SMYD2介導高糖誘導小鼠腎成纖維細胞活化的機制研究*

左思洋，李霞，陳思羽，陳敏，彭睿，鄒雪，龍合花，楊元，元輝雄，郭兵，趙青青，劉麗榮

（1.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院精準醫學研究院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 重大疾病發病機制研究與藥物防治實驗室，貴州 貴陽 550025）

糖尿病（diabetes mellitus,DM）已成為全球患病率最高的慢性病之一[1]。國際糖尿病聯合會報告指出，2021年全球DM 患者達5.37 億，其中我國患者達1.41 億，且呈快速上升趨勢[2]。糖尿病腎病（diabetic kidney disease,DKD）是DM 最常見的微血管并發癥[3]，DKD 是慢性腎臟疾病（chronic kidney disease,CKD）的主要原因[4]。腎纖維化是CKD 進展的必經之路，未受控制的腎纖維化最終導致CKD 發展為終末期腎病（end stage renal disease,ESRD）[5]，給家庭和社會帶來沉重負擔。因此，尋找腎纖維化調控的有效靶點對DKD 防治具有重要意義。

腎纖維化的主要病理特征是細胞外基質（extracellular matrix,ECM）如Ⅰ型膠原蛋白（type Ⅰcollagen,Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ、纖維連接蛋白（Fibronectin）等的持續積累和沉積[6]。成纖維細胞在腎臟進行性纖維化和持續性炎癥中起著至關重要的作用[7]。在DM 發展為DKD 的過程中，持續高血糖可誘導大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）形成，加快促炎因子如白細胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor,TNF-α）的釋放[8-10]。在高血糖、缺氧和炎癥的刺激下腎成纖維（NRK-49F）細胞轉分化為肌成纖維細胞[10]，肌成纖維細胞通過表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α- SMA）及分泌大量的ECM 成分蛋白導致廣泛的腎組織纖維化[11]。核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）控制多種免疫及炎癥相關基因，是細胞生長、分化和凋亡的重要調節因子[12]。NF-κB 信號通路的激活在DKD 的發生、發展中起重要調控作用[13]。研究表明在活化的NRK-49F 細胞中，NF-κB 信號通路可通過激活不同路徑，促進促炎細胞因子和趨化因子釋放[14]。然而NF-κB 信號通路在DKD 中的作用機制有待進一步闡明。

組蛋白賴氨酸甲基轉移酶2（SET and MYND domain-containing protein 2,SMYD2）是一種含有SET和MYND 結構域的組蛋白甲基轉移酶[15]，SMYD2可對組蛋白的不同位點（H3K4、H3K36）進行甲基化修飾[16]，也可使非組蛋白如信號轉導和激活轉錄因子3、NF-κB p65 和p53 等發生甲基化而影響細胞增殖、分化和存活[17]。在多囊腎病基因1 突變小鼠的囊性腎上皮細胞中，可通過甲基化NF-κB p65 激活SMYD2，影響囊性腎上皮細胞的增殖和活化[18]。本課題組前期研究發現SMYD2 也高表達于DM 小鼠腎組織[19]，然而SMYD2 在DKD 發展中確切的作用和分子機制有待進一步研究。因此，本研究基于DM小鼠模型和細胞模型，旨在探究SMYD2 是否可介導高糖環境下NRK-49F 細胞的活化及可能機制，為DKD 防治靶點的相關研究提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、主要試劑及儀器

10 只SPF 級健康雄性C57BL6 小鼠，體重（180±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2014-004，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001。

DMEM 正常糖培養基（含1 g/L 葡萄糖）、DMEM高糖培養基（含4.5 g/L 葡萄糖）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）均購自美國Invitrogen Gibco公司，胰酶消化液、青鏈霉素混合液（雙抗）均購自以色列Biological Industries 生物科技公司，SMYD2 特異性抑制劑AZ505 購自美國APExBIO 公司，ECL 發光試劑盒購自常州天地人和生物科技有限公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin,HE）試劑盒、Masson 三色染色改良試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8試劑盒、高效RIPA 裂解液、抗熒光衰減封片劑、牛血清白蛋白封閉液（5% BSA）均購自北京索萊寶科技有限公司，Fibronectin（ab2413）兔多克隆抗體、H3K4me3（ab8580）兔單克隆抗體、H3（ab1791）兔單克隆抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司，α-SMA（14395-1-AP）兔單克隆抗體、Collagen Ⅰ（14695-1-AP）兔多克隆抗體、SMYD2（21290-1-AP）兔單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司，NF-κB p65（D14E12）兔單克隆抗體、Phospho-NFκB p65（Ser536）（93H1）兔單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，SMYD2（sc393827）鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 生物技術公司，β-actin（PMK058S）兔單克隆抗體、HRP 山羊標記抗兔/鼠二抗購自武漢普美克生物技術有限公司。

