食源性致病菌快速檢測技術及其標準化應用研究進展

吳 鵬，孫雅和，朱旭麗，周樹華, ，張成云

（1.浙江省標準化研究院，金磚國家標準化（浙江）研究中心，之江標準化智庫，國家市場監管數字化研究與應用技術創新中心，浙江杭州 310007；2.文成縣食品藥品綜合檢測中心，浙江溫州 325399）

近年來，隨著“健康中國2030”國家戰略的有效推進以及全民健康意識的提升，食品安全得到了前所未有的重視。然而，調查數據顯示，2011～2020 年，全國共上報食源性疾病暴發事件35806 起，累計患病人數266968 人，其中由微生物引起的食源性疾病相關患病人數占比最多，高達35.69%，我國食品微生物安全形勢依然嚴峻[1]。食源性致病菌（foodborne pathogen）是指以食物為載體引起人類發生疾病的一類細菌微生物，主要有大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌等。因不同地域和飲食特征的差異，我國最常見且對公眾健康產生的影響也較大的食源性致病菌主要包含金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌和克羅諾桿菌（阪崎腸桿菌）等5 種。因此，開發出快速、靈敏、簡便、特異的食源性致病菌檢測技術并進行標準化應用推廣已成為控制食品安全問題的關鍵。

食源性致病菌的傳統檢測方法雖然較為成熟穩定，但一般主要依據致病菌形態學、生理學和生態學等特征經過菌種分離培養、生化鑒定等檢測步驟來實現定性定量，存在檢測周期長、靈敏度不高、操作繁瑣、耗費成本較高和一定概率的假陰性等缺點[2]，很難滿足企業生產加工、基層市場監管執法、公共衛生安全和海關進出口檢驗檢疫等方面應對突發食品安全事件的需求。近年來，隨著生物技術在食品安全領域的快速應用，食源性致病菌快速檢測技術也獲得了很大的發展。本文主要對目前常用的生理生化檢測技術、免疫學檢測技術、分子檢測技術等3 種食源性致病菌快速檢測技術及其標準化應用進行了研究分析，以期對我國食品微生物安全檢測領域的技術發展提供借鑒，同時為該領域的標準制定和實施應用提供理論參考。

1 食源性致病菌快速檢測技術的分類

1.1 生理生化檢測技術

生理生化檢測技術是指通過研究微生物代謝過程中產生的分子和特異物質等生物化學變化特征，從而間接得到微生物量化結果。目前應用較多的主要有以下幾種。

1.1.1 ATP 生物發光法 ATP 生物發光法是指通過ATP 與熒光素-熒光素酶結合發生化學反應所形成的熒光信號來測定三磷酸腺苷（ATP）含量的一種快速便捷的生物化學方法。ATP 是細胞內特殊的自由能載體，普遍存在于所有生物活細胞內并在一定條件下保持含量穩定，因此通過ATP 在樣品中的濃度可推算活菌數。ATP 生物發光法本質上是將化學能通過生理生化反應轉化為光能，利用ATP 濃度與熒光強度呈正相關從而定量其濃度，通過即時反饋和定量有機污染，ATP 生物發光可以成為食品企業使用的有效監測工具[3-4]。該法在食品中微生物尤其是大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌的測定中應用非常廣泛。Tang 等[5]對比大腸菌群紙法（標準方法）和ATP 生物發光法在食堂衛生監督中評價廚具衛生狀況的有效性，該研究對河北省6 家食堂的廚具采用整群隨機抽樣，通過大腸菌紙試驗和ATP 生物發光試驗對樣品進行評估，結果顯示大腸菌紙法和ATP 生物發光法檢測廚具的陰性檢出率分別為64.39%和49.07%，兩種方法的Kappa 系數為0.549，表明兩種方法得出的結果比較一致，說明ATP檢測法有利于餐飲單位衛生監督現場快速檢測。Cao 等[6]研究開發了一種便攜式ATP 生物發光傳感器，該傳感器對大腸桿菌O157:H7 菌株具有高特異性，利用噬菌體的高特異性和簡單的信號雙擴增策略，在菌株水平上實現了對活菌的識別，具有較高的靈敏度，其便攜式信號讀出器使其適合現場檢測，在最佳條件下，該方法的檢測范圍為102～107CFU/mL，30 min 內的最低檢出限為30 CFU/mL，結果表明該方法與平板計數法無差異，但檢測時間大大縮短，且該方法為活體大腸桿菌的即時檢測（POCT）提供了新的途徑，有望推廣到其他具有相應噬菌體的毒力菌株的檢測中。Jaeho 等[7]利用ATP 生物發光通過空氣中顆粒物（PM）來確定細菌種群，設計并構建了圓盤式撞擊器，以切斷大于1、2.5 和10 μm 的氣溶膠，以收集采樣拭子上的PM1、PM2.5 和PM10，確定了相對光單位（RLU）與菌落形成單位（CFU）之間的相關性。ATP 生物發光法也存在一定不足，比如檢測限較高，易受酶的種類、游離性ATP 和不同鹽類等影響，結果穩定性不足，影響其推廣應用，目前主要在水體檢測和環境監測等領域應用[8]。

