基于核酸擴增-側(cè)流層析試紙的食源性致病菌快速檢測研究進展

贠紫光，魏 勇，張 建，崔雙雙，李 燦，孫鳳霞,,

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特色農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室（部省共建），石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；2.食品營養(yǎng)與安全控制兵團重點實驗室，石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；3.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 830063）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年有近十分之一的人因食物受污染而生病，而這些患食源性疾病的患者中70%是由致病性微生物所引起的[1-2]。常見的食源性致病菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌等，對公共衛(wèi)生安全埋下巨大隱患的同時也對食品產(chǎn)業(yè)和社會造成經(jīng)濟損失。全球多個國家都制定了各種食品基質(zhì)中食源性致病菌限制標準，我國針對預(yù)包裝食品和散裝即食食品，也新發(fā)布了兩項有關(guān)致病菌限量的食品安全國家標準，使得食源性致病菌檢測的標準體系更加完善，分類更加細化。更加細致嚴格的標準維護了消費者食用時的公共衛(wèi)生安全，而降低食源性致病菌對食品產(chǎn)業(yè)和社會造成的經(jīng)濟損失并從源頭上解決問題，則需要準確、快速、高效的食源性致病菌檢測方法。

目前，我國食源性致病菌檢測主要依據(jù)GB 4789 系列標準，檢測方法以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，具有檢測準確性高、結(jié)果可靠等優(yōu)點，是食源性致病菌檢測的金標準，但檢測耗時長、費時費力，難以應(yīng)對現(xiàn)代食品安全快速檢測的要求?；诤怂釘U增的分子生物學(xué)方法因其檢測效率高、準確性強、特異性高被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測中，主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)法（Polymerase chain reaction，PCR）、等溫核酸擴增法、基于成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein，CRISPR/Cas）的檢測技術(shù)等，但這些方法大多存在無法實現(xiàn)可視化、便攜化檢測等弊端。近年來，研究者們將核酸擴增與其他檢測方法聯(lián)用來改進和完善檢測性能，其中和側(cè)流層析試紙技術(shù)聯(lián)用的研究最為廣泛。側(cè)流層析試紙檢測技術(shù)具有操作簡單、結(jié)果可視化、成本低廉等優(yōu)點，在食源性致病菌現(xiàn)場快速檢測中具有巨大的應(yīng)用潛力。本文綜述了多種基于核酸擴增-側(cè)流層析試紙的檢測體系及其在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用進展，并提出該聯(lián)用技術(shù)在食源性致病菌快速檢測領(lǐng)域的發(fā)展方向，以期為食源性致病菌的檢測和防控提供方法參考。

1 基于PCR-側(cè)流層析試紙檢測食源性致病菌

PCR 是基于核酸檢測食源性致病菌最常用的技術(shù)手段，通過模擬生物機體內(nèi)DNA 的復(fù)制過程，經(jīng)過變性－退火－延伸的循環(huán)，使得DNA 分子在生物體外擴增，基于目標菌的保守基因設(shè)計引物使其具有特異性，從而有效鑒定目標菌[3]。PCR 技術(shù)靈敏度高、特異性強、快速簡便，并因其可以用來檢測一些難以培養(yǎng)或人工無法培養(yǎng)的微生物，檢測范圍和能力都占有優(yōu)勢，在食源性致病菌檢測中得到廣泛應(yīng)用，主要包括單重PCR、多重PCR 及熒光定量PCR 等方法。賈方芳等[4]針對兔源性沙門氏菌的invA基因設(shè)計兩對引物，分別建立單重PCR 檢測方法，檢出限分別為0.118、1.180 pg/μL，準確率達100%，實驗結(jié)果表明，合理的引物設(shè)計與選擇直接影響PCR 檢測方法靈敏度，是PCR 檢測方法的基石；王仕成[5]建立了同時檢測牛乳中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、停乳鏈球菌、的多重PCR 檢測方法，檢測靈敏度分別為1、1、1 pg/μL 及100 fg/μL，節(jié)省了大量檢測時間，提高了檢測效率，可以有效降低檢測成本；陳秀琴等[6]建立了大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的多重?zé)晒舛縋CR 檢測方法，可有效避免普通多重PCR 產(chǎn)物之間的交叉污染。然而，上述方法檢測結(jié)果的呈現(xiàn)需要電泳、配套紫外或熒光檢測等，存在檢測時間較長、不便于現(xiàn)場檢測等弊端，如何快速方便的對PCR 檢測結(jié)果進行判讀成為需要解決的實際問題。2022 年10 月1 日，中華人民共和國海關(guān)總署頒布了SN/T 5439-2022《出口食品中食源性致病菌快速檢測方法 PCR-試紙條法》，首次建立了PCR-試紙條法檢測大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等7 種常見食源性致病菌的行業(yè)標準[7-13]，食源性致病菌PCR-側(cè)流層析試紙聯(lián)用檢測方法成為研究熱點，根據(jù)側(cè)流層析試紙中標記物的不同，主要有PCR-金標層析試紙和PCR-熒光層析試紙。