Cobas 8000 型全自動生化分析儀購自瑞士羅氏公司，Axio Imager.A2 型光學顯微鏡購自德國ZEISS公司。

1.2 方法

1.2.1 模型復制及分組SPF 級小鼠隨機分為正常（NC）組和糖尿病（DM）組，各5只。DM組按55.0 mg/kg劑量腹腔注射STZ 復制模型，1 次/周，連續5 周，48 h后小鼠尾靜脈取血監測隨機血糖，血糖＞16.7 mmol/L判定為模型復制成功；NC 組給予相同劑量生理鹽水。兩組小鼠喂養標準飼料，自由飲水，于模型復制28 周后處死。小鼠處死前6 h 禁食不禁水，麻醉后，眼球摘除法取血，以4 000 r/min 離心5 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。將腎臟組織對半分開，一半浸泡于4%的多聚甲醛，另一半保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 全自動生化分析儀檢測生化指標采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血糖（blood glucose,BG）、血肌酐（serum creatinine,Scr）水平。

1.2.3 HE、Masson染色觀察腎臟病理改變腎組織經4%中性甲醛固定后，石蠟包埋切片（3 μm 厚），采用HE、Masson 染色進行觀察。

1.2.4 細胞培養小鼠NRK-49F 細胞在5% FBS、1% 青鏈霉素混合液的DMEM 低糖培養基中，于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中靜置培養，細胞生長密度達90%時使用胰酶消化液進行消化并傳代。

1.2.5 高糖培養基（high glucose,HG）不同時間點刺激NRK-49F 細胞活化將NRK-49F 細胞按1.5×109個/孔細胞密度接種于細胞培養6 孔板中，待細胞密度達60%時對細胞進行24 h 無血清饑餓處理。在0、6、12、24、36 和48 h 逐次加入HG 培養基（含0.5% FBS、1%青鏈霉素混合液）在37 ℃、含5%二氧化碳培養箱中培養，陰性對照組加正常糖（normal glucose，NG）培養基（含0.5% FBS、1%青鏈霉素混合液），在37 ℃、二氧化碳培養箱中繼續培養。處理完后，棄培養上清液、收集細胞、提取細胞蛋白待測。

1.2.6 CCK-8 法檢測AZ505 對NRK-49F 細胞毒性將NRK-49F 細胞按照1.0×103個/孔細胞密度接種于96 孔板中，在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養24 h，再進行24 h 無血清饑餓處理。根據AZ505的作用濃度依次分為0.000 μmol/L 組、0.156 μmol/L組、0.313 μmol/L 組、0.625 μmol/L 組、1.250 μmol/L組、2.500 μmol/L 組、5.000 μmol/L 組、10.000 μmol/L組、20.000 μmol/L 組、40.000 μmol/L 組、60.000 μmol/L組，每個濃度設置5 個復孔。處理48 h 后，棄原培養基，將CCK-8 試劑與培養基按1∶9 混合后加入各孔，于37℃、5%二氧化碳培養箱中孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，計算不同藥物濃度作用下的細胞存活率，細胞存活率（%）=[（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）]×100%。

