γ-氨基丁酸（GABA）的研究進展

周俊萍，徐玉娟，溫 靖, ，吳繼軍，余元善，李楚源，翁少全，趙 敏

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；3.廣州王老吉大健康產業有限公司，廣東廣州 510623）

γ-氨基丁酸（GABA）又稱4-氨基丁酸，氨基取代基位于C-4 位置，分子式為NH2（CH2）3COOH，結構式如圖1，其相對分子量為103.12，熔點202 ℃，白色至淺黃色結晶物質，易溶于水，不溶于或難溶于有機溶劑[1]。

圖1 GABA 結構式Fig.1 Structure of GABA

GABA 廣泛分布于動、植物和微生物體內，在植物體內可參與調節植物的代謝，同時作為一種應激反應信號，與其他途徑相互作用共同調節植物的抗逆能力[2]。1950 年，研究發現哺乳動物的中樞神經系統中存在GABA，隨后的研究表明，GABA 是中樞神經系統的主要抑制性神經遞質，也是具有不同功能的多功能分子[3]，具有降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗抑郁、鎮靜止痛、提高腦活力及改善脂質代謝等多種生理功能，目前已應用于食品、保健品和飼料等領域，研發出GABA 膠囊、GABA 茶、GABA 軟糖等一系列產品。

研究人員在GABA 的合成制備、提取純化、功能作用等方面開展了大量的研究，但有關GABA 的研究起步較晚，同時由于其在生物體內作用的復雜性，目前仍有大量爭議。因此，本文從生物合成與代謝途徑、化學合成與富集方法、檢測方法以及生物活性等方面對GABA 進行全面的綜述，以期為GABA的研究與應用提供理論參考。

1 γ-氨基丁酸的生物合成與代謝途徑

1.1 GABA 支路

GABA 支路（GABA Shunt）是動植物體內GABA 合成與代謝的主要途徑，也是目前已知唯一能降低胞質GABA 水平的途徑[4]，主要涉及三種酶，谷氨酸脫羧酶（GAD）、γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）和琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）（圖2）。谷氨酸脫羧酶是催化谷氨酸（Glu）脫羧合成GABA 反應中的限速酶，受Ca2+/鈣調蛋白調節[5]，當植物處于脅迫環境（冷、熱、干旱等）時，H+或Ca2+的累積上調鈣調蛋白水平，進而激活谷氨酸脫羧酶并催化谷氨酸轉化為GABA[6]。GABA 的分解代謝是在線粒體內經GABAT 和SSADH 催化轉化生成琥珀酸進入三羧酸（TCA）循環，最終由α-酮戊二酸轉化為谷氨酸從而維持線粒體內GABA/Glu 平衡[7]。GABA 積累過多時會誘導氧化還原電位增加，抑制SSADH 活性，導致GABA在谷氨酸脫氫酶的作用下轉化為γ-羥基丁酸[4]。

GABA 支路的生物學功能因不同生物體而異，同時參與各種生理過程，包括調節胞質pH、維持TCA 循環、介導C:N 平衡等，還參與植物體內的激素代謝、多胺代謝途徑[6,8]。Studart-Guimar?es 等[9]的研究表明，抑制番茄植株琥珀酰CoA 活性對其生長影響不大，因為細胞可以通過增強GABA 支路的活性，彌補TCA 循環中因無法合成琥珀酸造成的損失，維持細胞呼吸作用的正常功能。Michaeli 等[5]對擬南芥線粒體GABA 轉運蛋白突變植株的研究也證實了這一點。另外，該突變植株體內部分氨基酸水平上調，海藻糖和蔗糖含量明顯降低，且在碳源限制性培養條件下生長異常，表明GABA 支路在介導碳氮代謝方面具有十分重要的作用，可以作為植物中的氮儲存代謝物。GABA 支路與生物體內的各種生理功能也有密切聯系，如在糖酵解途徑受損時為TCA 循環提供羧酸和能量來源[9]；阿爾茨海默癥發病早期階段GABA 支路被激活等[10]。