1.1 PCR-金標層析試紙檢測方法

以膠體金為標記物的膠體金試紙條在PCR-側(cè)流層析試紙中應(yīng)用最為廣泛，PCR 產(chǎn)物在試紙條上結(jié)果呈現(xiàn)常依據(jù)雙抗夾心法原理進行設(shè)計[14-15]，如圖1 所示，首先在上下游PCR 引物兩端分別修飾生物素和地高辛，金納米粒子作為標記物標記抗地高辛抗體制備金標抗體，并預(yù)先噴涂在結(jié)合墊上。檢測線（T 線）上固定鏈霉親和素，質(zhì)控線（C 線）上固定羊抗鼠二抗。當(dāng)待測樣本中有目標菌時，PCR 擴增產(chǎn)物為一端標記生物素，另一端標記地高辛的雙螺旋DNA，待測物流經(jīng)結(jié)合墊時通過地高辛抗原抗體識別作用形成金標-PCR 擴增產(chǎn)物復(fù)合物，到達T 線時通過生物素-鏈霉親和素特異結(jié)合作用形成紅色條帶，剩余的金標-PCR 擴增產(chǎn)物復(fù)合物繼續(xù)層析到達C 線被羊抗鼠二抗結(jié)合，此時T 線和C 線均顯示出紅色條帶，即為陽性結(jié)果；當(dāng)待測樣本中沒有目標菌時，則PCR 擴增產(chǎn)物不存在，T 線因無法捕捉膠體金而不顯色，C 線通過羊抗鼠二抗結(jié)合抗地高辛抗體來捕捉金粒子得以顯色，即為陰性結(jié)果；通過試紙條上T 線的有無可實現(xiàn)食源性致病菌的定性檢測。

圖1 PCR-試紙條法檢測食源性致病菌原理圖Fig.1 Principle diagram of PCR-test strip method for detection of foodborne pathogens

基于此原理制備的PCR-金標層析試紙條，可以用于對食源性致病菌的早期檢測和流行病學(xué)篩查[16]，避免染料及紫外光對實驗員造成的危害并可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測[17]。Singh 等[18]利用5’-熒光素氨基磷酸酯（Fluorescein aminophosphate，F(xiàn)AM）和生物素對耶爾森菌的特異性上下游引物進行標記，建立的PCR-金標層析試紙可用于檢測人血樣本中的耶爾森菌，靈敏度可達104CFU/mL。陳詩勝等[19]利用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate isomer I，F(xiàn)ITC）和地高辛對上下游引物的5’端進行標記，以抗FITC 抗體標記膠體金顆粒，在T 線和C 線上分別固定抗地高辛抗體和羊抗鼠二抗，分別研制出無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌的PCR-金標層析試紙條，除大腸桿菌外，其他3 種菌的試紙條均比凝膠電泳法的檢測靈敏度提高了10 倍，表明PCR-金標試紙法可適用于食源性致病菌的篩查和檢測，并能顯著提高檢測靈敏度。

為應(yīng)對多種食源性致病菌的同時檢測，Nor等[20]針對井水樣中三種不同類型的沙門氏菌建立了多重PCR-金標層析試紙法，利用內(nèi)標排除假陰性的可能，結(jié)果表明，580 份水樣利用多重PCR-金標層析試紙法共檢測出15 份樣本呈傷寒沙門氏菌陽性，而傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR-凝膠電泳法只檢測出1 份陽性樣本，多重PCR-金標層析試紙法的致病菌檢出率和檢測效率更高。侯巧華[21]首先建立了大腸桿菌和沙門氏菌雙重PCR 檢測體系，根據(jù)PCR 擴增產(chǎn)物分別設(shè)計兩對特異性DNA 探針，一條探針5’標記生物素，另一條探針的3’分別標記FAM 和地高辛，將雙重PCR 擴增產(chǎn)物和兩組探針混合均勻95 ℃處理5 min，56 ℃處理3 min 互補結(jié)合，進行試紙條雙重檢測（如圖2），若檢測線1 顯色，表明樣品中含有大腸桿菌；若檢測線2 顯色，表明樣品中含有沙門氏菌；若檢測線1、2 均顯色，則同時含有大腸桿菌和沙門氏菌，該方法檢測靈敏度可達10 CFU/mL，證明了PCR-金標層析試紙在食源性致病菌多重檢測中的應(yīng)用潛力。另外，為消除死菌DNA 對PCR 檢測結(jié)果的干擾，避免死菌引起假陽性，Kim 等[22]針對大腸桿菌O157:H7 的stx2基因和鼠傷寒沙門氏菌的his操縱子基因分別設(shè)計特異性引物，上游引物5’分別標記地高辛和FAM，下游引物3’標記生物素，結(jié)合單氮化丙啶（Propidine mononitride，PMA）抑制PCR 中死細菌DNA 擴增的特點，建立了同步檢測活的大腸桿菌O157:H7 和鼠傷寒沙門氏菌的mPCR-雙重層析試紙檢測方法，對大腸桿菌O157:H7 和鼠傷寒沙門氏菌的檢測限分別為102、101CFU/25 g，且不需要培養(yǎng)富集即可直接檢測致病菌。PCR-金標層析試紙條操作簡單、應(yīng)用范圍廣，可實現(xiàn)可視化檢測，對食源性致病菌現(xiàn)場檢測的普及具有重要意義。

圖2 多重PCR-層析試紙條檢測原理圖[21]Fig.2 Principle diagram of multiplex PCR-chromatographic test strip detection[21]