1.2.7 Western blotting 檢測蛋白表達利用細胞刮刮取各組細胞、重懸于RIPA（與蛋白酶抑制劑PMSF 按照100∶1 混合）蛋白裂解緩沖液，超聲提取蛋白并高速離心獲取蛋白上清液。使用BCA 蛋白質濃度測定試劑盒測定細胞蛋白濃度。與上樣緩沖液（5×loading buffer，含二硫蘇糖醇）混合后于100 ℃變性10 min，樣本立即點泳或冷凍于-20 ℃。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠[10%的聚丙烯酰胺分離膠（10 mL）：4.1 mL 超純水+3.3 mL 30%丙烯酰胺+ 2.5 mL 1.5M Tris（pH 8.8）+ 0.1 mL 10%SDS +0.1 mL 10%過硫酸銨+ 6 μL 促凝劑；5%聚丙烯酰胺濃縮膠（4 mL）：2.6 mL 超純水+ 1.0 mL 30%丙烯酰胺+ 1.3 mL 1.5 mmol/L Tris（pH 6.8）+ 50 μL 10% SDS + 50 μL 10%過硫酸銨+ 4 μL 促凝劑]，將等質量的蛋白樣本加至各泳道，電泳結束后將蛋白由凝膠轉移到PVDF 膜上。使用5%脫脂牛奶常溫封閉PVDF 膜1 h。將PVDF 膜與蛋白Fibronectin（1∶5 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、SMYD2（1∶2 000）、H3K4me3（1∶1 000）、H3（1∶5 000）、NF-κB p-p65（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）一抗于4 ℃搖晃孵育過夜，H3K4me3 蛋白以H3 為內參，其余蛋白以β-actin為內參。TBST 洗膜3 次，將PVDF 膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗搖晃孵育1 h。TBST 洗膜3 次，用增強化學發光溶液和凝膠成像儀系統顯影、檢測蛋白印跡條帶，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度。

1.2.8 明確AZ505作用濃度并進行實驗驗證根據CCK-8 實驗結果選擇對NRK-49F 細胞毒性較小濃度（2.500、5.000、10.000 和20.000 μmol/L）的AZ505 對細胞進行干預，經Western blotting 明確AZ505 抑制HG 誘導NRK-49F 細胞活化的作用濃度，并取AZ505作用濃度為20.000 μmol/L 用于實驗驗證。將細胞分為NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組。NG 培養基和HG 培養基均含0.5% FBS、1%青鏈霉素混合液。處理48 h 后，收集細胞、提取細胞蛋白，經Western bloting 明確AZ505 對HG 誘導NRK-49F 細胞活化的抑制作用。

1.2.9 免疫熒光檢測腎組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后切片（厚3 μm），脫蠟后用EDTA（pH 9.0）進行抗原修復；用預熱的4% 多聚甲醛固定NRK-49F 細胞30 min，隨后用溶解于PBS 的0.5%Triton X-100 通透10 min，5% BSA 常溫封閉1 h，滴加一抗并于4 ℃孵育過夜，使用以下蛋白的一抗：鼠抗SMYD2（1∶200）、兔抗NF-κB p-p65（1∶300）、兔抗α-SMA（1∶300）。孵育結束后，PBS 洗滌3 次，5 min/次。將樣本與Alexa Flour Plus 488/555 熒光二抗（1∶200）常溫避光孵育1 h。PBS 洗滌3 次后，用抗熒光淬滅封片劑封片，立即使用光學顯微鏡觀察并采集圖片。

1.3 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 9.2 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HG誘導NRK-49F細胞活化

NC 組與DM 組小鼠血清BG、Scr 水平比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），DM 組高于NC 組。見表1。

表1 NC組與DM組小鼠血清BG、Scr水平比較（n=5，±s）

表1 NC組與DM組小鼠血清BG、Scr水平比較（n=5，±s）

組別NC組DM組t 值P 值BG/（mol/L）8.33±1.70 30.49±4.41 10.480 0.000 Scr/（μmol/L）5.98±1.47 11.00±0.71 6.899 0.000

2.2 NC 組與DM 組小鼠腎組織HE、Masson 染色

高倍鏡下觀察可見DM 組小鼠腎小管排列紊亂，部分腎間質可見炎癥細胞浸潤且出現明顯的藍染的膠原纖維沉積，NC 組小鼠腎組織無明顯病理改變。見圖1。

圖1 NC組與DM組小鼠腎組織HE、Masson染色

2.3 DM 組與NC 組小鼠腎組織α-SMA、CollgenⅠ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對表達量比較

DM 組與NC 組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p-p65 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05），DM 組高于NC 組。兩組NF-κB p65 蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2 和表2。

圖2 各組小鼠腎組織各蛋白條帶圖

表2 DM組與NC組小鼠腎組織α-SMA、Collgen Ⅰ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對表達量比較（n=5，±s）