1.2 多胺降解途徑

多胺降解途徑是另一條GABA 合成途徑（圖2），在該途徑中，GABA 主要通過4-氨基丁醛中間體自發環化形成1-吡咯啉，隨后在吡咯啉脫氫酶的作用下轉化生成。二胺氧化酶（DAO）是代謝途徑中的關鍵酶，與銅胺氧化酶和單胺氧化酶等酶共同參與催化腐胺降解為4-氨基丁醛[6]。植物中腐胺生物合成的主要途徑是由精氨酸脫羧酶催化精氨酸生成胍丁胺再轉化為腐胺，鳥氨酸或亞精胺也可以作為腐胺合成的前體物質。4-氨基丁醛也可以通過亞精胺轉化生成，反應由多胺氧化酶催化，該酶同樣可以催化亞精胺轉化為腐胺和精胺[6,11]。

在正常或脅迫條件下，植物體內多胺降解途徑對GABA 富集的貢獻率并不高，在氨基胍（AG，DAO酶抑制劑）真空滲透條件下，龍眼和蠶豆GABA 合成的貢獻率分別約20%～25%和30%[7,12]。而在動物體部分組織內，GABA 的主要合成途徑并不是GABA支路，如腎上腺。采用氨基胍抑制腐胺降解，24 h 后GABA 濃度幾乎降至零，表明大鼠腎上腺中的GABA幾乎完全來自于多胺降解途徑[13]。Sequerra 等[14]同樣報道了大鼠腦室下區（SVZ）GABA 的合成依賴于腐胺的降解且沒有明顯檢測到GAD 的免疫標記。

2 γ-氨基丁酸的制備方法

2.1 化學合成

化學合成法是早期比較經典的制備GABA 的一種方法，主要方法有兩種，一種是以γ-丁內酯為起始原料，與氯化亞砜反應，先后經開環、氯代反應后得到4-氯丁酰氯，其酯化后可生成4-氯丁酸甲酯，在催化劑的作用下能夠與氨水發生胺化、水解反應后生成GABA[15]。

另有報道以2-吡咯烷酮為起始原料制備GABA（圖3），采用NaOH 或Ca(OH)2作為開環試劑水解2-吡咯烷酮生成γ-氨基丁酸鈉，再加入碳酸氫銨沉降鈣離子制備而成[16]，或是利用弱酸型陽離子交換樹脂柱酸化處理γ-氨基丁酸鈉生成γ-氨基丁酸水溶液[17]。該法生產所用吡咯烷酮、NaOH 等為腐蝕性物質，會影響人體健康，特別是吡咯烷酮，在高溫條件下具有燃爆性，且會產生有毒的氧化氮煙氣。這些化學合成制備的GABA 與自然產生的相比，成本高昂，且在生產過程中通常用到危險溶劑，并伴隨有毒副產物的生成，因此其產品主要應用于生化研究，而不能應用于食品領域[18]。近十年來有關化學合成GABA的研究報道逐漸減少，安全性更高的生物轉化法成為研究熱點。

圖3 2-吡咯烷酮制備GABA 反應過程Fig.3 Reaction process for the synthesis of GABA from 2-pyrrolidone

2.2 微生物發酵法

化學合成法安全性較低，而植物提取法產量不高，相較而言，微生物發酵法生產成本低廉，工藝簡單，并且產量可觀，可滿足食品和制藥等行業具有高附加值應用的復雜需求。發酵法生產GABA 是利用微生物體內含有的谷氨酸脫羧酶，將谷氨酸脫羧轉化為GABA。目前用于發酵生產GABA 的菌種主要有細菌、真菌和酵母菌，包括短乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、紅曲霉、酵母菌、大腸桿菌等，菌種來源多從發酵食品中分離得到，不同菌種發酵GABA 產量如表1。

表1 不同菌種發酵產GABA 含量Table 1 Content of GABA produced by fermentation of different strains