1.1.2 電阻抗技術 電阻抗技術是指利用培養基中不同微生物代謝活動的差異，通過電阻抗測量來檢測微生物的技術。致病微生物通過生理代謝活動使培養基營養底物由電惰性變為電活性，從而增大其電導性、降低電阻抗。因此，利用致病微生物代謝活性的差異所引起的阻抗值改變與培養基中微生物含量在一定時間內呈正比的原理，可以定量表征微生物。近年來，隨著生理生化代謝技術的發展，電阻抗技術在食源性微生物的鑒定檢測方面獲得了較大的進展。Kargupta 等[9]提出了一種通過使用微通道電阻抗譜（m-EIS）來實時檢測細胞暴露于殺傷劑后的死亡情況從而快速實現檢測致病菌，m-EIS 的原理為當具有非零膜電位的活細胞暴露于高頻交流電場時，誘導電荷會在膜界面積聚，細胞死亡伴隨著膜電位的喪失，因此電荷存儲（電容）也隨之喪失。張志偉[10]利用電阻抗技術對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌、活酵母和滅活酵母等細菌進行檢測分析，結果表明該方法獲得較好的細菌區分效果，相比于傳統方法時間更短、操作更簡單。利用該技術測定大腸桿菌、沙門氏菌和霉菌等食品安全領域微生物含量已經被美國分析化學家協會（AOAC）正式接收，具備快速、敏感、特異性高和重復性好等優點。

1.1.3 微量生化法 微量生化法主要應用于腸桿菌科等指標性的食源性致病菌種的檢測，包括放射測量法、微熱量技法等類型。放射測量法是指通過對微生物代謝所需的碳水化合物進行微量放射性標記，從而以生長代謝過程中菌種的二氧化碳濃度來定量分析致病菌含量。而微熱量技法則是通過微生物代謝過程中產生的熱效應進行微生物定量檢測分析的技術[11]。其主要原理為：通過微量熱計實時監測微生物生長過程中的熱量變化值與時間延遲的關系來制作熱曲線圖，再與標準曲線進行比對分析來定性致病菌，其核心關鍵在于建立完善的標準數據庫[12]。微量生化法具有效率高、準確性強和可重復性等特點，是一項快速準確且較復雜的微生物檢測技術，目前已經有效應用于酵母菌、乳酸菌和大腸菌群等致病菌檢測。Molendijk 等[13]研究評估了12 株金黃色葡萄球菌對噬菌體的敏感性，采用斑點試驗、電鍍效率（EOP）、光密度試驗（均在培養基中）和人血清微熱量技法4 項試驗對10 株臨床分離的金黃色葡萄球菌（其中5 株耐甲氧西林）進行比較，結果表明使用微熱量技法測定的濃度更低、更靈敏，有助于快速提高檢測靈敏性。Zhao 等[14]研究評估了商用微量生化檢測試劑盒、MALDI-TOF MS 平臺和自動rep-PCR DNA 識別技術在酵母菌檢測中的性能，該研究收集了71 株臨床重要的酵母菌，結果確定了28S nrDNA和ITS 測序的一致性，得到更高的檢測精度。目前，利用微量生化法制備的重復性好、精密度高的標準化試劑盒已相繼在市面上商業化應用，有效滿足了快速檢測技術市場需求，實現檢測效率和結果可靠性的有效提升。與此同時，微量生化試劑盒檢測技術雖然有效推進了傳統檢測方法的快速標準化應用，但在具體測試中仍需依賴人工進行加樣和結果解讀，自動化水平有待進一步提高。未來，該技術的試劑盒開發與應用將朝數字化、智能化方向不斷發展。

總體來說，生理生化技術的優點在于靈敏快速，且特異性高、重復性好，多為無損檢測，但也存在判定標準不統一、污染菌混淆以及與傳統培養方法檢測結果不完全一致等缺陷。隨著微生物代謝組學的發展，生理生化技術的應用潛力很大，尤其是在全球性的公共食品安全問題上可發揮有效作用。

1.2 免疫學檢測技術

免疫學檢測技術主要是基于抗原與抗體結合反應的免疫學原理，通過敏感的標記、示蹤技術對各種食源性致病菌的免疫學指標進行特異、超微量的分析檢測來確定其含量，在食品微生物的快速檢測中也應用非常廣泛。其優點是靈敏度高、快速、成本較低且特異性高，目前主要瓶頸在于制備抗體前處理較為麻煩。主要有以下幾類。

1.2.1 傳統免疫學檢測方法 傳統的免疫學檢測方法技術較為成熟，但操作步驟較為繁瑣，用時較長。其中具有代表性的主要有乳膠凝集法、酶聯免疫法、免疫熒光法以及免疫層析法等。

乳膠凝集法（latex agglutination，LAT）是指利用人工制造的乳膠顆粒對抗體進行標記，使其與待測抗原發生的凝集反應可被肉眼識別，從而實現目標病原微生物檢測的方法[15]。Waldemar 等[16]采用乳膠凝集試驗方法去篩選檢測大腸桿菌血清群O157、O26、O104、O111 和O145，結果表明該方法具有靈敏、快速、易于操作和成本較低的優勢，在只配備基本設備的小型流動實驗室中即可進行，可用于篩選血清診斷引起溶血性尿毒綜合征的腸出血性大腸埃希氏菌（VTEC）感染。Nordin 等[17]研究評價了Prolex Staph extra Latex 乳膠凝集試驗方法在檢測金黃色葡萄球菌中的效果，該方法采用Prolex 葡萄球菌超膠乳凝集試驗、常規試管凝固酶和DNA 酶試驗對初陽性外周血培養物進行檢測，結果顯示Prolex Staph extra Latex 乳膠凝集試驗靈敏度為100%，特異度為91.7%。LAT 是一種適合在基層市場推廣應用的快速、準確、簡便且無需特殊儀器的方法。

酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是通過加入酶標記抗體對表面吸附抗原的固相化載體進行免疫酶染色，發生顯色反應后進行定量分析確定待測致病菌含量的方法。ELISA 在超低濃度分析物的定量分析中表現出了優異的性能和廣泛的實用性，常用的有雙抗體夾心法、競爭法和間接法。其中雙抗體夾心法應用于食源性致病菌檢測領域一般較多，其靈敏度較高[18]。Wu 等[19]針對鼠傷寒沙門氏菌研究開發了一種新型雙抗體夾心檢測法，其夾心結構為酶聯抗體-適配體，應用于牛奶中該致病菌的檢測，檢測限值達到103CFU/mL。ELISA在金黃色葡萄球、產氣莢膜梭菌以及大腸桿菌等致病菌檢測中也應用較廣泛。Zhao 等[20]通過制備單克隆抗體，采用雙抗體夾心法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B，其檢測限值達到0.01 ng/mL，并且未產生交叉反應。目前市場上利用單克隆抗體和多克隆抗體檢測食源性致病菌毒素的ELISA 檢測試劑盒的商品化程度已經非常高，開發的試劑盒種類也非常多[21]。然而，傳統的ELISA 需要較長的檢測時間、檢測步驟繁瑣、效率較低且勞動強度大。Wang 等[22]提出了采用磁性納米機器人（MNRs）作為可操作的免疫分析探針，促進自動化和高效的ELISA 分析的策略，稱為納米機器人啟用ELISA（nR-ELISA）。測試結果表明，MNR-Ab1s 可以在微尺度上增強與目標分析物的結合效果，集成的nR-ELISA 系統可以顯著縮短檢測時間、減少人力投入，且通過對亥姆霍茲線圈磁場分布的模擬，驗證了該方法的可擴展性，證明了利用現有策略構建高通量nR-ELISA 檢測儀器的可行性。將磁性微/納米機器人作為主動免疫分析探針，用于自動高效的酶聯免疫吸附試驗（ELISA），不僅在未來的即時檢測（POCT）中具有巨大的潛力，而且將自推進微/納米機器人的實際應用擴展到分析檢測領域。ELISA 法具有標準化水平高、穩定性好、成本較低、特異性強和可批量檢測等優點。但也存在試劑要求高、無法同時鑒定多種成分、可能發生一定交叉反應和假陰性等缺點。隨著商品化和自動化儀器的普及和標準化應用，ELISA 將有很廣闊的應用潛力和市場空間。

熒光免疫法（immunofluorescence technique，IFT）是指基于生物化學和免疫學原理，利用示蹤熒光物質標記致病菌抗原抗體，通過顯微鏡觀測其呈現的特異性熒光反應，從而實現目標致病菌檢測的目的。IFT 可分為直接法和間接法，能夠對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及單增李斯特菌等致病菌實現快速檢測。Ozeh 等[23]利用該技術充分結合光電動力學定量分析大腸桿菌，結果表明檢測限在4 h 內即達到104CFU/mL。該法需要的儀器設備簡單，具有特異性強、時間短、限值低等優點，但也存在操作步驟較為復雜、非特異性染色和結果判定有一定主觀性等問題[24]。

免疫層析法（immunochromatography assay，ICA）是基于橫向流動免疫分析的一種免疫技術，在食源性的病原體、霉菌毒素和疾病檢測領域得到了廣泛的應用。該方法將待測液通過毛細管層析分離后，與預先標記過的抗原（抗體）著色試劑進行有效結合，產生的不同組分的特異性可視化顯色反應（一般層析后2～10 min 內），從而實現對目標微生物的定性檢測[25-26]。Li 等[27]研究了一種基于靶向在大腸桿菌K12 載體表面生長的信號策略，并成功地將其自組裝在具有雙測試線圖案的增強ICA 上，用于黃曲霉毒素A（OTA）和黃曲霉毒素B1（AFB1）的檢測，結果表明，兩種真菌毒素的定量檢出限均為0.01 ng/mL（提高了10 倍），OTA 和AFB1 的檢出限分別為0.01～0.5 和0.01～0.2 ng/mL，與液相色譜-串聯質譜（LCMS/MS）具有良好的相關性，證實了ICA 的高可靠性和適用性，該方法具有靈敏度提高、效率高、成本低等優點。該項研究可為多組分污染物的靈敏、同步、快速、現場監測提供重要的參考方法。免疫層析法對致病微生物實現快速簡便檢測，應用前景較佳。

1.2.2 現代免疫學檢測方法 現代免疫學檢測方法一般是指利用免疫反應的特異性充分結合現代傳感技術的高靈敏性，從而實現對抗原、抗體反應有效監測的一類生物免疫傳感器檢測技術。其免疫傳感器主要是通過將抗原與抗體反應所產生的參數變化轉換為電子信號，從而實現目標菌的檢測[28]。該技術與傳統方法和ELISA 相比最大的優點是能夠實時快速檢測，具有高靈敏度、低成本和強特異性等優點，目前已被開發并應用于包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等在內的食源性微生物分析，其應用已涉及到食品工業、臨床醫學、環境監測與處理等各領域。主要包含電化學式免疫傳感器和壓電晶體免疫傳感器等。