1.2 PCR-熒光層析試紙法

熒光微球（Fluorescentmicrosphere，F(xiàn)Ms）是一種發(fā)射光譜類的新型標記物，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，分散性好、偶聯(lián)效率高，常通過在微球內(nèi)部螯合稀土元素等微小顆粒或利用物理、化學(xué)方法在微球表面標記熒光物質(zhì)制備，受外界能量刺激激發(fā)熒光，根據(jù)熒光強度的變化定量檢測待測物[23]。以熒光微球為標記物制備的熒光層析試紙，檢測原理同金標層析試紙條類似，且可以消除背景干擾，進一步提高檢測靈敏度。滕軍[24]針對大腸桿菌O157:H7 的毒力基因rfb設(shè)計特異性引物，在上下游引物分別修飾FITC 和生物素，F(xiàn)Ms 標記抗FITC 抗體，T 線上固定鏈霉親和素，C 線上固定羊抗鼠二抗，建立PCR-熒光層析試紙檢測方法，其靈敏度達到3 CFU/mL，比傳統(tǒng)的PCR凝膠電泳方法檢測限降低100 倍，比PCR-金標層析試紙條的檢測限降低10 倍，檢測時間由30 min 縮減為10～15 min。

熒光微球在實際檢測中往往會受到食品基質(zhì)的干擾，時間分辨熒光微球是一種特殊功能的熒光微球，其內(nèi)部包埋了稀土鑭系元素，在紫外光下發(fā)射特殊的熒光，比普通熒光斯托克斯位移大且熒光壽命延長5～6 個數(shù)量級，通過時間延遲和波長的分辨，可以有效消除樣品中本底熒光、激發(fā)光等非特異性熒光的干擾，進一步提高靈敏度。馮瑤[25]制備了膠體金試紙條和時間分辨熒光層析試紙條用于B 族鏈球菌的檢測，檢測靈敏度分別為105、103CFU/mL，表明時間分辨熒光層析試紙條靈敏度較膠體金試紙條更高。Wang 等[26]利用鑭系熒光微球標記抗大腸桿菌O157:H7 單克隆抗體，制備了大腸桿菌O157:H7 時間分辨熒光層析試紙條，降低了肉制品中本底熒光對檢測結(jié)果的影響，靈敏度高、抗干擾能力強，視覺檢測限為104CFU/mL，結(jié)合試紙條閱讀器其檢測限低至102CFU/mL。然而目前報道的食源性致病菌時間分辨熒光層析試紙均為基于抗原抗體免疫分析，利用時間分辨熒光微球制備PCR-時間分辨熒光層析試紙條或?qū)⒊蔀樘岣呤吃葱灾虏【鷻z測靈敏度的新方向。

PCR-側(cè)流層析試紙條通常只能實現(xiàn)對目標物的定性或半定量分析，結(jié)合讀數(shù)裝置如智能手機上的分析軟件可實現(xiàn)定量分析（圖3）。智能手機成像能力強，體積小便于攜帶，通過智能手機拍照，結(jié)合讀數(shù)裝置的視覺識別技術(shù)，將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，借助智能手機軟件的計算能力定量分析數(shù)據(jù)，可以有效避免因光照強度、肉眼偏差等客觀與主觀因素對檢測結(jié)果的誤判。Jung 等[27]開發(fā)了一個智能手機內(nèi)部應(yīng)用程序，采用灰度化模式處理圖像，有效提取試紙條上的顯色信息，成功檢測出牛肉中104CFU/mL 和菠菜中105CFU/mL 的大腸桿菌O157:H7，表明借助智能手機可實現(xiàn)側(cè)流層析試紙條定量檢測，為試紙條檢測結(jié)果的判定提供了一種更加客觀準確的方法。王月[28]基于PCR 核酸修飾技術(shù)結(jié)合核酸試紙條，建立了鼠傷寒沙門氏菌PCR-側(cè)流層析試紙檢測方法，利用智能手機對試紙條進行拍照后使用Image J 和Origin 軟件進行統(tǒng)計分析，通過T 線和C 線峰面積的比值即可確定出不同濃度菌液在試紙條上顏色信號的變化，檢測結(jié)果與瓊脂糖檢測結(jié)果一致，檢測限可達233 CFU/mL，有效解決了肉眼難以判別試紙條顯色淺、條帶模糊的難題，保障實驗精確性。

圖3 基于智能手機的免疫層析定量分析[27]Fig.3 Smartphone-based immune chromatography quantitative analysis[27]

PCR 法作為分子檢測的黃金標準，重復(fù)性好、靈敏度高、適用性廣，但需要電泳、顯色等步驟，對儀器依賴性強，難以進行現(xiàn)場檢測。將PCR 和側(cè)流層析試紙技術(shù)相結(jié)合并進一步改進和優(yōu)化，可以較好解決此類問題。PCR-金標層析試紙法、PCR-熒光層析試紙法都可用于快速高效地檢測食源性致病菌，金標層析試紙法易受基質(zhì)干擾，不穩(wěn)定因素多，靈敏度受限。相對而言，熒光層析試紙法更為穩(wěn)定，因發(fā)射光譜的多樣性可以實現(xiàn)多指標的同時檢測，靈敏度也比金標層析試紙要高。但若只是需要簡單的定性，金標層析試紙不需要儀器設(shè)備，成本低，用肉眼即可判別，且膠體金幾乎可以標記所有蛋白分子，更加便于推廣普及。

