低濃度鎘在kdrl：EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管粥樣硬化中的作用及其機(jī)制研究*

肖駿琦，侯慶豐，江志強(qiáng)，羅會(huì)霖，謝洋，張雷英，曾祥泰

（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血管外科，江西 贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州341000；3.贛州市甲狀腺腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000；4.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 甲狀腺外科，江西 贛州 341000）

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）、缺血性腦卒中、主動(dòng)脈瘤和下肢缺血。最近研究表明環(huán)境污染在心血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化中起著重要作用[1]。環(huán)境污染通過氧化應(yīng)激、炎癥、血小板活化及其他途徑導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。作為主要無機(jī)污染物的重金屬離子也會(huì)促進(jìn)心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化[2]。研究發(fā)現(xiàn)，鎘是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的潛在因素之一[3]。鎘與金屬硫蛋白結(jié)合，釋放到循環(huán)血液中，然后輸送到靶細(xì)胞和組織，可導(dǎo)致線粒體損傷、細(xì)胞死亡、炎癥和纖維化[4]。此外，低劑量鎘暴露也會(huì)提高病死率[5]。因此，評(píng)估鎘暴露的總體毒理學(xué)影響，包括其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用，這也是近年來研究的熱點(diǎn)。本研究通過復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化斑馬魚模型，并用不同濃度的鎘進(jìn)行處理，探索鎘在促動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其相關(guān)作用機(jī)制，為后續(xù)動(dòng)脈粥樣硬化鎘暴露的預(yù)防提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18 只Tg（kdrl：EGFP）系幼年斑馬魚（武漢國家斑馬魚資源中心），培育繁殖斑馬魚子代，用于復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化斑馬魚模型。本研究主要在贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室和贛南師范大學(xué)斑馬魚實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。成年斑馬魚飼養(yǎng)條件按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，本研究程序及動(dòng)物使用方案已通過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

脂多糖（美國Sigma 公司，貨號(hào)：L2880），阿托伐他汀（美國輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051408，規(guī)格：20 mg），實(shí)驗(yàn)室用標(biāo)準(zhǔn)溶液鎘Cd單元素標(biāo)準(zhǔn)品（上海希言科學(xué)儀器有限公司，貨號(hào)：N9300176r），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色（上海滬震生物公司，貨號(hào)：HZ7070），免疫組織化學(xué)試劑盒（上海凱基生物公司，貨號(hào)：KGOS60），免疫組織化學(xué)CD31、CD68、HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF一抗（美國Abcam 公司產(chǎn)品）。

1.3 脂多糖及鎘溶液的配制

將1 mg 脂多糖重懸于1 mL 無菌平衡鹽溶液，輕輕旋渦振蕩直至粉末完全溶解得到1 mg/mL 儲(chǔ)存液，分裝后置于-20 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩①徺I的標(biāo)準(zhǔn)溶液鎘進(jìn)行稀釋后備用[6-7]。

1.4 Tg（kdrl：EGFP）成年動(dòng)脈粥樣硬化斑馬魚的復(fù)制

將18 只Tg（kdrl：EGFP）幼年斑馬魚（雄雌各半）在含有10 μg/mL 脂多糖的Egg water 中飼養(yǎng)，并用含8%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)45 d，少量多餐，復(fù)制Tg（kdrl：EGFP）]成年動(dòng)脈粥樣硬化斑馬魚模型[8]。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

將復(fù)制成功的成年動(dòng)脈粥樣硬化斑馬魚分為3 組，每組6 只：A 組不做處理；B 組添加30 μmol/L 鎘，鎘濃度通過系統(tǒng)水達(dá)到此濃度；C 組添加30 μmol/L鎘+ 阿托伐他汀，阿托伐他汀通過浸泡給藥。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 血清鎘濃度檢測鎘處理后，用5 號(hào)針頭在各組斑馬魚尾靜脈取血約200 μL，離心后收集血清，分裝標(biāo)記后置于-20 ℃冰箱保存待測[9]。