電化學式免疫傳感器技術（electrochemical immunosensor）是指基于電化學的檢測方法，將待測物在電極介質面上反應產生的化學信號轉導為電信號從而實現檢測目的的一種免疫傳感器檢測方法，已被用于識別和定量微生物[29]。電化學式免疫傳感器是利用電化學轉導技術實現高通量、實時在線檢測致病菌的一種設備，分為電流型、電勢型和電阻型等類型，其中電阻型主要用于細菌檢測，另外兩類則應用于病毒領域。電阻抗免疫傳感器主要是基于測量樣品與電極相關聯時電特性的變化來檢測食源性致病菌。Pérez-Fernández 等[30]針對黃曲霉致病菌研發了一種在絲網印刷碳電極上的電化學式免疫傳感器，以檢測黃曲霉致病菌毒素在開心果中的含量，該傳感器經過優化后在0.01～2 μg/L 的線性范圍內，重現性好（RSD：2%），在PBS 緩沖液和開心果基質中的檢出限分別為0.017 μg/L 和0.066 μg/kg，具備簡單、便宜、快速且具有與ELISA 和LC-MS/MS 相當的靈敏度，使該方法成為進行黃曲霉致病菌感染篩選的有效途徑。Izadi 等[31]研發了一種DNA 納米改性的電化學免疫傳感器檢測方法，其原理主要是通過增加電荷轉移阻力利用傳感器實時監測靶向DNA 序列，可在乳制品中特異地檢測蠟狀芽孢桿菌。

壓電晶體免疫傳感器（piezoelectric immunosensor）是根據壓電效應產生的沉積質量與其頻率響應之間的線性關系將化學信號或生物信號轉化為電信號的一種傳感器，可以無需標記物、靈敏高效地檢測微量致病菌。壓電晶體免疫傳感器對微生物所產生的特定揮發性化合物氣味感應較為靈敏，已成為確定食品污染較為成功的方法之一。壓電晶體免疫傳感器與其他傳感器相比，具有快速便攜、反應靈敏、無需標記樣品且自動化程度高等優點。Ruchika等[32]利用自組裝單層己二硫醇（HDT）、半胱胺和3D 納米金（AuNPs）制備了無標記電化學石英晶體微天平（EQCM）免疫傳感器，并將其用于花生中黃曲霉毒素B1（AFB1，食品霉菌毒素）的檢測，檢測AFB1的靈敏度為126 μA·ng-1～1 mL·cm-2，檢出限為8 pg·mL-1。該項目新興技術已在其他領域得到了廣泛應用，在食源性致病菌檢測領域也具備較好應用前景[33]。

1.3 分子檢測技術

近年來，分子生物學的快速發展給食源性致病菌快速檢測技術帶來了重大變革，推動了過去局限于對致病菌形態學、生理學和生態學等常規的特征檢驗轉變為從分子生物學水平開展研究，從而開發建立了眾多的新型檢測技術，取得了快速的應用進展。主要方法類型如下。

1.3.1 聚合酶鏈式反應 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術主要是基于DNA變性和復性原理，充分發揮DNA 聚合酶活性，結合相關引物和脫氧核糖核酸等共同作用，使模板DNA短時間內實現大量擴增從而達到檢測目的的技術手段。在食源性致病菌快速檢測中的應用比較廣泛的主要為常規PCR 技術、多重PCR 技術、實時熒光PCR 技術和數字PCR 技術等。

常規PCR 技術是指通過一對特異性引物的應用并結合熱穩定性較高的DNA 聚合酶對少量核酸樣品進行循環溫度作用實現擴增目的的一種體外擴增技術，其原理是針對特定致病菌的特定基因片段設計引物并擴增，從而檢測擴增基因片段實現目的。該技術的循環反應過程包括高溫變性、低溫退火和適溫延伸等步驟。Perdoncini 等[34]通過常規PCR、數字PCR 和實時PCR 技術定量檢測家禽屠宰過程中不同階段的耐熱彎曲桿菌，結果表明3 種檢測方法的群檢陽性率基本一致。該技術主要特點表現為特異性強，靈敏度高，快速便攜，標本純度要求不高。

多重PCR 技術是指通過兩對以上特異性引物同時進行核酸擴增的PCR 反應，其反應過程和基本原理均與常規PCR 相同，主要區別在于引物數量的不同。該技術可同時實現多種致病微生物的鑒定及某些致病微生物的分型鑒定，具備高效性、低成本和系統性等特點[35]。Lee 等[36]使用多重PCR 技術同時分析評估人工接種的沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌以及金黃色葡萄球菌等致病菌的檢測效果時，檢測限值在12 h 內能達到1 CFU/mL。Park 等[37]將基于薄膜的PCR 模塊、電極模塊和基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的手指驅動微流控模塊集成在一起，建立了一個簡單的集成無泵微流控芯片的單片機病原體分析系統，用于同時分析多個樣品中的病原體，在膜室中采用熱循環聚合酶鏈反應（PCR）法擴增食源性致病菌靶基因，并采用方波伏安法對擴增基因進行電化學定量，該研究中選擇大腸桿菌O157:H7 作為靶菌，結果表明對該致病菌的檢出限（LOD）達到了102CFU/mL。鑒于集成微流控芯片的顯著特點，該傳感平臺可用于病原體篩選，在即時檢測領域具有廣闊的應用前景。