2 基于等溫核酸擴增-側(cè)流層析試紙檢測食源性致病菌

等溫核酸擴增技術(shù)是一種在恒定溫度下擴增核酸的分子學(xué)檢測技術(shù)，相比于PCR，等溫核酸擴增技術(shù)反應(yīng)時間短，對精密儀器及實驗室場所的依賴少，僅需憑借簡單的熱源或水浴鍋輔助即可實現(xiàn)核酸擴增，在降低成本上有顯著優(yōu)勢。主要包括環(huán)介導(dǎo)擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA）、交叉引物擴增（Crossing priming amplification，CPA）、滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）以及解旋酶依賴性擴增（Helicase-dependent amplification，HDA）等技術(shù)，5 種技術(shù)的區(qū)別如表1所示，RCA 及HDA 反應(yīng)時間相對較長，LAMP 及CPA 對引物的需求更大，RPA 在反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及所需引物上都有很大優(yōu)勢，在食源性致病菌檢測方面具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

表1 5 種等溫核酸擴增技術(shù)的對比Table 1 Comparison of 5 isothermal nucleic acid amplification techniques

2.1 LAMP-層析試紙法

LAMP 是目前研究最多的一種等溫核酸擴增技術(shù)，通過針對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計4 種特異性引物擴增核酸，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。近年來，研究者常將其與可視化層析試紙條結(jié)合應(yīng)用來提升檢測靈敏度[34]。Zhang 等[35]直接將LAMP微反應(yīng)管連接到側(cè)流層析試紙條上，簡化設(shè)備操作，避免氣溶膠產(chǎn)生，成功檢測出樣品中低至10 fg 的沙門氏菌基因組DNA。Jiang 等[36]利用多重LAMP結(jié)合層析試紙法，在57 min 內(nèi)實現(xiàn)了嬰幼兒配方奶粉中3 種食源性致病菌的同時檢測，檢出限小于10 CFU/mL。Wen 等[37]采用免疫磁珠對目標菌進行富集，利用PMA 鑒別死菌活菌，建立LAMP-金標層析試紙法實現(xiàn)了對生菜中的E.coliO157:H7 活菌進行檢測。

上述LAMP-層析試紙研究中主要以膠體金為標記物，往往存在穩(wěn)定性不高、靈敏度低、易受外界干擾等缺點。納米酶是一類既有納米材料的獨特性能又有催化功能的模擬酶[38]。目前納米酶可模擬的催化活性主要包括類過氧化物酶活性、類過氧化氫酶活性、類超氧化物歧化酶活性、類氧化酶活性、類核酸酶活性及類蛋白酶活性等，且一種納米酶可以同時擁有多種天然酶的活性，如氧化鐵納米酶同時兼具過氧化物酶和過氧化氫酶兩種活性。隨著納米材料的興起，納米酶材料的種類也越來越多，應(yīng)用于層析試紙條的有金屬氧化物、貴金屬、碳材料及金屬有機框架材料等。納米酶利用生物效應(yīng)催化天然酶底物顯色，可以增強試紙條檢測信號，有效解決了傳統(tǒng)膠體金免疫試紙條檢測靈敏度低的問題，具有催化效率高、穩(wěn)定、低成本和可規(guī)?；苽涞奶攸c[39]，以納米酶為標記物制備層析試紙條，分散性更好、靈敏度更高，發(fā)展?jié)摿V闊。

Zhang 等[40]利用貴金屬納米酶與3,3'-二氨基聯(lián)苯胺/過氧化氫（DAB/H2O2）酶促底物之間的酶促反應(yīng)來放大檢測信號，以Fe3O4納米酶代替膠體金作為標記物對側(cè)流層析試紙進行酶修飾，針對阪崎克羅諾桿菌的ompA基因設(shè)計LAMP 引物，其中內(nèi)引物FIP 的5’端修飾生物素，BIP 的5’端修飾FITC，試紙條的T 線和C 線分別包被1 mg/mL 抗FITC 抗體和抗小鼠IgG，結(jié)合PMA 區(qū)別死菌活菌特點，建立了一種基于PMA、LAMP-納米酶層析試紙的連續(xù)級聯(lián)納米酶生物傳感器，可在1 h 內(nèi)實現(xiàn)10 CFU/mL阪崎克羅諾桿菌活菌的檢測，有效提高了免疫層析試紙的靈敏度。此外，在食品生產(chǎn)、加工、流通過程中，常常有一些食源性致病菌附著于器物表面形成生物被膜，腐蝕儀器設(shè)備，對環(huán)境抵抗力強不易去除，引發(fā)二次污染，對食品安全造成潛在危害。對此，Shi 等[41]針對單增李斯特菌hlyA基因設(shè)計LAMP 引物，其中FIP 引物的5’端修飾FITC，BIP 引物的5’端修飾生物素，利用Fe3O4做為標記物偶聯(lián)抗生物素抗體制備納米酶探針，結(jié)合PMA 抑制死菌DNA 擴增的特點，研制出PMA-LAMP-納米酶層析試紙（圖4），用于檢測不銹鋼器具及生菜中的單增李斯特菌生物被膜，檢測限分別為1.164×101、1.021×101CFU/mL，對大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌等無交叉反應(yīng)，所研制的納米酶層析試紙具有靈敏度高、特異性強等特點。

圖4 檢測單增李斯特菌的LAMP-納米酶層析試紙原理示意圖[41]Fig.4 Principle diagram of LAMP-nanozyme chromatography test paper for detecting Listeria monocytogenes[41]