許多文獻報道了采用單一菌種發酵產GABA，但根據張恕銘等[19]的研究，屎腸球菌AB157 與植物乳桿菌BC112 兩種菌株共培養較屎腸球菌AB157單菌株發酵產生的GABA 提高3.9 倍。誘變選育高產GABA 菌株也可以進一步提高GABA 產量，糞腸乳酸球菌經7 輪室溫常壓等離子體（ARTP）誘變與2 輪微生物微液滴培養系統（MMC）適應性進化后所產生的突變株EM05 的GABA 產量最高可達64.233 g/L[20]。經UV 和60Co-γ射線反復誘變處理得到的短乳桿菌hjxj-08119 GABA 產量也可達到76.36 g/L[21]。除此之外，還有大量學者針對培養基組成、pH、發酵時間等培養條件進行優化以提高GABA 產量，可見微生物發酵產GABA 具有進一步深入挖掘的潛力和十分良好的發展前景。

2.3 植物富集法

隨著人們對飲食健康的重視，天然食品逐漸受到消費者的青睞。GABA 廣泛分布于高等植物體內，這種自然來源的GABA 僅需水提即可，可以減少危險試劑殘留的風險[27]，同時具有操作簡單、成本低廉等優點，且其安全性較高，可廣泛適用于食品、醫藥等領域。但GABA 在植物體內的含量較低，目前已報道的新鮮紅棗中GABA 含量為5.12～14.02 mg/100 g FW[30]，糙米為13.89 mg/100 g DW[31]，桑葉和荔枝中的GABA 含量相對較高，分別為60 mg/100 g FW[59]和60～130 mg/100 g FW[32-34]，但其含量也遠低于微生物發酵所產生的GABA。

大量文獻報道了利用各種環境壓力使植物產生應激反應以提高GABA 含量的方法。周沫霖[12]報道了低溫馴化結合冰溫貯藏可以激活龍眼果肉GABA 支路代謝，進而引起GABA 積累，含量由7.49 mmol/kg FW 上升至17.35 mmol/kg FW。超聲輔助鹽脅迫處理新鮮荸薺也能使其GABA 含量提高5.04 倍[35]。采后水果需要消耗大量營養物質維持正常的生理代謝，采用脅迫手段內源代謝富集GABA往往僅能提高2～5 倍，而種子中含有豐富的蛋白質，發芽過程中內源性蛋白酶被激活，可將蛋白質水解成氨基酸，是GABA 積累的良好來源。采用水分脅迫處理即可使小麥種子的GABA 含量提高12 倍，先后經水分脅迫、厭氧和熱處理發芽后的小麥GABA含量可提高40 倍[36]。另一項研究采用低氧聯合酸脅迫發芽工藝優化富集大麥芽GABA 也使其含量提高了33.6 倍[37]，可見，不同植物體GABA 的富集效果具有極大的差異。

3 γ-氨基丁酸的檢測方法

由于GABA 的結構特點，其在紫外光區、可見光區以及熒光區均沒有顯著吸收[38]，難以直接進行測定，目前報道的GABA 測定方法有比色法、氨基酸分析儀法、薄層色譜法、（超）高效液相色譜法、（超）高效液相色譜法串聯質譜法等。由于薄層層析僅用于定性測定，氨基酸分析儀適用范圍較窄，對糖組分和脂肪含量較高的樣品不適用，因此，目前多采用比色法、（超）高效液相色譜法和（超）高效液相色譜串聯質譜法。