實時熒光PCR 技術是指在反應中添加熒光基團從而實現通過熒光信號實時監測PCR 反應進程，以達到定量分析的目的。該技術因其在DNA 初始模板評價和熒光信號檢測等方面的定量分析能力優異而成為一個活躍的領域，與常規PCR 技術相比可對樣品實現實時定性、定量分析，有效縮短檢測時間[38-39]。周敏琪[40]針對奶粉中的克羅諾桿菌屬利用實時熒光定量PCR 進行檢測分析，檢測限達到4.7×103CFU/mL。

此外，以數字PCR 技術（digital PCR，dPCR）等為代表的第三代PCR 技術隨著科學技術的發展應用越來越廣泛。dPCR 作為一種新興的目標核酸絕對定量技術，在食源性致病菌快速檢測中應用越來越廣泛[41]。dPCR 與熒光PCR 相比可直接定量DNA 分子數量，實現對起始樣品的精準分析。dPCR 無需依賴標準曲線和擴增閾值，具有高精確度、高靈敏度和絕對定量等特點[42-43]。

總之，PCR 技術在食源性致病菌檢測方面已成為非常實用的技術。目前主要存在的瓶頸問題：一是檢測靶點的特異性不高導致的假陽性；二是抑制劑或干擾因素的存在導致的假陰性；三是現有的增菌方法難以快速有效地富集目標菌體所導致的樣品前處理與菌體富集的有效性差。隨著PCR 研究的不斷深入和拓寬，熒光定量PCR、數字PCR 等先進技術的持續迭代升級，必將推動該技術標準化應用向更高層次發展，為食品安全事業作出更大貢獻。

1.3.2 等溫擴增檢測技術 等溫擴增檢測技術（isothermal amplification technology，IAT）是近年來發展起來的基于特定溫度下實現核酸擴增的新型技術，主要包括環介導等溫擴增和依賴核酸序列的擴增等類型。其優勢主要為對儀器的要求相對簡單，檢測周期短，適合現代分子生物學快速檢測技術的發展需求，發展前景廣闊。

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）主要是指通過特異性引物與DNA 聚合酶在等溫條件（60～65 ℃）下共同作用實現目標序列擴增的一種新型擴增技術，其避免了傳統PCR 需要變溫擴增而對儀器性能的依賴，同時兼具快速簡便、特異性強的特點[44]。LAMP 由于其等溫特性和高靈敏度，越來越多地應用于病原微生物監測的核酸檢測中。Hu 等[45]研究構建了LAMP 反應與CRISPR/Cas12a 相結合的檢測副溶血性弧菌的方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，40 株被試菌株的定性準確度達到100%，純培養物和DNA 的檢出限分別達到2.5 CFU/mL 和5 fg/μL。富集培養2 h 后，對初始接種5 CFU/mL 副溶血性弧菌的人工污染樣品進行檢測，整個反應時間小于30 min，提高了檢測限，并提供了多種端點檢測方法，不受儀器的限制，在衛生醫療條件有限的地方具有很高的應用價值。王瑾[46]利用LAMP 方法檢測沙門氏菌，檢測限達到6 CFU/mL，時間僅45 min。LAMP 廣泛應用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌等致病菌的檢測[47]。Young等[48]采用了LAMP 方法從69 份美國國家抗菌素耐藥性監測系統（NARMS）零售肉類和家禽樣品中快速篩選沙門氏菌。結果表明LAMP 對培養物的靈敏度為100%，證明了快速、穩健、高靈敏度的分子篩選方法在簡化實驗室工作流程中的好處。截至2022 年7 月，絕大多數NARMS 肉類零售站點已采用沙門氏菌LAMP 測定法對所有樣品進行快速篩選。LAMP 的主要優勢：一是效率高，其效率是常規PCR 的10～100 倍；二是特異性強、周期短，且設備要求不高[49]。缺陷：一是產物僅用于結果判斷分析，不可克隆；二是引物特異性要求較高；三是易因形成氣溶性膠而造成假陽性[50]。

依賴核酸序列的擴增技術（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是指一種在RNA聚合酶作用下通過一對引物連續作用實現體外核酸序列等溫擴增的技術。該反應主要通過T7 RNA 聚合酶、AMV（avian myeloblastosis virus）逆轉錄酶、RNA 酶H 以及一對引物在42 ℃左右來完成，主要步驟為：第一步，RNA 鏈與含T7 啟動子序列的正向引物結合后在AMV 酶催化下形成DNA-RNA 雙鏈，再通過RNA 酶H 消除其中的RNA 鏈后剩下DNA 單鏈；第二步，DNA 單鏈在AMV 酶和反向引物共同作用下形成含T7 啟動子序列的DNA 雙鏈；第三步，通過T7 RNA 聚合酶的作用進一步完成轉錄過程，短時間內實現模板RNA 大量高倍擴增。NASBA 針對目標RNA 或DNA 序列具有較強的特異性，具有高靈敏度、操作簡便、不易污染等優勢，已廣泛應用于食品安全快速檢測。在動物疫病預防方面，NASBA 已被國家標準列為檢測禽流感病毒的推薦方法之一[51]；在植物病毒檢測等方面應用也較為廣泛[52]。Nai 等[53]提出了一種改進的T4 基因32 蛋白介導的NASBA 方法，用于三種單鏈結合蛋白RecA、Extreme Thermostable 單鏈結合蛋白（ET SSB）和T4 基因gp32 蛋白（gp32）的檢測，在41 ℃下進行一步NASBA。與兩步法相比，所有SSBs 的擴增率都有顯著提高，研究發現gp32 可將HIV-1 RNA 檢測的陽性時間（ttp）平均提高到13.6%的一步NASBA和6.7%的常規NASBA，顯示其簡化工作流程的潛力，適合于NASBA 的應用。NASBA 技術因需要通過RNA 酶抑制劑來防止RNA 降解，導致檢測成本較高，目前仍處于研究階段，但國外發達國家已將該項技術列入重點發展的檢測手段，并通過研究項目資助開始制備檢測試劑盒進行推廣應用。