2.2 RPA-層析試紙法

RPA 技術(shù)以T4 噬菌體核酸復(fù)制機制為原理，在三種關(guān)鍵蛋白與DNA 聚合酶、聚集劑及鹽類分子等物質(zhì)的共同作用下實現(xiàn)對DNA 特定區(qū)域的指數(shù)擴增[42]，該技術(shù)對設(shè)備要求低，不需DNA 解鏈過程，是繼LAMP 后應(yīng)用最為廣泛的等溫核酸擴增技術(shù)。與LAMP 相比，RPA 更適合多路復(fù)用，實現(xiàn)多核酸擴增，結(jié)合側(cè)流層析試紙條進一步實現(xiàn)對擴增產(chǎn)物的可視化判別。

葛志毅等[43]根據(jù)布魯氏菌特異基因的保守序列設(shè)計引物和RPA 探針，用生物素修飾下游引物，F(xiàn)AM 修飾RPA 探針，38 ℃反應(yīng)10 min 后進行試紙條檢測，檢測布魯氏菌敏感性能達到10-5（8 拷貝），與實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果符合率高，特異性良好，操作簡單快速，可實現(xiàn)布魯氏菌的野外現(xiàn)場檢測。Fu 等[44]分別利用地高辛和生物素修飾腸炎沙門氏菌的特異性上下游引物，在金納米表面包被鏈霉親和素制備金標復(fù)合物并噴涂在結(jié)合墊，在試紙條的T 線固定抗地高辛抗體，C 線固定抗鏈霉親和素抗體，借助RPA 擴增目標核酸片段后，利用試紙條呈現(xiàn)等溫擴增結(jié)果（圖5），該方法檢出限為91.4 CFU/mL，具有定量快、成本低、可快速保存每個樣品數(shù)據(jù)等優(yōu)點。厲佳麗[45]針對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌分別設(shè)計了三種特異性RPA 引物，上游引物分別使用生物素、羧基熒光素、Cy5 進行標記，下游引物均標記地高辛，以抗地高辛單克隆抗體標記膠體金，優(yōu)化多重RPA 反應(yīng)體系，結(jié)合膠體金讀數(shù)儀實現(xiàn)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的同時快速檢測，檢測限可達10 CFU/mL，實現(xiàn)了實際樣本中食源性致病菌多靶標同步快速定性定量檢測，極大提升檢測效率。

圖5 沙門氏菌RPA-層析試紙檢測示意圖[44]Fig.5 RPA-chromatographic test strip process diagram for detecting Salmonella[44]

2.3 CPA-層析試紙法

LAMP 在反應(yīng)中會產(chǎn)生未知大小擴增子的長結(jié)構(gòu)，使檢測過程復(fù)雜化，易發(fā)生假陽性和背景擴增反應(yīng)。CPA 技術(shù)是一種新型的等溫擴增技術(shù)，受到研究者們的廣泛關(guān)注，具有高度特異性及敏感性，能夠快速靶擴增[46]。如圖6A 所示[47]，其原理是通過4/5 條引物雙交叉擴增/單交叉擴增核苷酸序列，反應(yīng)依賴于甜菜堿、交叉引物和Bst DNA 聚合酶。

圖6 CPA-層析試紙檢測示意圖[47-48]Fig.6 Schematic diagram of the CPA-chromatographic test trip detection[47-48]

目前CPA 技術(shù)的發(fā)展仍受限于結(jié)果的高效判讀和可視化顯示，如圖6B 所示[48]，將核酸層析試紙引入CPA 法中可以打破這種限制。向勇[49]針對銅綠假單胞菌的特異性基因oprI設(shè)計1 組5’端標記FAM 和生物素的CPA 交叉擴增引物，在62 ℃恒溫擴增45 min 后，使用核酸檢測試紙條進行可視化檢測，其靈敏度是常規(guī)PCR 檢測方法的100 倍，同時CPA 的密閉管設(shè)計能有效避免氣溶膠污染，保證結(jié)果直觀客觀，特別適用于戶外和基層醫(yī)療單位，是檢測銅綠假單胞菌的理想系統(tǒng)。Wang 等[50]基于印第安納腸炎沙門氏菌設(shè)計了6 條引物，包括2 條置換引物、2 條交叉引物和2 條檢測引物，2 條檢測引物的5’端分別用生物素和6-FAM 標記，63 ℃水浴擴增1 h 后，將CPA 擴增產(chǎn)物滴加于一次性核酸試紙，檢測靈敏度為8.997 fg/μL，比實時熒光PCR 高10 倍，比常規(guī)PCR 高100 倍，在預(yù)防印第安腸炎沙門氏菌中表現(xiàn)出巨大潛力；劉敏[51]以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板，用1 對外引物、1 對交叉引物及2 條分別用FITC 和生物素標記的探針，在63 ℃恒溫擴增60 min，結(jié)合核酸試紙條判定檢測結(jié)果，建立的CPA-層析試紙檢測蠟樣芽孢桿菌的方法特異性強，可用于進出境口岸現(xiàn)場蠟樣芽胞桿菌的快速篩查。