3.1 比色法

Berthelot 比色法是一種簡單、快速且成本較低的GABA 測定方法，利用苯酚和次氯酸鈉與GABA的游離氨發生顯色反應來檢測GABA 的含量。利用ω-氨基酸響應靈敏而α-氨基酸響應值較低的差別來減少部分常規氨基酸對反應體系的干擾[39]，但樣液中其他游離氨、色素以及顯色液穩定性等不良因素對測定結果的影響也限制了其應用范圍[40]，萬藍婷等[40]針對該問題建立一個優化體系，在顯色之前先后采用甲醇和氯化鋁除去葉綠素和水溶性色素，并對顯色劑比例、顯色時間和溫度進行優化以進一步提高Berthelot 法測定植物葉片GABA 含量的精準度和靈敏度。此外，Jinnarak 等[41]報道了一種基于銀納米粒子的比色方法，利用GABA 在酸性環境下帶正電荷，由于靜電相互作用導致檸檬酸鹽溶液中銀納米粒子的聚集，溶液在390 nm 處的表面等離子體共振偏移且顏色發生變化。該法靈敏度較高，檢測限為57.7 mg/L，但由于制備的粒子粒徑差異大，且生產成本較高而限制其應用。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前測定GABA 含量最常用的方法，相較于比色法，具有較高的精密度和廣泛的適用性，可用于測定植物組織、發酵液等多種樣品，但對血漿、腦脊液等微量GABA 樣品無法靈敏檢測，同時該法操作較為繁瑣，需結合各種衍生化技術，包括柱前/柱后衍生和在線衍生[42]（表2），目前報道的衍生化試劑主要有鄰苯二醛（OPA）、2,4-二硝基氯苯（FDCB）、2,4-二硝基氟苯（FDNB）、異硫氰酸苯酯（PITC）以及丹酰氯（Dansyl-Cl）等。其中OPA 反應靈敏迅速、衍生時間短，且試劑本身不發熒光，可避免試劑干擾，因此成為目前應用最廣泛的衍生化方法，采用OPA 法測定GABA 也可以有效分離Glu和GABA，避免Glu 對檢測結果的干擾[45]，但其衍生產物半衰期較短，通常需要在3 min 內上樣[43]。Dansyl-Cl 和FMOC 容易生成多級衍生產物干擾檢測結果，AQC 衍生試劑昂貴，而PITC 毒性較大，容易對柱子的壽命產生影響[44]。王能鳳[42]對Dansyl-CI、FDCB、FDNB 和PITC 等4 種柱前衍生化法進行對比分析，發現其對紅棗GABA 的測定結果之間無顯著性差異（P＞0.05）。HPLC 柱后衍生-熒光檢測法也有報道，該法在高效液相色譜與熒光檢測器間加裝柱后衍生裝置，同樣采用OPA 作為衍生劑，GABA 保留時間為3.8 min，且能實現程序化在線柱后衍生[46]，減少柱前預處理時間和因OPA 衍生化法衍生物穩定性差帶來的誤差。

表2 HPLC 衍生化法測定樣品中GABATable 2 Determination of GABA in samples by HPLC derivatization

3.3 液相色譜-串聯質譜法

液相色譜-串聯質譜法兼具液相色譜（LC）的高分離能力和質譜（MS）的高選擇性和靈敏度等優點[53]。相較于HPLC 法和比色法，液相色譜-串聯質譜法測定GABA 含量無需復雜的柱前衍生化操作，且能顯著縮短分析時間和提高檢測靈敏度，適用于動物組織、血漿以及腦脊液等基質中微量GABA 的定量檢測。Dai 等[53]采用高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）快速檢測腦組織中神經遞質，GABA在1 min 左右即可出峰，檢出限為1.47 ng/mL。反相超高效液相色譜串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）的應用也有報道，該法測定的腦組織和細胞外液的GABA 分別在8～4000 nmol/L 和10～1000 nmol/L范圍內線性關系良好，且僅需150 μg 的腦組織即可上樣，遠低于其他方法的上樣量[54]。液相色譜串聯質譜法同樣適用于植物組織，采用UPLC-MS/MS 對南瓜GABA 進行定性定量分析，4 min 內即可完成[55]，且分離效果良好，操作簡單方便，結果準確可靠，但由于其成本較高，目前對于植物樣本普遍采用高效液相色譜法。