表2 DM組與NC組小鼠腎組織α-SMA、Collgen Ⅰ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對表達量比較（n=5，±s）

組別NC組DM組t 值P 值α-SMA 0.46±0.09 0.99±0.16 4.981 0.008 CollagenⅠ0.26±0.08 1.26±0.17 9.490 0.000 Fibronectin 0.31±0.11 0.74±0.88 5.356 0.006 SMYD2 0.52±0.09 0.89±0.21 2.813 0.048 H3K4me3 0.59±0.24 1.14±0.20 2.998 0.040 NF-κB p65 1.67±0.31 1.64±0.09 0.352 0.742 NF-κB p-p65 0.38±0.07 1.19±0.17 12.420 0.000

免疫熒光結果示，高倍鏡下觀察可見α-SMA、SMYD2 在NC 組小鼠腎組織低表達，但在DM 組小鼠腎組織中高表達。見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織免疫熒光檢測α-SMA、SMYD2定位圖

2.4 HG 刺激不同時間點NRK-49F 細胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2 蛋白相對表達量比較

HG 刺激小鼠0、6、12、24、36、48 h NRK-49F 細胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3 和圖4。

圖4 HG刺激不同時間點NRK-49F細胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白條帶圖

表3 HG刺激不同時間點NRK-49F細胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白相對表達量比較（n=3，±s）

表3 HG刺激不同時間點NRK-49F細胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白相對表達量比較（n=3，±s）

注：①與0 h比較，P＜0.05；②與6 h比較，P＜0.05；③與12 h比較，P＜0.05。

SMYD2 0.65±0.08 0.79±0.07 0.75±0.11 0.69±0.04 1.01±0.15①1.08±0.07①②③11.190 0.000時間0 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h F 值P 值α-SMA 0.38±0.05 0.33±0.04 0.38±0.09 0.68±0.08①②0.67±0.08①②0.72±0.03①②③22.240 0.000 CollagenⅠ0.31±0.17 0.38±0.09 0.41±0.09 0.86±0.19①②③0.99±0.15①②③1.04±0.11①②③17.510 0.000 Fibronectin 0.23±0.06 0.24±0.08 0.21±0.07 0.58±0.11①②③0.67±0.08①②③0.73±0.09①②③25.210 0.000

2.5 不同AZ505 的作用濃度組NRK-49F 細胞存活率比較

0.000 μmol/L 組、0.156 μmol/L 組、0.313 μmol/L組、0.625 μmol/L 組、1.250 μmol/L 組、2.500 μmol/L組、5.000 μmol/L 組、10.000 μmol/L 組、20.000 μmol/L組、40.000 μmol/L 組和60.000 μmol/L 組小鼠NRK-49F 細胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（96.34±1.82）%、（88.47±1.44）%、（86.73±1.33）%、（83.71±1.29）%、（81.15±2.34）%、（81.15±2.48）%、（77.77±2.16）、（71.91±5.39）% 、（23.24±1.52）% 、（0.09±0.16）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=385.000，P=0.000）。40.000 μmol/L 組、60.000 μmol/L組較0.000 μmol/L 組低（P＜0.05）。

2.6 AZ505可抑制HG誘導的NRK-49F細胞活化

NG 組、HG 組、HG + AZ505（2.500 μmol/L）組、HG + AZ505（5.000 μmol/L）組、HG + AZ505（10.000 μmol/L）組、HG+AZ505（20.000 μmol/L）組小鼠NRK-49F 細胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。HG 組較NG 組高（P＜0.05），HG +AZ505（20.000 μmol/L）組較HG 組低（P＜0.05），后續采用20.000 μmol/L AZ505 作用濃度用于實驗驗證。見表4 和圖5A。

圖5 各組小鼠NEK49F細胞的蛋白條帶圖

表4 各組小鼠NEK49F細胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2蛋白相對表達量的比較（n=3，±s）

表4 各組小鼠NEK49F細胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2蛋白相對表達量的比較（n=3，±s）