2.4 RCA-層析試紙法

RCA 是一種簡單高效的體外核酸擴增技術(shù)，是借鑒自然界中環(huán)狀病原生物體DNA 分子滾環(huán)式復(fù)制方式發(fā)展出的一種恒溫擴增技術(shù)[52]，和LAMP 和CPA 相比，在引物設(shè)計上相對簡單。Qin 等[53]針對海洋卡頓藻建立了雙探針滾環(huán)擴增體系，結(jié)合試紙條實現(xiàn)檢測結(jié)果的可視化，其對海洋卡頓藻DNA 的檢出限為8.3×10-3ng/μL，為其他藻類可視化快速檢測提供方法借鑒，如Liu 等[54]利用相同原理成功建立了雙探針滾環(huán)擴增-層析試紙法并應(yīng)用于劇毒卡爾藻的快速檢測。在食源性致病菌檢測方面，RCA-層析試紙法的研究還較少。黃夢琪等[55]建立了基于RCA的紙基顯色傳感器的單增李斯特菌hly AmRNA 可視化檢測平臺，如圖7 所示，設(shè)計的鎖式探針5’和3’分別和基因組目標序列RNA 完全互補配對，當(dāng)存在待檢測的RNA 時，連接酶就會特異性連接5’和3’，使開環(huán)的探針閉合成為一個封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以此結(jié)構(gòu)為模板，通過RCA 對單增李斯特菌的hly AmRNA進行特異性擴增，將擴增后的單鏈產(chǎn)物進一步利用Hhal 核酸內(nèi)切酶特異性切割該單鏈核酸，形成與鎖式探針長度相同的核酸單鏈片段，不經(jīng)過預(yù)變性雜交即可直接借助試紙條檢測，最優(yōu)實驗條件下檢測限低至100 pg/μL 總RNA，該方法檢測時間短，檢測成本低，不依賴大型儀器，整個反應(yīng)過程在恒溫下即可完成，顯示出RCA-層析試紙法在食源性致病菌檢測中的優(yōu)勢。

圖7 RCA-層析試紙檢測示意圖[55]Fig.7 Schematic diagram of the RCA-chromatographic test trip detection[55]

2.5 HDA-層析試紙

HDA 利用解旋酶、單鏈DNA 結(jié)合蛋白等組分模擬體內(nèi)DNA 復(fù)制過程，替代PCR 過程中變性-退火-延伸的熱循環(huán)過程[56]，從而實現(xiàn)DNA 體外恒溫擴增的技術(shù)（如圖8）[57]，和其他恒溫擴增技術(shù)相比，擴增過程簡單，檢測流程簡單，通常利用電泳、熒光、電化學(xué)等方法對HAD 擴增產(chǎn)物進行檢測[58]。目前，利用HDA 檢測食源性致病菌的研究鮮有報道，而將HDA 和層析試紙聯(lián)用的研究更為少見。王贊等[59]以沙門氏菌invA基因為目的基因設(shè)計特異性引物，優(yōu)化建立HDA 反應(yīng)體系，擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，可直接快速檢測發(fā)酵乳中沙門氏菌污染，檢出限為2.6×102CFU/g，該方法靈敏度高、特異性良好，但在簡單性和高通量檢測方面仍有不足；Du 等[60]首次將依賴嗜熱解旋酶恒溫擴增（Thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA）和免疫層析試紙相結(jié)合用于沙門氏菌檢測，正向引物5’端用地高辛修飾，反向引物5’端用生物素修飾，在引物濃度85 nmol/L，反應(yīng)溫度64 ℃，MgSO4濃度3.5 mmol/L，dNTP 濃度0.5 mmol/L 的最優(yōu)條件下進行tHDA 擴增，擴增產(chǎn)物利用膠體金層析試紙條可以實現(xiàn)可視化檢測，檢測限可達到3.1×101CFU/mL，和常規(guī)PCR法相比有效簡化了檢測步驟。

圖8 HDA 反應(yīng)原理[57]Fig.8 HDA reaction principle[57]

綜上，將等溫核酸擴增技術(shù)和側(cè)流層析試紙條技術(shù)相結(jié)合，已成功應(yīng)用于各種食源性致病菌的快速檢測中，具有檢測成本低、精密度高、定量快、可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點，推廣應(yīng)用潛力大。相比于PCR 法，等溫核酸擴增技術(shù)對溫度的要求及檢測成本都有所降低，不同的等溫核酸擴增技術(shù)結(jié)合免疫層析試紙條的效果也有所不同。LAMP-層析試紙在食源性致病菌中的應(yīng)用最廣泛，但與普通膠體金層析試紙條結(jié)合應(yīng)用時，存在標記物穩(wěn)定性差、易受外界干擾等缺點，將其與納米酶為標記物的層析試紙結(jié)合，可提高其檢測穩(wěn)定性，還可以通過催化作用增強顯色信號，進一步提高靈敏度，具有很大發(fā)展?jié)摿ΑＴ谑吃葱灾虏【嘀豅AMP 檢測體系中，多對引物存在容易導(dǎo)致引物之間的交叉反應(yīng)，多重LAMP-層析試紙檢測特異性有待提升；RPA-層析試紙則更適合進行多核酸擴增，常用作多種菌的同時檢測，檢測效率高；CPA-層析試紙能夠?qū)崿F(xiàn)快速靶擴增，檢測特異性高；RCA-層析試紙及HDA-層析試紙在引物設(shè)計方面相對簡單，但目前應(yīng)用于食源性致病菌的研究還較少，在未來可以為食源性致病菌的檢測提供更加準確、高通量檢測平臺。

