾 組蛋白是一種八聚體結構，有組蛋白H2A、H2B、H3 和H4 各兩個副本組成，由DNA 和連接蛋白H1 包裹。組蛋白尾部的化學修飾（如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和類泛素化）通過影響轉錄因子的結合從而影響基因轉錄和細胞表型（圖1）。Guo等[9］和Sinha等[10］以綿羊為實驗模型，于妊娠期30～90 d 腹腔注射TP，結果顯示卵巢顆粒細胞中產前雄激素干預影響了DNA 甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）和DNMT3B的基因修飾，使得組蛋白H3 第9 位賴氨酸三甲基化（trimethylation of lysine 9 in histone H3， H3K9me3）水平升高，并顯著影響了卵巢中膜細胞的組蛋白甲基化[9］；對母羊和幼羊實施卵巢摘取并進行RNA 測序，顯示母羊與幼羊之間的基因差異性表達并不一致，進一步開展母羊組蛋白研究，顯示產前處理分離的卵巢中H3K9me3、組蛋白H3 第27 位賴氨酸乙酰化（acetylation of lysine 27 in histone H3， H3K27ac）和組蛋白H3 第9 位賴氨酸乙酰化（acetylation of lysine 9 in histone H3， H3K9ac）水平顯著升高，但是組蛋白H3 第4 位賴氨酸三甲基化（trimethylation of lysine 4 in histone H3， H3K4me3）水平并無顯著變化[10］。由此推測，產前雄激素的暴露會引起跨代表觀遺傳改變，這為PCOS的發生發展提供了一個研究方向。

Figure 1. Epigenetic histone modifications in PCOS. EZH2： enhancer of zeste homolog 2； AR： androgen receptor； LSD1： lysinespecific demethylase 1.圖1 PCOS中的表觀遺傳組蛋白修飾

產后雄激素誘導研究顯示，雄激素可作用于基因的啟動子以及增強子區域，通過減少組蛋白H3 第27 位賴氨酸三甲基化（trimethylation of lysine 27 in histone H3， H3K27me3），上調H3K27ac，調控下游多種基因的表達，促進PCOS 的發生發展[11］。Nelson-Degrave 等[12］通過臨床檢測38～40 歲患有PCOS 女性的卵巢內膜細胞與正常卵巢內膜細胞的雄激素生物合成水平，觀察到丙戊酸鈉可通過組蛋白乙酰化誘導雄激素的合成，從而造成卵巢多囊樣改變。動物模型研究結果同樣顯示，組蛋白修飾的改變影響著PCOS 表征。小鼠卵巢顆粒細胞經25 nmol/L DHT 誘導后，PI3K/Akt通路快速磷酸化，從而抑制了zeste增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2， Ezh2）的活性，甚至可使Ezh2 的表達完全消失，雄激素的長期誘導使得黃體生成素（luteinizing hormone， LH）誘導的轉錄因子Runx1基因的啟動子H3K27me3 抑制標記減少，引起了后期的排卵障礙[13］。小鼠卵巢卵母細胞熒光強度分析顯示，DHEA 誘導處理的卵母細胞中DNMT1和組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）轉錄所需的mRNA 表達量下降，組蛋白H3第9位賴氨酸的去甲基化水平降低，組蛋白H4第12 位賴氨酸的乙酰化增加且與ROS 的產生呈正相關，表明ROS升高有可能是導致PCOS患者卵泡成熟率和排卵率低的原因[14］。

1.2 基于DNA 甲基化水平的修飾 DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉移酶的作用下，基因組胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine-phosphoric acid-guanine， CpG）二核苷酸的胞嘧啶5 號碳位以共價鍵結合一個甲基基團（圖2）。已有研究表明，PCOS 在子代具備顯著的遺傳性并伴隨著遺傳基因甲基化程度的改變[15-16］，如類固醇相關合成基因[細胞色素P450家族17亞家族A（cytochrome P450 family 17 subfamily A，CYP17A）、CYP19A等］的甲基化，激素受體[黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體（luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor，LHCGR）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）、胰島素受體（insulin receptor，INSR）等］的甲基化及其他PCOS相關基因[絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，Map3k1）、微管相關蛋白1 輕鏈3α（microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha，Map1lc3a）等］的甲基化。

Figure 2. Regulation of epigenetic DNA methylation level in PCOS. Me： methyl group.圖2 PCOS中表觀遺傳DNA甲基化水平的調控