組別NG組HG組HG+AZ505（2.500 μmol/L）組HG+AZ505（5.000 μmol/L）組HG+AZ505（10.000 μmol/L）組HG+AZ505（20.000 μmol/L）組F 值P 值Fibronectin 0.40±0.05 0.97±0.13 0.94±0.11 CollagenⅠ0.52±0.05 1.08±0.09 0.90±0.16 SMYD2 0.67±0.12 1.04±0.17 0.81±0.07 0.70±0.17 0.87±0.09 0.75±0.09 0.71±0.15 0.90±0.13 0.54±0.07 0.66±0.16 7.228 0.003 0.64±0.12 9.572 0.000 0.37±0.13 12.420 0.000

20 μmol/L AZ505 干預后，NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組小鼠 NRK-49F 細胞Fibronectin、Collagen Ⅰ、α-SMA、H3K4me3、SMYD2蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。HG 組較NG 組高（P＜0.05），HG + AZ505 組較HG 組低（P＜0.05）。見表5和圖5B。

表5 各組小鼠NRK49F細胞α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、H3K4me3、SMYD2蛋白相對表達量的比較（n=3，±s）

表5 各組小鼠NRK49F細胞α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、H3K4me3、SMYD2蛋白相對表達量的比較（n=3，±s）

注：①與NG組比較，P＜0.05；②與NG+AZ505組比較，P＜0.05；③與HG組比較，P＜0.05。

SMYD2 0.61±0.08 1.06±0.04①②0.57±0.03 0.66±0.08③35.190 0.010組別NG組HG組NG + AZ505組HG + AZ505組F 值P 值α-SMA 0.63±0.28 1.39±0.22①②0.51±0.11 0.49±0.25③10.870 0.003 CollagenⅠ0.56±0.17 1.12±0.10①②0.44±0.07 0.86±0.08③23.060 0.000 Fibronectin 0.55±0.09 1.15±0.05①②0.57±0.06 0.64±0.12③33.270 0.000 H3K4me3 0.28±0.07 0.95±0.09①②0.44±0.16②0.27±0.12③23.490 0.000

2.7 各組小鼠NRK49F 細胞SMYD2 和α-SMA、SMYD2和NF-κB p-p65免疫熒光共定位

NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組小鼠NRK-49F 細胞SMYD2 和α-SMA、SMYD2 和NFκB p-p65 免疫熒光共定位結果示，高倍鏡下可見靜息狀態下，SMYD2 主要表達在細胞核、α-SMA 主要表達細胞質；HG 刺激后，兩者的定位未發生改變但熒光強度均增加。靜息狀態下，NF-κB p-p65 主要表達細胞質，HG 刺激后，NF-κB p-p65 在細胞質和細胞核均有表達，即SMYD2 和NF-κB p-p65 在細胞核存在共定位，且兩者的熒光強度均增強，以上現象均可被AZ505 抑制。見圖6。

圖6 各組小鼠NRK49F細胞SMYD2和α-SMA、SMYD2和NF-κB p-p65免疫熒光共定位

2.8 各組小鼠NRK-49F 細胞NF-κB p65、NFκB p-p65蛋白相對表達量比較

NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組小鼠NRK-49F 細胞NF-κB p-p65 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；HG 組較NG 組高（P＜0.05），HG + AZ505組較HG 組低（P＜0.05）。各組小鼠NRK-49F 細胞NF-κB p65 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6和圖7。

表6 各組小鼠NRK-49F細胞NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對表達量比較（n=3，±s）

表6 各組小鼠NRK-49F細胞NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對表達量比較（n=3，±s）

注：①與NG 組比較，P＜0.05；②與NG+AZ505 組比較，P＜0.05；③與HG組比較，P＜0.05。

NF-κB p-p65組別NF-κB p65 0.42±0.29 1.11±0.18①②0.65±0.07 0.52±0.25③6.027 0.019 NG組HG組NG+AZ505組HG+AZ505組F 值P 值1.09±0.14 1.06±0.15 0.99±0.19 1.31±0.20 1.904 0.208

