基于網(wǎng)絡藥理學的白術(shù)-菟絲子藥對治療多囊卵巢綜合征的分子機制研究

范彩蓮，徐傳花

（1.南京中醫(yī)藥大學研究生院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院常州市中醫(yī)醫(yī)院婦科，江蘇 常州 213004）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種在青少年和生育階段婦女中較為普遍的一種婦科內(nèi)分泌疾患，其發(fā)生率為5%～17%，并且在逐年增加，主要與遺傳和環(huán)境等因素相關[1]。PCOS的主要癥狀有無排卵、雄激素過多、胰島素抵抗、內(nèi)分泌失調(diào)、糖脂代謝紊亂、月經(jīng)紊亂、肥胖、痤瘡等。目前的西醫(yī)治療方法是調(diào)整月經(jīng)周期、抗雄激素、胰島素增敏劑、促排卵藥等。在中醫(yī)學上，腎虛、脾虛是其發(fā)病原因，治療以補腎健脾為主要思路，改善脾腎虧虛型PCOS 患者中醫(yī)癥狀體征[2]。醫(yī)學信息技術(shù)是通過計算機技術(shù)和計算機技術(shù)建立藥物成分、靶點和疾病之間的聯(lián)系[3]，分析藥物的有效成分與藥物靶點之間的聯(lián)系。整體觀念和辨證論治是中醫(yī)的根本特征，符合中醫(yī)網(wǎng)絡化、系統(tǒng)化的特征。目前，利用網(wǎng)路藥物的方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了斷續(xù)-桑寄生[4]、當歸-菟絲子對[5]、半夏-蒼術(shù)-香附[6]對多囊性卵巢綜合征的療效機理進行了系統(tǒng)的探討。利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)從中藥中抽取中藥應用網(wǎng)絡藥理學的方法對白術(shù)-菟絲子進行中藥成分的分析，有利于為臨床治療PCOS 提供參考[7]。本研究通過對中藥化學成分、靶點和途徑的研究，從總體上闡明其對PCOS 的影響機理，為PCOS 的臨床防治奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 白術(shù)-菟絲子化學成分的獲取和篩選 從TCMSP（http:/tcmspw.com/tcmspw.com）數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索當歸、菟絲子2 種中草藥的化學組成成份，并按照現(xiàn)有的研究報告對尚未預見到的有效物質(zhì)的目標進行研究。在完成了對蛋白靶點的規(guī)范化之后，將其功能的蛋白靶點整合到Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）。

1.2 PCOS 靶標的選擇 以“polycystic ovary syndrome”作為關鍵字，對GeneCards（https://go.drugbank.com）、DisGeNET（https://www.disgenet.org）、PharmGKB（https://www.pharmgkb.org）、DrugBank.com（https://go.drugbank.com）等數(shù)據(jù)庫中PCOS 可能的靶標進行深入的研究。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，更高的Score 數(shù)值表示這個目標與疾病有很大的關系。從實踐來看，如果靶點太多，那么將PCOS 的潛在靶位設置成Score＞中位的靶標，將4 個病灶的數(shù)據(jù)進行整合，將其移出PCOS 的靶位。

1.3 PCOS 靶點PPI 網(wǎng)絡的建立 通過Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es）將兩者靶點取交匯，并繪出韋恩圖，以闡明其與PCOS 靶點間的關系。然后，將交集靶點通過STRING11.0（https://string-db.org）的蛋白交互作用（PPI）網(wǎng)絡模式[8]，將生物物種選為“Homo sapiens”，最少交互活動閾值設為“highest confidence”（＞0.9），將單獨的目標隱藏起來，其它均為缺省設置。

1.4 PCOS 靶點功能與通路的富集分析 Metascape平臺（http://metascape.org/gp/index.html）具有完整的注釋能力，而且每個月都會有關于遺傳標注的數(shù)據(jù)信息[9]。將白術(shù)-菟絲子治療PCOS 的目標基因?qū)隡etascape，設定P＜0.01，通過Metascape 平臺對其主要生理過程和代謝途徑進行GO 分析，包括GO Biological Processes、GO MolecularFunctions、GO Celluar Components 及KEGG 分析，并將GO 分析的富集結(jié)果導入微生信在線作圖平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）中進行可視化展示。

1.5 PCOS 靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 采用Cyto Scape3.7.1 建立了“白術(shù)-菟絲子”組分-PCOS 靶-路徑網(wǎng)絡，通過CytoScape3.7.1 的內(nèi)部軟件對其有效成份和靶位進行了分析，其中包含了連通度、介度和緊密度等因素，通過網(wǎng)絡拓撲學的參量來判定藥物的核心作用。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)-菟絲子活性成分靶點的獲取 初步提取白術(shù)化學成分55 種、菟絲子化學成分29 種，經(jīng)ADME篩選后共獲得白術(shù)5 種、菟絲子10 種活性成分，包括a-谷甾醇、山奈酚、苦參堿、槲皮素等，見表1。白術(shù)成分作用靶點20 個、菟絲子成分作用靶點198個，合并后刪除重復值共得到靶點198 個。