1.6.2 熒光顯微鏡觀察斑馬魚血管中的膽固醇積累和血管內(nèi)皮厚度模型復(fù)制并鎘處理后，禁食24 h，使用Tg（kdrl：EGFP）動(dòng)脈粥樣硬化斑馬魚模型，在飼料中添加10 μg/g 熒光膽固醇，C 組加入阿托伐他汀 200 μg/L，浸泡給藥。模型復(fù)制5 d 后，將斑馬魚浸入0.03% 3-氨基苯甲酸乙酯溶液中≤ 3 min 以誘導(dǎo)麻醉，在熒光顯微鏡下觀察，使用Imaris?軟件對(duì)圖像進(jìn)行3D 分析，用于量化膽固醇積累和血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]。

1.6.3 HE染色模型復(fù)制并鎘處理后，禁食24 h，將所有斑馬魚浸泡在過量的3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸（1.33 g/L）中安樂死，并用多聚甲醛完全固定，手術(shù)切取各組斑馬魚血管斑塊組織標(biāo)本，切片后冷凍保存待測。依次將切片放入二甲苯、酒精中脫蠟后蒸餾水洗，放入Harris 蘇木精染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化5 s，自來水沖洗2 min，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗2 min，伊紅染色2 min，酒精和二甲苯脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡鏡下觀察并收集圖像進(jìn)行分析。

1.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA表達(dá)采用TRIzol 法提取各組斑馬魚血管斑塊組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以其為模板，用qRT-PCR 試劑盒擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量。qRTPCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6.5 Western blotting 檢測斑馬魚血管斑塊組織HIF-1a、p-Akt、p-P70、VEGF 蛋白表達(dá)取各組斑馬魚血管斑塊組織加入適量RIPA 裂解液于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清液，加入等量總蛋白上樣，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，置入含5%脫脂奶粉的封閉液內(nèi)封阻1 h，分別加入一抗（1∶500）后置于4 ℃中過夜，PBST 洗滌3 次，10 min/次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫下孵化2 h，PBST 洗滌3 次，10 min/次，加入ECL 試劑顯影，以β-actin 為內(nèi)參，使用Image J 軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組斑馬魚血清鎘濃度比較

A、B、C 組斑馬魚血清鎘濃度分別為（10.32±0.46）、（25.54±1.21）、（26.61±1.32）μmol/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=849.200，P=0.000）；B、C 組血清鎘濃度高于A 組（P＜0.05）；B 組與C 組血清鎘濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組斑馬魚血管內(nèi)皮厚度和血管中膽固醇積累情況

A、B、C 組斑馬魚血管內(nèi)皮厚度分別為（3.32±0.28）、（5.61±0.32）、（3.41±0.29）μm，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=114.300，P=0.000）；B 組斑馬魚血管內(nèi)皮層厚度較A、C 組增厚（P＜0.05），且血管中膽固醇積累明顯；A 組與C 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 3組斑馬魚血管中膽固醇積累情況

2.3 各組斑馬魚血管斑塊組織的HE染色情況

與A、C 組比較，B 組炎癥細(xì)胞浸潤的脂肪變性更明顯，且細(xì)胞核懸掛在中心或擠壓到側(cè)面。見圖2。

圖2 3組斑馬魚血管斑塊組織（HE染色×400）

2.4 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

A、B、C 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于A、C 組（P＜0.05）；A 組與C 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=6，±s）

表2 3組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=6，±s）

注：? 與A、C組比較，P＜0.05。

組別A組B組C組F 值P 值VEGF mRNA 6.21±1.54 16.76±4.26?5.97±1.49 254.816 0.000 HIF-1α mRNA 8.43±1.41 15.26±2.54?8.61±1.67 265.320 0.000 p-Akt mRNA 5.21±1.13 13.36±3.21?5.47±1.29 287.612 0.000 p-P70 mRNA 3.22±0.61 7.62±1.11?3.37±0.68 143.165 0.000

2.5 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

A、B、C 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B 組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于A、C 組（P＜0.05）；A 組與C 組斑馬魚血管斑塊組織差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖3。

圖3 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白的表達(dá)

表3 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=6，±s）

表3 各組斑馬魚血管斑塊組織HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=6，±s）

注：? 與A、C組比較，P＜0.05。

組別A組B組C組F 值P 值VEGF蛋白0.25±0.05 0.41±0.07?0.27±0.06 12.472 0.029 HIF-1α蛋白0.32±0.06 0.51±0.08?0.31±0.06 17.652 0.021 p-Akt蛋白0.29±0.05 0.57±0.09?0.28±0.05 14.432 0.023 p-P70蛋白0.24±0.04 0.42±0.06?0.25±0.05 12.165 0.031