1.3.3 基因芯片技術 基因芯片技術（DNA chip）是一項融合分子生物學、化學和電子激光等各領域先進技術，通過一次微排列實驗可對上千種基因的突變形態和表達水平等進行準確快速檢測的新型技術。該技術主要是通過原位合成寡核苷酸或者以顯微打印的方式直接固化DNA 探針于固相支持物表面，再通過計算機對標記樣品雜交信號進行鑒定分析，從而實現樣品的遺傳信息測定，其高通量特點彌補了PCR 技術的檢測缺陷。根據不同芯片制備原理可分為原位合成芯片（synthetic gene chip）和DNA 微列陣（DNA microarray）兩類。其中原位合成芯片主要利用光引導聚合技術（light-directed synthesis）原理，一般用于寡聚核苷酸和寡肽分子的合成；DNA 微列陣則是采用PCR、DNA 核酸合成和克隆等分子生物學技術以顯微打印等方式固化DNA 探針于支持物表面而制作而成。左秀華[54]利用基因芯片技術結合多重PCR 技術檢測大腸桿菌，結果表明靈敏度可達104CFU/mL，可有效鑒別產腸毒素大腸桿菌和大腸桿菌O157 等。Guo 等[55]開發了一種可用于多目標檢測的便攜式分區DNA 水凝膠芯片，將目標識別熒光適體發夾納入多個滾圈擴增產物中，通過交聯擴增形成分割表面固定化的DNA 水凝膠芯片，可實現對多個目標的便攜、同時檢測，該方法拓展了半干化學策略的應用，可實現不同靶點的高通量和護理點檢測（POCT），為食源性致病菌檢測提供了新的潛在解決方案。

基因芯片技術優勢在于效率高、高通量、可定量檢測，但在樣品前處理、檢測限與靈敏度、標準統一性、基因芯片特異性等方面還有待改進。隨著科技的進步，未來的趨勢將朝著微型化、信息化、可視化的方向發展。

1.3.4 基因組測序技術 基因組測序技術是指對未知基因組序列的樣品進行氨基酸或核酸等生物小分子序列測定的技術。從1977 年至今，基因測序技術經歷了Sanger 測序、高通量測序（NGS）和單分子/納米孔測序總共三代技術的發展，已取得了相當大的進步。近年來，第三代單分子/納米孔測序技術在食源性致病菌檢測領域應用越來越多。

單分子/納米孔測序技術是指通過納米材料、高分子、光學等先進技術手段相結合來分析堿基信號差異，從而實現讀取基因序列信息的目的。該技術在食源性致病菌檢測中的應用主要體現在解析長片段的可移動基因組，具有超長解讀的特點。用于公共衛生監測和食源性病原體流行病學調查的全基因組測序（WGS）主要依賴于產生短讀取的測序平臺，長讀取納米孔測序的持續改進，如牛津納米孔技術（ONT），在公共衛生和食品工業環境中展示了利用該技術的多重優勢的潛力，包括快速周轉和現場適用性，以及優越的讀取長度。Xian 等[56]利用已建立的腸炎沙門氏菌分離物隊列進行分型評估用于主要食源性病原體單核苷酸多態性（SNP）分析的納米孔長讀測序和核心基因組多位點序列分型（cgMLST）的技術成熟度。該項研究為不斷發展的納米孔技術建立了一個基線，作為高質量沙門氏菌亞型的可行解決方案，無論單獨使用還是與短讀平臺一起使用，都能提供相當的亞型表現，為評估和優化在特定環境中實施食源性病原體監測的ONT 方法的輔助工作提供了基礎支撐。Sarahl 等[57]將MiIO 納米孔測序技術應用于國際空間站的微生物現場快速鑒定和檢測，結果表明大規模的微生物鑒定效果良好。Ji 等[58]利用PacBio 測序技術研究污水處理廠細菌菌群，結果顯示可鑒定細菌菌屬水平總序列的68%。

單分子/納米孔測序技術具有高通量、精準可靠、安全、便于組裝且具有發現unique reads 的潛在優勢，但其用于食源性致病菌檢測的瓶頸在于生物信息學軟件與數據庫的大量需求，且成本較高，限制了其在商業市場的應用推廣，未來隨著科技的發展將更為穩定和成熟[59]。

2 食源性致病菌快速檢測技術的標準化應用

標準化是保障食品安全和人民生命健康的重要手段和基礎性支撐，也是推動先進技術應用實施并發揮成效的關鍵前提。隨著經濟全球化的發展，食品安全已跨越國界，世界各國對于貿易往來中的食品安全問題都非常重視，全球食品安全檢測技術越來越統一化、標準化[60]。近年來，我國在食源性致病菌快速檢測技術研究方面取得了一定的進展，但標準化水平仍相對偏低，在此形勢下，加快先進快速檢測技術標準化建設和應用，推動與國際技術標準接軌，對于提高我國食品安全水平意義重大，同時也有利于我國打破食品農產品出口的技術性貿易壁壘，推動食品貿易高質量發展[61-62]。