4 γ-氨基丁酸主要生理功能

4.1 促睡眠作用

睡眠行為由基底前腦、丘腦和腦干中的不同神經元核團調控，而GABA 作為一種抑制性神經遞質，在調控中樞神經系統神經元興奮和抑制的平衡中起著關鍵作用，其三種受體（GABAA、GABAB和GABAC）上的變構位點可以高精度地調節大腦相關區域中神經元的抑制水平，這些位點同時也是催眠藥物的分子靶點[56-58]。研究表明，外源攝入的GABA可以進入血液，人體口服GABA 30 min 后血液中的GABA 即達到最高水平，但有關GABA 能否穿透血腦屏障仍是一個具有爭議的問題，目前沒有直接證據表明GABA 可在人體中穿透血腦屏障并對大腦產生作用[59-60]。但GABA 可通過腸-腦軸中迷走神經途徑對中樞神經系統中的GABA 含量水平及受體表達產生影響，小鼠口服GABA 后，其GABA 能神經遞質的mRNA 和蛋白質表達水平明顯上調，特別是腸道和大腦，GABAA水平分別提高7 倍和5 倍[61]。除此之外，GABA 還能通過神經內分泌途徑、免疫途徑等腸-腦軸雙向交流途徑改善睡眠[62]。有關外源攝入GABA 發揮促睡眠作用的研究也多有報道，口服短乳桿菌發酵產生的γ-氨基丁酸（100 mg/kg）能使小鼠入睡時間縮短32.2%，睡眠時長延長59%；在咖啡因誘導的失眠條件下，可以增加大鼠非快速眼動睡眠時間（NREM）[61]。此外，口服GABA 也可以影響人體睡眠的早期階段，顯著縮短睡眠潛伏期，增加非快速眼動睡眠時間[59]。

4.2 抗焦慮、抗抑郁

病理生理學認為與焦慮癥和抑郁癥的產生與GABA 中樞神經系統的功能紊亂有顯著關聯，抑郁癥患者的血漿、腦脊液以及枕葉皮層中GABA 濃度低于正常人群，而經電驚厥療法（ECT）治療后，相關部位GABA 濃度有所增加也證實了這一點[63-64,67]。參與調控焦慮的神經回路主要是由GABA 能中間神經元組成的抑制性網絡，神經元的抑制水平受到GABAA受體上的異生作用位點的調控，這些特異性結合位點也是通常作為抗驚厥、抗焦慮和抗抑郁藥物的分子靶點[65-66]。而GABA 能通過與GABAA受體結合而打開特定氯離子通道以及導致神經元的超極化和分路抑制，使神經元處于保護性抑制狀態，阻止與焦慮相關的信號抵達大腦指示中樞[65]。此外，GABA 對焦慮/抑郁的調控也涉及神經內分泌系統，口服低劑量（0.75 mg/g/d）或高劑量（1.5 mg/g/d）酪蛋白水解物和GABA 復合物可上調小鼠下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激素分泌，緩解海馬體CA3 區域的組織病變，顯著改善小鼠焦慮/抑郁行為[66]。盡管目前的研究顯示GABA 具有很好的改善焦慮和抑郁癥狀的效果，僅食用富含GABA 的淡豆豉即可使小鼠快感缺失、行為絕望等抑郁癥狀得到改善[68]，但關于其在體內復雜的作用機制、藥代動力學、最佳給藥方案和臨床效果等相關研究仍有待深入探討。

4.3 降血糖

GABA 在其他外周組織中也有分布，如腎上腺髓質、胰腺和子宮等[69]。胰腺β細胞所產生的GABA是胰腺激素釋放的功能性調節劑[70]，可引起胰腺α細胞超極化和β細胞的去極化，從而抑制胰高血糖素和促進胰島素的分泌來調節血糖[69]。同時，GABA受體的激活可以抑制免疫激活和巨噬細胞炎癥細胞因子的分泌，調節葡萄糖穩態、減少糖尿病并發癥的發生[71]。此外，胰腺等外周器官對葡萄糖的調節活動受到中樞神經系統的協調，通過自主神經系統調控包括GABA 在內的神經遞質和神經肽的釋放來控制激素分泌、糖原合成和代謝[72]。GABA 給藥（1.5 g/kg/d）可通過影響Ⅱ型糖尿病大鼠及其后代的胰島素信號傳導和糖異生途徑來降低胰島素抵抗（IR）[70]。除此之外，負載了GABA 的殼聚糖納米顆粒也可通過保護胰腺β細胞改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的血糖指數[73]。臨床數據同樣顯示口服GABA 可改善健康受試者的胰島素和C 肽水平，靜脈注射GABA也可以降低糖尿病患者的血糖，但不能降低正常受試者的血糖[69]，同時，由于GABA 可在機體內代謝分解，具有較高的安全性，在目前許多降糖藥物易引發低血糖、過敏反應或其他不良反應的情況下，GABA作為新型降糖藥在預防和治療糖尿病方面具有極大的潛力。