表1 白術(shù)-菟絲子藥對主要成分

2.2 PCOS 相關靶點的獲取 從Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得PCOS 靶點2783 個,根據(jù)經(jīng)驗設定Score＞中位數(shù)的目標靶點為PCOS 的潛在靶點，如通過GeneCards所得PCOS 靶點Score 最大值為277.7，最小值為0.19，中位數(shù)為6.97，故設定Score＞6.97 的靶點為高血脂癥的潛在靶點。結(jié)合DisGeNET、PharmGKB、DruBank 數(shù)據(jù)庫補充相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到2200 個PCOS 相關靶點。

2.3 白術(shù)-菟絲子成分-PCOS 靶點PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建白術(shù)-菟絲子藥對成分靶點與疾病靶點取交集，并用Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲得137 個白術(shù)-菟絲子組合物-PCOS 靶點，見圖1。最后將該靶標遞交給STRING11.5，獲得了白術(shù)-菟絲子靶向PPI 的結(jié)構(gòu)，見圖2。因為在PPI 網(wǎng)絡中，蛋白質(zhì)起著互相影響的功能，因此一般將其歸入無向圖。PPI 的復合網(wǎng)中，局部高濃度的區(qū)域叫做Module。Module 是PPI 的一個潛在的子網(wǎng)，它的子網(wǎng)連線密度高，局部連接的數(shù)量很小，所以Module 被看作是一個有重要的生物群，它包含2 個含義：一為蛋白質(zhì)復合體，它是由多種蛋白構(gòu)成的復合物，從而起到生物的作用；一是功能模組，例如在相同路徑上的蛋白之間的交互作用更為緊密。因此，為了更準確地研究其對PCOS 的影響機理，需要對其進行深入的研究。在獲得PPI 網(wǎng)絡后，利用CytoScape3.7.1 中的MCODE 插件，通過分子復合物檢測算法對相互作用關系進行分析，從而獲得Module，見圖3。按照P數(shù)值，將PPI 網(wǎng)絡和Module 中的3 個最優(yōu)的分生物過程對其進行功能描述，見表2。

圖1 白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 靶點韋恩圖

圖2 白術(shù)-菟絲子藥對--PCOS 主要靶點PPI 網(wǎng)絡

圖3 白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 靶點PPI 網(wǎng)絡中的Module

表2 白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 靶點PPI 網(wǎng)絡功能描述

2.4 靶點功能與通路的富集分析 利用Metascape 的數(shù)據(jù)平臺，通過微生信（http://bioinformatics.com.cn)，對其進行了信號途徑的解析，白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 靶點通路富集結(jié)果見表3。從研究的結(jié)果可以看出，多個目標的作用與PCOS 的發(fā)生密切相關。白術(shù)-菟絲子藥物對機體作用的主要生理作用有外傷反應、無機物質(zhì)反應、凋亡信號途徑、細胞增殖的負向調(diào)節(jié)作用、細胞對氮的反應，相關靶點調(diào)節(jié)PCOS的功能主要富集于蛋白激酶結(jié)合、蛋白域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、氧化還原酶活性、蛋白激酶活性等，見圖4A；參與的通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路以及TNF 信號通路等，見圖4B。

圖4 白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 主要成分潛在靶點的富集分析

圖5 白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 靶點-通路網(wǎng)絡圖

表3 白術(shù)-菟絲子藥對-PCOS 靶點通路富集結(jié)果

2.5 白術(shù)-菟絲子成分-PCOS 靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 利用CytoScape3.7.1 中的NetworkAnalyzer 對PCOS 進行了研究，獲得了其主要組成和主要的藥理靶標。Cytoscape 網(wǎng)絡的結(jié)果顯示，槲皮素結(jié)合度（Degree）為74，而中度（Betweenness Centrality）為0.6059，而在致密程度（Closeness Centrality）為0.6059；槲皮素（結(jié)合度24，介度0.0675，緊密度0.4256)、異鼠李素（結(jié)合度2416，介度0.0239，緊密度0.3880）、β-谷甾醇（結(jié)合度13，中度0.0295，緊密度0.3980)，參見表4。AKT1 在網(wǎng)絡中的連接度為20，介度為0.0260，緊密度為0.5104，預測AKT1 為白術(shù)-菟絲子調(diào)治PCOS 的最主要靶點。JUN、CASP3、MAPK8、TNFIL6、MAPK1、CCND1、TP53、MAPK14 亦為相對重要的靶點，見表5。