3 基于CRISPR/Cas-側(cè)流層析試紙法

CRISPR-Cas 是細菌體內(nèi)基于RNA 介導(dǎo)的核酸酶切割清除外源核酸的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，CRISPR 陣列由一串重復(fù)DNA 序列和一個間隔序列組成，主要包括適應(yīng)、表達、干擾3 個階段，在表達過程中會產(chǎn)生多種Cas 蛋白，通過Cas 核酸酶實現(xiàn)對外源核酸的切割，從而達到防御目的[61]?；贑RISPR-Cas 系統(tǒng)具有識別和切割特定核酸序列的特點，不僅可以進行高效地基因編輯，還可以進行基因檢測，特別是Cas3、Cas12、Cas13 和Cas14 蛋白的反式切割活性的發(fā)現(xiàn)[62]，將CRISPR/Cas 系統(tǒng)和等溫核酸擴增、側(cè)流層析試紙、比色法、熒光法、電化學(xué)法等技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了許多高靈敏、快速、可視化檢測方法[63]，其中CRISPR/Cas 系統(tǒng)和側(cè)流層析試紙的結(jié)合應(yīng)用最為引人矚目，成為近年來病原菌檢測領(lǐng)域的研究熱點，為食源性致病菌檢測提供了新的思路。

病原菌核酸檢測中常用的Cas 核酸酶主要包括兩類：一類是可以切割RNA 鏈的Cas13a 和Cas13b；一類是可以切割DNA 鏈的Cas12a 和Cas14。Cas12a和Cas13 除了切割靶向核酸序列之外，還可以切割其他核酸序列，利用這種附加核酸酶特性，結(jié)合PCR 或等溫核酸擴增技術(shù)實現(xiàn)病原菌核酸快速檢測，而可以切割雙鏈DNA 的主要是CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，和試紙條結(jié)合實現(xiàn)檢測結(jié)果呈現(xiàn)如圖9 所示，報告探針標記和試紙條上T 線、C 線的標記類似于PCR-側(cè)流層析試紙條法的檢測原理。Mukama 等[64]報道了一種基于LAMP 和CRISPR/Cas12 系統(tǒng)的核酸免疫層析試紙條，實現(xiàn)銅綠假單胞菌?；D(zhuǎn)移酶基因的高靈敏和高特異性檢測，研究人員首先在65 ℃下LAMP 擴增靶標基因，產(chǎn)生的擴增片段與Cas12 特異性識別激活其反式切割活性，產(chǎn)生大量帶有生物素標記的ssDNA；合成AuNP-鏈霉親和素（Streptomyces avicllrdi，SA）探針并固定在試紙條的金標墊上，試紙條T 線上固定ssDNA 的互補系列，生物素標記的抗體固定在C 線上，當(dāng)靶標DNA 存在時，AuNP-SA 探針和生物素標記的ssDNA 首先形成AuNP-SA-biotin-ssDNA 探針，修飾ssDNA 互補系列的T 線捕獲上述探針，多余的AuNP-SA 探針與C 線上的生物素結(jié)合，T、C 線同時顯色；而沒有靶標DNA 時不會產(chǎn)生ssDNA 片段，T 線不顯色，AuNP-SA 探針直接和C 線上生物素結(jié)合而顯色。該方法檢測快速、成本低，在純樣品和復(fù)雜樣品中均可檢測低至單拷貝的銅綠假單胞菌?；D(zhuǎn)移酶基因，抗基質(zhì)干擾能力強。另外，為降低檢測成本，Zhou 等[65]以熒光量子點為信號探針標記鏈霉親和素，設(shè)計生物素-核酸探針與試紙條T 線上固定的捕獲探針互補識別，C 線上固定牛血清白蛋白（BSA）修飾的生物素探針，基于RAA 結(jié)合CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)，開發(fā)出一種新型熒光增強免疫層析試紙條，當(dāng)存在靶DNA 時，RAA 產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物激活Cas12a 的反式切割活性，使得體系中的生物素-核酸探針被降解，無法和T 線上的捕獲探針形成互補，T 線上沒有熒光信號；反之，當(dāng)沒有靶DNA 時，生物素-核酸探針和T 線上的捕獲探針形成互補，再通過鏈霉親和素和生物素作用將量子點截留在T 線產(chǎn)生熒光信號，所研制的試紙條對金黃色葡萄球菌基因組DNA 的檢測限低至75 amol/L，對培養(yǎng)液中金黃色葡萄球菌的檢測限為5.4×102CFU/mL，實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的快速高效檢測。

圖9 CRISPR/Cas-層析試紙檢測食源性致病菌原理圖[64,67]Fig.9 Principle diagram of CRISPR/Cas-chromatographic strip for detecting foodborne pathogens[64,67]