4.4 降血壓

中樞神經系統在調節心血管穩態中發揮重要作用，主要涉及下丘腦室旁核（PVN）、延髓頭端腹外側區（RVLM）、延髓孤束核（NTS）和延髓尾端腹外側區（CVLM）等[74]。延髓孤束核（NTS）是壓力感受器傳入纖維的一個終止位點，壓力感受器介導的孤束核神經元的激活可進一步激活延髓頭端腹外側區的GABA 能神經元釋放大量GABA，最終導致交感神經傳出減少，血壓降低[75]。在下丘腦室旁核和延髓頭端腹外側區中注射GABA 受體拮抗劑可引發不同程度的交感神經興奮的研究結果也證實了這一點[76]。大量研究表明GABA 具有良好的降血壓效果，對大鼠十二指腸內給予GABA（0.3～300 mg/kg）在30～50 min 內能夠引起劑量依賴性的血壓降低[77]；輕度高血壓成年患者補充適量GABA 也可降低血壓，且沒有出現身體不適的狀況[78]。食用高GABA 含量的食物同樣可以達到降壓效果，自發性高血壓大鼠口服富含GABA 的酸奶（0.1 mg GABA/kg）8 h 后收縮壓降低65.22 mmHg[79]，這種通過日常飲食攝入富含GABA 的食物來調節血壓的方法或可為預防高血壓提供新途徑。

4.5 其他生理功能

GABA 對提高腦部活力也有具有明顯作用，如改善記憶和認知功能，海馬體神經元突觸間隙釋放的GABA 通過激活GABA 受體并介導強直抑制性傳導來調節記憶和神經興奮性疾病[80]；刺激GABA能神經元也可以改善阿爾茨海默癥小鼠大腦局部場電位節律和記憶的形成[81]；此外，口服GABA 能夠上調小鼠海馬體中與記憶功能相關的基因的表達從而對大腦功能產生影響[82]。GABA 與可卡因成癮行為也有密切關聯，當特異性減少對中腦腹側被蓋區（VTA）GABA 能神經元的強直性抑制可以減弱成癮行為效應[83]。GABA 還具有利尿排鈉、調節血清中的脂質水平、改善肝腎等多種功能，以及作為潛在的癲癇治療藥物。值得一提的是，最近的研究結果突破了一直以來認為的GABA 作為神經遞質發揮作用的思維，GABA 通過介導β-catenin 的激活來刺激腫瘤細胞的增殖，并抑制CD8 T 細胞的瘤內浸潤，這或可在藥理學上靶向逆轉腫瘤免疫抑制，成為癌癥治療的新靶點[84-85]。

5 結論與展望

γ-氨基丁酸作為動植物體內普遍存在的氨基酸，來源廣泛，轉化合成制備工藝簡單，其物質本身穩定性高、水溶性極強且具有良好的復配性，同時由其具有特殊的生理活性，在改善睡眠、緩解焦慮和抑郁、降低血壓血糖等方面具有良好功效。然而，由于GABA 在生物體內作用的特殊性，目前尚有許多作用機理亟待深入探討，結合目前國內外的研究成果，同時為進一步提高GABA 的利用度，建議從以下方面著手：a.優化GABA 合成方法。考慮到植物富集效果不強，傳統發酵法創新性不足，應進一步優化植物脅迫富集方法，利用各種誘導手段篩選高產GABA菌種并擴大生產，降低生產成本、簡化生產工藝。b.建立簡單精準的GABA 檢測方法。現有GABA檢測方法操作繁瑣，部分方法檢測精確度不高，可通過改進設備實現自動化檢測以簡化檢測流程，同時探尋新興檢測技術，如利用納米材料與氨基酸的相互作用來實現檢測。c.進一步深入挖掘GABA 生物活性。GABA 在生物體內代謝錯綜復雜，有關GABA及其受體作用的機制也尚未明了，其生物活性和藥理作用有待進一步挖掘。d.加強GABA 新型產品和藥物的開發。目前富含GABA 的糧食制品和乳制品等已流通于市場，有關功能性調味品和茶飲、抗抑郁藥物的研發也有報道，有針對性地開發適合不同人群的功能性產品是未來GABA 資源開發的方向，也是未來研究的關鍵問題。