當前，傳統常見的食源性致病菌檢測方法主要依據為食品安全國家標準中關于散裝即食食品[63]和預包裝食品[64]的致病菌限量及相應的食品微生物學檢驗方法，主要以傳統培養檢測方法為主，具體信息見表1。傳統的培養計數法目前仍是食源性致病菌檢測的金標準方法，對于指標性驗證具有較強的準確性，其標準化應用也相對較為成熟，但是檢測流程繁瑣、耗時長，一般需要2～4 d 才能得到檢測結果，限制了其大范圍推廣應用，且難以滿足目前行業內快速檢測的市場需求。隨著科技的發展，新型快速檢測技術發展迅速，而標準化則是這些快速檢測技術能否成功推廣的核心和關鍵，因此有必要討論目前食源性致病菌快速檢測技術的國內外標準化現狀，從而更好地推動該領域技術應用推廣。

表1 常見食源性致病菌對應標準化檢測方法Table 1 Standardized detection methods for common foodborne pathogens

2.1 國內快速檢測技術標準化現狀

目前國內針對食源性致病菌快速檢測技術的相關標準制定已經取得了一定的進展。國內相關標準初步梳理已有48 項以上。其中針對PCR 和ELISA相關快速檢測方法制定了推薦性國家標準，具有時間短、靈敏度高的優點，一般僅需2～4 h，檢測限可達102CFU/mL，但一般企業生產或監管部門市場抽檢的食品樣本中致病菌濃度都較低，所以需要進行0.5～1 d 的前增菌處理，該過程大大延長了檢測周期，導致難以有效開展食品安全風險的前期預警。除了國家標準外，其他相關標準基本屬于海關進出口檢驗檢疫領域行業標準，主要包含PCR 試紙條、熒光PCR、數字PCR、基因芯片、分型MLST、環介導等溫擴增以及基因測序等先進快速檢測技術，有力支撐了進出口檢驗檢疫事業的發展。但在其他行業領域，尤其是衛生、農業、商務、市場監管等行業領域的標準供給仍明顯不足，亟需制定符合行業發展需求的先進快速檢測方法標準。對于一些較為先進的目前尚不具備制定國家/行業標準條件的快速檢測方法，可以根據市場實際優先選擇制定團體標準或企業標準，滿足市場發展需求，待條件具備后可按程序制定為國家/行業標準進行推廣使用。具體標準信息見表2。

表2 國內食源性致病菌快速檢測技術相關標準Table 2 Domestic standards for rapid detection technology of foodborne pathogens

2.2 國外快速檢測技術標準化現狀

國外先進標準（含國際標準）初步梳理了17 項，主要有ISO、俄羅斯、印度、英國和德國等相關標準，大部分是關于PCR 技術的檢測應用，涉及檢測方法的一般要求和定義、檢測和定量分析等方面，其中俄羅斯在食源性致病菌領域標準制定進展較快，歐盟和國際標準化組織（ISO）也制定了一系列先進檢測方法標準。歐盟法規（EC）No 2073/2005《食品微生物標準》[65]中包含安全標準、過程衛生標準、采樣標準等，針對致病菌安全限量也提供了PCR、ELISA 及等溫擴增技術等快速檢測技術標準。這些國外標準都具備較好的參考學習價值，可以根據國內實際借鑒或進行采標轉化，以推動我國食品安全快速檢測技術的標準化發展。具體標準信息見表3。

表3 國外食源性致病菌快速檢測技術相關標準Table 3 Foreign standards for rapid detection technology of foodborne pathogens

2.3 國內外標準化應用實踐

2.3.1 國內標準化應用實踐 食源性致病菌快速檢測技術在國內的標準化應用主要涉及企業生產加工、基層市場監管執法、公共衛生安全和海關進出口檢驗檢疫等領域。具體如下。

在企業生產加工領域，針對企業生產加工過程中的食品微生物致病菌的安全檢測，主要包括生產環境的微生物監控和過程產品的微生物監控[66]。具體的生產加工過程中微生物的監控檢測要點包括：監控指標、采樣點位、頻率、采樣和檢測方法、評判原則和整改措施等，通過對各環節的標準化監控檢測可有效反映企業工業化生產過程的食品安全管理水平。這其中最為關鍵的即是致病菌的快速檢測方法標準化應用，因為檢測涉及生產—加工—消費等全產業鏈，目前國內相關企業已經在結合自身生產工藝、產品特點以及環境條件制定了一系列的企業檢測標準，主要有PCR 技術、ELISA 技術等，同時相關團體協會也在逐步開展分子檢測技術、生物傳感器技術等先進檢測方法的團體標準制定。

在基層市場監管執法領域，食源性致病菌快速檢測方法具有操作便捷、靈敏度高、時間短、成本低、特異性強以及對環境和儀器要求低等優點，適合基層市場監管部門對大量樣品的快速篩查抽檢，其標準化應用推廣是將食品安全問題遏制在進入消費者餐桌前端的關鍵和前提，是保障食品安全和防控食源性致病菌感染的重要基礎支撐。市場監管部門[67-68]在嬰幼兒配方乳粉及企業乳制品生產許可規定中也明確推薦企業使用快速檢測方法和設備，但應保障結果可靠性，同時要求企業應定期將自身的快速檢測方法、設備與國家標準方法進行對標驗證，陽性結果應通過國標方法確認。