和Cas12 和Cas13 蛋白反式切割活性不同，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是由RNA 引導(dǎo)的內(nèi)切酶，通過順式切割完成對靶序列的識別及切割，且Cas9 蛋白的脫靶率低、細胞毒性低、靶向能力更強[66]。Wang等[67]以CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被特異性靶標識別激活后產(chǎn)生的非靶向單鏈作為探針雜交的模板，設(shè)計和構(gòu)建了一種新的金標核酸試紙條技術(shù)，實現(xiàn)1 h 內(nèi)對靶基因高靈敏、高特異的裸眼可視化檢測。如圖9b所示，該檢測方法首先設(shè)計并制備了兩種AuNPDNA 探針，其DNA 序列包含一個標記區(qū)、一個核酸雜交區(qū)和一個信號探針雜交區(qū)。使用生物素化引物對基因組樣品進行RPA 擴增，將生物素化的擴增產(chǎn)物與Cas9/sgRNA1 短暫孵育結(jié)合，當(dāng)有靶標DNA存在時，生成的生物素化擴增產(chǎn)物-Cas9/sgRNA1 復(fù)合物滴加到試紙條上，隨著毛細管作用在試紙條上進行遷移，當(dāng)?shù)竭_金標結(jié)合墊時，和其上標記的AuNPDNA 探針通過核酸雜交形成Cas9/sgRNA1-生物素化擴增產(chǎn)物-AuNP-DNA 探針復(fù)合物，流經(jīng)T 線時被預(yù)先包被的鏈霉親和素通過生物素-親和素作用捕獲，T 線產(chǎn)生紅色色帶；多余的AuNP-DNA 探針在C 線上和預(yù)包被的DNA 探針雜交而被捕獲，C 線顯色；當(dāng)不存在靶標DNA 時，只有C 線顯色而T 線不顯色。相較于普通免疫層析試紙法，CRISPR/Cas9-層析試紙在使用特異性引物進行基因擴增后，采用專門設(shè)計的Cas9/sgRNA 系統(tǒng)進行二次識別，可以消除擴增反應(yīng)產(chǎn)生的引物二聚體的干擾，使得CRISPR/Cas9-層析試紙在保持高靈敏度的同時還具有高特異性，幾乎不會出現(xiàn)背景信號干擾，因此即使在檢測非常低濃度的目標物時，也可以辨別檢測結(jié)果。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)同側(cè)流層析技術(shù)的結(jié)合，呈現(xiàn)出高靈敏度、高特異性的特點，目前檢測食源性致病菌主要利用CRISPR/Cas12 和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，CRISPR/Cas12 因其反式切割活性和精確的靶向功能，在CRISPR/Cas-側(cè)流層析試紙中得到廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas9 相較于CRISPR/Cas12 可以縮短檢測步驟，更適合開發(fā)多功能的基因檢測平臺。CRISPR/Cas-側(cè)流層析試紙在核酸診斷領(lǐng)域仍處于初級階段，還面臨許多挑戰(zhàn)，如CRISPR/Cas 系統(tǒng)均需預(yù)先擴增靶標核酸，操作步驟較為繁瑣；反式切割活性具有隨意性，對實現(xiàn)定量和多重檢測的難度較大；現(xiàn)有Cas 蛋白大部分依賴于前間隔序列鄰近基序序列發(fā)揮作用，對靶標序列的選擇受到限制等。為解決上述問題，CRISPR/Cas-側(cè)流層析試紙將會通過豐富Cas 蛋白種類、結(jié)合微流控單細胞富集等技術(shù)來提高其自動化程度，朝著更加智能化、便攜化發(fā)展。

4 結(jié)論

食源性致病菌是引發(fā)食源性疾病的重要原因，控制食源性致病菌、保障食品安全離不開快速檢測技術(shù)的發(fā)展?；诤怂釘U增的檢測技術(shù)在食源性致病菌檢測中發(fā)揮著重要作用。PCR 仍是目前食源性致病菌檢測中最成熟的技術(shù)，等溫核酸擴增技術(shù)在微生物檢測中日趨成熟，彌補了PCR 對應(yīng)用場景和儀器的依賴，具有檢測快速、靈敏、便捷等特點，尤其適合在基層或偏遠地區(qū)進行現(xiàn)場快速檢測，是食源性致病菌核酸檢測領(lǐng)域發(fā)展的主要方向。但和PCR 相比，等溫核酸擴增引物設(shè)計復(fù)雜、難度大，缺乏相應(yīng)的設(shè)計軟件，需要篩選優(yōu)化合理引物，且更容易因氣溶膠污染導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測靈敏度和熒光定量PCR 相比仍有一定差距。等溫核酸擴增與CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合可實現(xiàn)檢測信號二次放大，有效提升檢測靈敏度，在食源性致病菌快速檢測方面得到了一些應(yīng)用，但主要針對單一致病菌，需要和多重核酸擴增技術(shù)、多重層析試紙技術(shù)結(jié)合來提高檢測通量，實現(xiàn)多目標聯(lián)合檢測。

基于核酸擴增-側(cè)流層析試紙的食源性致病菌檢測方法，以核酸雜交為識別機理，利用標記物與其抗體特異識別和層析作用在試紙條上呈現(xiàn)檢測結(jié)果，綜合了核酸檢測的高靈敏性和層析試紙簡單方便的特點，成為食源性致病菌快速檢測領(lǐng)域的研究熱點。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步與發(fā)展，在實際應(yīng)用驅(qū)動下，生物材料、物理科學(xué)、化學(xué)材料、醫(yī)學(xué)診斷等多學(xué)科融合交叉發(fā)展，綜合利用免疫識別、核酸擴增、納米材料信號放大等方法，核酸擴增-層析試紙檢測食源性致病菌將會向更靈敏、更便利、多元化、高通量檢測的方向不斷提升與完善，推動食源性致病菌可視化現(xiàn)場檢測的進一步發(fā)展。