3 討論

腎纖維化是CKD 向ESRD 轉化的共同途徑[20]，ECM 成分蛋白的過度沉積及瘢痕形成是進行性腎纖維化的主要病理事件[21]。肌成纖維細胞是腎纖維化的關鍵效應細胞[22]；在各種慢性損傷的作用下，肌成纖維細胞通過分泌CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Fibronectin 和層黏連蛋白發揮其促纖維化功能[23]。肌成纖維細胞來源包括NRK-49F 細胞、周細胞、腎小管上皮細胞等，其中NRK-49F 細胞活化是肌成纖維細胞的主要來源[24-25]。研究表明，在DKD進程中NRK-49F 細胞活化不僅受多種生長因子及細胞信號通路的調控，如血管緊張素Ⅱ、轉化生子因子-β 及磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B 等[26]；還受表觀遺傳學的調控，如染色質組蛋白修飾、DNA 甲基化及非編碼RNA 等，在DKD 的發病機制中也起關鍵作用[27]，然而表觀遺傳調控在腎成纖維活化中的作用還有待進一步闡明。

SMYD2 是研究最廣泛的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶之一，在胃癌、膀胱癌、結腸癌及乳腺癌等患者中高表達[28]；盡管一些研究已經報道SMYD2 在許多腫瘤中的作用和功能，但其在DKD 進展中的作用尚未明確。本研究結果中，與NC 組相比，DM 組可誘導小鼠腎組織損傷、腎纖維化指標（Fibronectin、CollagenⅠ）、肌成纖維細胞活化標志物（α-SMA）、SMYD2 及其組蛋白甲基化底物（H3K4me3）、NF-κB p65 亞基磷酸化表達增高，表明DM 組小鼠腎組織損傷且腎臟纖維化、肌成纖維細胞活化可能與SMYD2表達增高及NF-κB 激活有關。在體外使用HG 刺激NRK-49F 細胞發現，HG 可誘導NRK-49F 細胞活化伴SMYD2 表達上調；應用SMYD2 特異性抑制劑AZ505 可抑制HG 誘導的NRK-49F 細胞內SMYD2、ECM 成分蛋白及α-SMA 表達，提示SMYD2 可能介導HG 誘導的NRK-49F 細胞活化。

炎癥反應在腎纖維化進展中具有重要作用，NF-κB 作為炎癥反應的關鍵轉錄因子[29]，在腎臟纖維化中NF-κB 激活可通過誘導上皮間充質轉化、激活腎間質成纖維細胞及影響炎癥因子釋放等方式調控其發生、發展[30-31]。SMYD2 作為組蛋白甲基轉移酶也可甲基化非組蛋白（如NF-κB），從而調控細胞的生長、增殖、凋亡[32-33]。在三陰性乳腺癌細胞系中SMYD2 可通過協同甲基化和激活NF-κB，使NFκB p65 發生甲基化和磷酸化，促進乳腺癌細胞的增殖和活化[32]。研究表明，SMYD2 可促進NF-κB p65磷酸化，SMYD2 過表達可激活細胞中的NF-κB 信號通路，從而促進炎癥細胞因子的釋放[33]。本課題組前期研究發現應用SMYD2 特異性抑制劑AZ505 可下調單側輸尿管閉塞小鼠模型中小鼠腎臟中腎纖維化指標的蛋白表達，AZ505 或其特異性siRNA 抑制SMYD2 可抑制轉化生長因子β1 培養的腎間質成纖維細胞中蛋白的表達，明確了SMYD2 是腎纖維化及NRK-49F 細胞活化中的重要介質[34]。然而SMYD2 通過NF-κB 信號通路的激活如何調控DKD腎纖維化仍有待進一步明確。為評估SMYD2 介導HG 誘導的NRK-49F 細胞活化中的可能機制，本研究經免疫熒光檢測NF-κB p-p65 和SMYD2 在NRK-49F 細胞共定位及Western blotting 檢測NF-κB p65總蛋白及磷酸化蛋白水平，發現AZ505 可抑制NFκB p-p65 由細胞質轉入細胞核、并抑制其表達上調，提示SMYD2 可能通過調控NF-κB p65 磷酸化介導HG 誘導的腎臟成纖維細胞活化。

綜上所述，SMYD2 特異性抑制劑AZ505 可抑制HG 誘導的NRK-49F 細胞活化，其機制可能與抑制NF-κB 細胞信號通路激活相關，提示SMYD2 可能通過調控NF-κB 信號通路激活介導HG 誘導的NRK-49F 細胞活化。然而在DKD 的發展中，SMYD2 如何調控NF-κB 細胞信號通路及可能涉及到的具體機制有待進一步研究，也是本課題組接下來的研究重點。