臨床對22～36 歲110 名患有PCOS 的婦女以及119 名排卵周期正常的體外受精女性的卵巢顆粒細胞進行RNA 測序分析，結果顯示卵巢顆粒細胞中脂類和類固醇激素合成基因上調，結合DNA 定量甲基化分析，顯示脂類和類固醇類相關基因啟動子呈現低甲基化，這可能是導致相關基因異常表達的原因[17］。已有研究表明，在游離睪酮誘導的大鼠卵巢膜細胞中，類固醇相關基因CYP17、GATA結合蛋白6（GATA binding protein 6，GATA6）和類固醇合成急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）的啟動子甲基化水平降低，其中GATA6和StAR啟動子-520（CpG9）和-822（CpG4）位點的甲基化顯著降低[18］。檢測PCOS 大鼠模型外周血和卵巢組織中AR、CYP11A、CYP11A1、CYP17A和CYP17A1的甲基化狀態，結果顯示在外周血細胞中AR出現3 個低甲基化位點，CYP11A1出現1 個低甲基化位點，在卵巢組織中AR出現5 個低甲基化位點，CYP11A1出現1個低甲基化位點；此外，組織特異性甲基化分析顯示，與卵巢和血液相比，AR和CYP11A1在睪丸中均表現出顯著的低甲基化[19］。以上研究提示，產前雄激素誘導類固醇合成相關基因低甲基化是導致PCOS 伴高雄激素血癥的可能原因之一。除此以外，科研人員以過度暴露于DHT環境下的成年斑馬魚的子一代受精卵為研究對象，發現子一代斑馬魚整體出現低甲基化現象，葡萄糖耐受實驗顯示，子一代斑馬魚的空腹血糖及餐后血糖均出現升高[20］。這提示產前雄激素暴露可能導致卵巢表觀基因組和葡萄糖穩態的跨代改變，但二者之間的關系尚未明確。

伴隨激素水平變化的激素受體也會發生相應的甲基化水平變化。全基因關聯分析結果顯示，LHCGR是PCOS 的易感基因[21］。為探討LHCGR表觀遺傳成分致PCOS 發病的機制，Wang 等[22］對采集的PCOS 女性外周血細胞和顆粒細胞的DNA 甲基化進行分析，結果顯示LHCGR啟動子區域CpG 出現低甲基化狀態；臨床免疫組化結果顯示，PCOS 患者的LHCGR 水平比正常組高，同時伴有CYP17A1、3β-羥基類固醇脫氫酶II（3β-hydroxysteroid dehydrogenase II， 3βHSDII）和17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase， 17βHSD）的高表達[23］；DHEA 誘導的小鼠卵巢出現LHCGR低甲基化的情況[24］，這與臨床結論一致，提示LHCGR低甲基化是PCOS 發病的潛在機制。在PCOS 相關度較高的基因AR的DNA 甲基化程度的研究中，Desmawati 等[25］比對PCOS 女性和正常女性顆粒細胞中的DNA 甲基化測序結果，結果顯示PCOS 女性顆粒細胞中AR基因啟動子的DNA 甲基化水平較低，提示顆粒細胞中DNA低甲基化會增加AR水平，導致高雄激素誘導的PCOS的發生。

上述研究表明，PCOS 的發病與激素及其受體合成基因的甲基化程度有關。為探究高雄激素誘導的非激素類基因的表觀遺傳變化，及其與PCOS卵巢功能障礙間的關系，Qu 等[26］對高雄激素血癥和非高雄激素血癥PCOS 女性卵巢顆粒細胞進行基因甲基化測序，結果顯示過氧化物酶體增殖物激活受體γ1（peroxisome proliferator-activated receptor gamma 1，PPARG1）啟動子中的2 個高甲基化CpG 位點和核受體輔阻遏物1（nuclear receptor corepressor 1，NCOR1）啟動子中的5 個低甲基化CpG 位點僅見于高雄激素血癥PCOS女性。Zhang等[27］通過建立產前雄激素化雌性大鼠模型，觀察其卵巢形態，表現為閉鎖卵泡和囊性卵泡增多，甲基化檢測結果顯示基因BCL2L1和SCR5A1出現高度甲基化，并伴有血清葡萄糖、17-羥孕酮和雄激素水平的升高。產前DHT誘導高雄激素小鼠模型顯示，卵巢DNMT1 表達水平顯著下降，使得自噬相關調控基因Map3k1和Map1lc3a甲基化水平顯著降低，從而促進卵巢顆粒細胞自噬水平升高，引發卵泡發育障礙[28］。以上研究提示，Map3k1、Map1lc3a、PPARG1、NCOR1、BCL2L1、SCR5A1等非激素類基因的甲基化變化參與高雄激素誘發PCOS 的卵巢功能障礙，其潛在作用機制可能與高雄激素環境對機體葡萄糖穩態的影響有關。