3 討論

鎘是一種持久性的非必需有毒金屬，在職業(yè)和環(huán)境暴露水平上都會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生不利影響，最顯著的毒性作用是腎臟損傷和骨質(zhì)疏松/骨軟化。此外，鎘具有致癌作用，在職業(yè)暴露時(shí)會(huì)導(dǎo)致肺氣腫[11]。人類對(duì)鎘的接觸普遍存在，主要的接觸來源是食物和煙草煙霧。鎘存在于農(nóng)業(yè)土壤中，既作為自然背景，也因磷肥而增加。對(duì)非吸煙者，水稻、小麥、蔬菜和土豆通常等農(nóng)產(chǎn)品占攝入量的主要部分。在歐洲和北美，鎘攝入量為10～20 μg/d[12]，鎘主要積聚在腎臟（約50%）、肝臟和肌肉中。紅細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有高濃度鎘，而其在血漿中的濃度非常低。鎘沒有有效的排泄機(jī)制，只有少量的鎘通過尿液排泄，因此消除非常緩慢，半衰期為10～40年。

在對(duì)普通人群的鎘和心血管疾病綜述中，有9 項(xiàng)研究報(bào)告了鎘暴露與冠心病的關(guān)系。先前的綜述和薈萃分析還包括對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病這一更廣泛疾病概念的研究，包括高血壓、心力衰竭或心律失常[13-16]。3 項(xiàng)橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，血液或尿液鎘與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病呈正相關(guān)[17-19]，這與最近的研究一致[20-22]，但其相關(guān)分子機(jī)制目前尚不明確。本研究通過復(fù)制斑馬魚動(dòng)脈粥樣硬化模型，從組織、分子水平研究相關(guān)可能的作用機(jī)制。組織水平上通過對(duì)斑馬魚血管斑塊中膽固醇的積累情況進(jìn)行分析，證實(shí)鎘可促進(jìn)膽固醇積累，這與既往鎘能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成的研究結(jié)果一致，同時(shí)HE 染色證實(shí)鎘可促進(jìn)氣球樣變等動(dòng)脈粥樣硬化病理過程的發(fā)生。阿托伐他汀作為甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制劑，可顯著降低血清低密度脂蛋白膽固醇，中度降低甘油三酯，輕度升高高密度脂蛋白膽固醇，臨床上常用于治療高膽固醇血癥。本研究中在鎘處理的基礎(chǔ)上增加阿托伐他汀，斑馬魚斑塊組織中的膽固醇積累及氣球樣變明顯改善，再次證實(shí)其降膽固醇的作用。

PERSON 等[23]報(bào)道鎘可使肺癌細(xì)胞HIF-1α 水平升高，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，因此認(rèn)為鎘與HIF-1a 呈正相關(guān)。WANG 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路激活可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，p-Akt 是PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)活化的關(guān)鍵步驟，由此可見p-Akt 在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，CHEN 等[25]發(fā)現(xiàn)鎘可促進(jìn)Akt 和P70的磷酸化水平，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；此外，WEI 等[26]發(fā)現(xiàn)低濃度鎘可通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，介導(dǎo)血管增生。以上研究均認(rèn)為鎘與HIF-1α、p-Akt、p-P70 與VEGF 密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，鎘可促進(jìn)HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)，與上述研究結(jié)果相符。在鎘的基礎(chǔ)上增加阿托伐他汀后，HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，再次證實(shí)阿托伐他汀的降脂作用。

綜上所述，低濃度鎘可促進(jìn)kdrl：EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，相關(guān)分子機(jī)制與HIF-1α、p-Akt、p-P70、VEGF 有關(guān)，阿托伐他汀可逆轉(zhuǎn)鎘的促動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。考慮到本研究目前僅在斑馬魚中進(jìn)行，可能存在一定的局限性，后續(xù)還需要進(jìn)一步研究是否涉及其他相關(guān)分子機(jī)制。