在公共衛生安全領域，快速、準確地鑒別食源性致病菌是及時應對突發性食品安全事件、有效預防和控制公共衛生安全的前提和關鍵。中共中央國務院2019 年5 月印發的《關于深化改革強食品安全工作的意見》中強調要加快食品安全標準制定，確保人民群眾“舌尖上的安全”。國家衛生健康委在關于航空食品衛生規范中[69]也明確建議可采用微生物快速檢測方法進行篩查檢測，再以國際方法進行驗證確認。

在海關進出口檢驗檢疫領域，全國各地海關技術檢測機構相繼主導制定了《GB/T 4789.9-2008 食品衛生微生物學檢驗 空腸彎曲桿菌檢驗》等多項致病菌快速檢驗領域的國家/行業標準。上海海關技術團隊針對空腸彎曲菌開發的實時熒光PCR 快速檢測方法已獲美國分析化學家協會（AOAC）PTM 認證，該技術是我國第一個自主研發的通過AOAC 國際認證的食品微生物快速檢測方法[70]。通過自主研發標準化試劑盒和國際認證，一方面可有效提升國產試劑盒的質量水平和國際認可度，降低食品安全快速檢測領域的技術性貿易壁壘，推動進出口貿易發展；另一方面也填補國內食品安全先進檢測技術國際認證領域的空白，為下一步AOAC 等其他先進國際標準的研制積累技術經驗，有助于增強我國技術和標準話語權。

2.3.2 國外標準化應用實踐 由美國科學院、美國工程院、美國醫學科學院共同制定的“2030 美國食品和農業科技發展戰略”的具體目標中提到“開發食源性致病菌早期快速檢測方法并進行標準化應用”，其中重點突破領域為“交叉學科研究和系統研究方法、傳感技術”[71]。國際食品法典委員會（CAC）對于即食食品中的大腸桿菌、腸桿菌科、菌落總數等微生物致病菌主要強調過程控制，僅在標準法規中明確了單核細胞增生李斯特氏菌在即食食品中的限量，并對檢測方法作了相應說明[72-73]。CAC 于2013 年修訂了《制定和應用食品微生物標準的原則和指南》（CAC/GL 21-1997），其中規定了微生物標準制定的目的、考慮因素、采樣方案和檢驗方法等內容，用于指導各國微生物標準管理工作[74]。CAC 在2009 年修訂的《嬰幼兒粉狀配方食品衛生操作規范》（CAC/RCP 66-2008）中提出了嬰幼兒粉狀配方食品相關產品中的沙門氏菌和克羅諾桿菌等的限量標準及對應檢測方法。國際食品微生物標準委員會（ICMSF）早在2002 年出版的《食品微生物檢驗與食品安全控制-食品中的微生物（第七卷）》中就對微生物標準的選擇、制定和應用，以及分級采樣方案原理、類型和應用等內容進行了詳細介紹。提出的分級采樣方案是食品微生物標準化領域的重要組成部分，已被CAC 及世界各國廣泛采納和引用。ICMSF 在《食品加工過程的微生物控制原理與實踐-食品中的微生物（第八卷）》（2011 年版）中系統分析了18 大類不同食品中的微生物危害和潛在風險，并提出應控制的主要致病菌種類、限量要求、關鍵控制點及相應的檢測方法等。近年來，諸多國家或地區，如歐盟、日本、澳大利亞、美國等，均逐步制定或修訂了與CAC 法典等國際先進標準相協調一致的食源性致病菌檢測技術標準。

3 結論

近年來，食源性致病菌快速檢測技術及其標準化應用取得了快速發展，對于食品安全事業的支撐作用也愈加凸顯。隨著全球對食品安全的愈加重視以及科技的發展，新型檢測技術在時間、靈敏度以及特異性上都有了較大提升，但標準化仍是目前快速技術推廣和應用的關鍵和短板。一方面，新型快速檢測技術在靈敏、快速、特異性強的同時，大部分仍然屬于非法定方法，且幾乎都存在一定的缺陷，例如免疫檢測技術存在抗體前處理較為麻煩，生理生化檢測技術存在污染菌混淆問題，缺乏統一的判定標準。另一方面，先進的納米技術、基因技術、傳感器技術等前沿科學不斷與食源性致病菌的快速檢測融合發展，利用多學科交叉結合，實現優勢互補，從而推進快速檢測技術的標準化應用，將成為未來發展的必然趨勢。此外，國內外針對食源性致病菌快速檢測技術的相關標準體系仍不完善，制約了快速檢測技術的標準化推廣應用。國內現行標準主要為海關進出口檢驗檢疫領域的行業標準，難以滿足行業發展的需求，因此亟需制定一系列快速檢測技術的國家/行業標準、地方標準和團體標準等，補齊標準短板，推動食品安全檢測事業發展。

未來，食源性致病菌檢測技術應符合檢測速度足夠快、檢測限值足夠低、檢測特異性足夠好等特點，朝著簡便化、標準化和數字化的方向發展。對其未來發展提出建議如下：一是加快新型檢測技術的標準化研究開發。找準當前的技術缺陷和不足，以標準化視角持續研究和迭代升級。二是完善食品安全快速檢測技術標準體系。加快建立健全覆蓋企業生產、市場監管、公共衛生和海關進出口等不同行業領域的技術標準體系來支撐我國食品安全事業發展。三是提高檢測技術應用推廣的質量和水平。適應新時代發展要求，著力推動食品安全快速檢測技術標準化應用全產業鏈覆蓋，加快先進技術在基層的推廣和普及，從而提高食品安全質量。