1.3 基于非編碼RNA的調節

1.3.1 基于微小RNA（microRNA， miRNA）水平的調節 miRNA 是一類內源性非編碼的、長度約為21～25 個核苷酸的小RNA，具有高度的保守性、時序性、組織特異性，以及廣泛的基因調控作用，主要通過調控靶基因的轉錄以調控蛋白質的表達，從而改變生物的性狀，因此維持miRNA 的穩定對于維持細胞的正常活動十分重要[29］。已有研究表明，PCOS 患者內分泌紊亂、卵泡閉鎖和卵泡發育不全等癥狀受miRNA基因調控作用的影響[30］，如miRNA-21是在正常卵泡發育過程中由LH 誘導的高表達miRNA 之一，高雄激素誘導下的顆粒細胞中miRNA-21水平驟降，可引發細胞凋亡[31］；PCOS 患者卵巢顆粒細胞表達的830 個基因和30 個miRNA 中，7 個miRNA 負調控靶mRNA 表達，130 個miRNA 啟動子顯著不同甲基 化，其 中miRNA-429、miRNA-141-3p 和miRNA-126-3p 的啟動子高甲基化受miRNA 表達抑制影響，進而導致相應基因XIAP、BRD3、MAPK14和SLC7A5上調[32］。高雄激素誘導DNA 甲基化水平改變對PCOS 發生發展影響的研究已表明，高雄激素血癥PCOS女性卵巢顆粒細胞中PPARG1啟動子高甲基化且NCOR1啟動子低甲基化，經研究，造成基因甲基化改變的主要原因是PPARG1mRNA表達量降低，而NCOR1mRNA 表達量增高[26］。LHCGR是PCOS 的易感基因，其低甲基化是PCOS 發病的潛在機制，進一步研究顯示PCOS 患者體內游離的miR-592 水平低于正常組，且miR-592 與LHCGR基因的3'非翻譯區發生相互作用從而下調LHCGR 蛋白的表達[33］。這些研究揭示高雄激素環境通過影響相應miRNA 對其靶基因的轉錄調控，進而影響PCOS的發生發展。

1.3.2 基于長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）水平的調節 lncRNA 是長度大于200 nt 的RNA 分子，通常認為他們并不編碼蛋白，而是以RNA 的形式在多種層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控等）參與蛋白編碼基因的調控。Jin等[34］比對PCOS 患者與正常組卵巢顆粒細胞lncRNA測序結果，顯示有1 361 個差異lncRNA；Wang 等[35］比對卵泡液內lncRNA 測序結果，顯示有1 253 個上調lncRNA，613 個下調lncRNA。這表明lncRNA 可能在PCOS發病機制中發揮重要作用，并有可能成為PCOS疾病診斷和治療的靶標。

研究顯示，lncRNA 可以通過調控轉錄因子實現對miRNA 的調節以及對RNA 的編輯和降解[36-37］。PCOS 患者卵巢顆粒細胞中高表達的lncRNA H19 可降低miRNA-19b 的表達，且螢光素酶報告基因檢測證明lncRNA H19 可以與miRNA-19b 結合而調節下游靶點，從而起到對卵巢顆粒細胞的調控作用[38］。lncRNA ZFAS1 可與miRNA-129 結合而促進HMGB1表達，導致PCOS 患者卵巢顆粒細胞的內分泌紊亂，促進多囊卵巢顆粒細胞的凋亡[39］。顆粒黃體細胞中miRNA-145 和miRNA-182 的相對表達顯著下降，卵泡液內miRNA-182則差異上調，且與PCOS患者的激素水平呈顯著相關性[40］。這些研究表明，lncRNA 通過調節miRNA 參與PCOS 的發病機制，且在激素的合成和代謝中發揮著重要的作用。

lncRNA 也可以通過調控DNA 甲基化影響PCOS的發生發展。lnc-MAP3K13-7：1 作為PCOS 患者顆粒細胞高表達的lncRNA，可誘導泛素化導致DNMT1降解，抑制DNMT1 的表達，從而導致DNMT1 依賴的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）啟動子低甲基化，增加了CDKN1A的表達，導致顆粒細胞生長減弱[41］。

2 結語與展望

PCOS 嚴重影響著育齡婦女的健康，是引起育齡女性無排卵性不孕的主要原因，是影響國計民生的重大醫療難題。目前，國際多以Rotterdam 標準、NIH標準和AES 標準進行診斷，但是在不同地區和不同專科中的應用情況存在較大差異[42］。由于PCOS 復雜多樣的臨床表現，導致國內外在診療PCOS時存在診斷延遲、治療效果不佳等問題[43-44］。因此，PCOS早期疾病臨床診斷標志物的鑒定及病理機制的深入研究能夠為攻克PCOS提供有力支持。

雄激素誘導的表觀遺傳是當今診治PCOS 的研究熱點，現有研究深化了對PCOS 發病機制的認識。但是綜合以上，現階段的研究仍存在一定的問題：研究成果呈現了很多內源性的改變，但是環境因素誘導的這些改變究竟是如何調控疾病發生及演變的過程和機理尚未闡明；研究樣本差異大、實驗可重復性低、涉及基因面廣、研究不夠深入，導致目前仍未篩選出對PCOS發病起到決定性影響的基因；動物研究證實產前雄激素暴露會引起跨代表觀遺傳改變，但是動物與人類之間始終存在著差異，當前對人類母代、子代的研究較少，跨代分離研究并不深入。

由于PCOS具有明顯的遺傳性和異質性，表明最少是由兩對以上致病基因的遺傳信息累積導致，并不遵從孟德爾遺傳規律，因此應該深化分子遺傳學研究，采用單核苷酸多態性篩查基因型與疾病的關聯性，并進行單體型研究和家系分析；同時，分析相關基因的功能，明確調控機制，以篩選出PCOS 的診斷生物標志物和治療靶標，明確治療方向。