表4 白術(shù)-菟絲子藥對主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

表5 白術(shù)-菟絲子藥對主要活性成分靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

3 討論

PCOS 是一種比較常見的婦科內(nèi)分泌系統(tǒng)病癥，也是導致女性排卵困難的主要原因。中醫(yī)治療PCOS 的效果并不遜于西醫(yī)，特別是對該病的潛在治療效果。郭靈娜[10]經(jīng)臨床實驗證明，加用白術(shù)-菟絲子對的補腎化痰方與二甲雙胍聯(lián)合應用具有明顯的療效，能明顯改善患者的胰島素耐受性和臨床癥狀，并能明顯提高患者的排卵和受孕率，具有較好的安全性。劉暢[11]研究發(fā)現(xiàn)采用白術(shù)-菟絲子配伍的補腎健脾方劑可以明顯改善PCOS 的臨床表現(xiàn)，使PCOS 不育患者獲得優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠數(shù)和臨床妊娠率，使PCOS 不育患者的BMP-15蛋白含量明顯增高。有動物試驗結(jié)果顯示[12]，白術(shù)多糖可顯著提高db/db2 型糖尿病模型大鼠的胰島素敏感度，提高其糖耐量、減少空腹和血漿中的胰島素含量，提高其對胰島素的敏感度。柯江維等[13]認為，菟絲子可以增加下視丘-垂體促性腺的作用，增加其對促性腺激素分泌的響應能力，促進卵泡的生長，增加HCG/LH 的數(shù)量和作用，同時還可以使其產(chǎn)生類似于雌激素的作用。可見，白術(shù)-菟絲子在很大范圍內(nèi)起到了補腎健胃的功效。

本研究采用網(wǎng)絡藥物分析技術(shù)，對PCOS 有效組份進行了初步的篩選。有關研究顯示[14]，槲皮素可能會降低CYP17A1 的表達，進而降低雄性荷爾蒙的含量。槲皮素能提高PCOS 大鼠PCOS 患者的P-AMPK、SIRT-1 蛋白的表達，能使PCOS 患者出現(xiàn)不同程度的病理改變，同時還能提高其對胰島素的敏感度，從而提高PCOS 患者的治療效果[15]。在體外培育綿羊次級卵泡時，山萘酚可以維持綿羊卵泡存活，增加綿羊體內(nèi)的線粒體活力，并能誘導PI3K 信號途徑[16]，從而促進卵泡的發(fā)育，從而改善PCOS 的生育機能。異鼠李素能提高GLUT4 在低水平下的代謝途徑中的GLUT4 轉(zhuǎn)位，提高其對血糖的吸收，為PCOS 患者的胰島素耐受提供了新的途徑[17]。β-谷甾醇可以提高P-AKT、P-PIK3CA 的表達，并使其增強顆粒細胞的增生，并使Caspase-3 蛋白的表達減少，從而對其凋亡有一定的影響[18]。因此，白術(shù)-菟絲子的作用很大可能通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇等治療PCOS。

AKT1 的結(jié)合性是20，介度是0.0260，緊密度是0.5104，推測AKT1 是治療PCOS 的重要目標。另外，JUN、CASP3、MAPK8、TNFIL6、MAPK1、CCND1、TP53、MAPK14 也是比較有意義的研究對象。由表5 可知，白術(shù)-菟絲子對PCOS 的作用主要是AKT1，JUN 也是其作用的一個重要靶標。高雄激素是PCOS 患者的一種典型臨床表現(xiàn)，高雄激素PCOS 患者中AKT1 基因的表達較高，且與AKT1含量有顯著關系[19]，能明顯地降低AKT1 的磷酸化[20]，并能有效地降低高雄激素的分泌，進而降低卵巢狀況及高雄激素的癥狀。中國漢族患者胰腺和周圍組織AKT1 的缺失，會造成高葡萄糖血癥和高血糖[21，22]，AKT1 的半衰期可以使AKT2 缺乏的小鼠產(chǎn)生輕微的胰島素抵抗，從而發(fā)展成2 型糖尿病。白術(shù)-菟絲子是脾腎虧虛型PCOS 患者的主要藥物，包括AGE-RAGE（hsa04933）、IL-17（hsa04657）和TNF（hsa04668）。有研究表明[23]，通過抑制AGE-RAGE 的訊息途徑，能有效地抑制葡萄糖飼用者的葡萄糖耐受；缺乏RAGE 的老鼠，其胰島素敏感度及血清脂聯(lián)素含量均高于野生組。在2型糖尿病患者的脂肪中，AGE-RAGE 軸向的表達也有一定的作用。目前，已有學者提出[24，25]，IL-17是一種重要的促炎性物質(zhì)，它可以提高T 淋巴細胞的活力，并促進多種促進炎性介質(zhì)的分泌，如IL-1、IL-6、TNF-a、NOS-2、Metal PCOS（TNF-a）、NOS-2、MMP-2、B 等多種促炎因子的作用，從而減輕炎癥的發(fā)生。因此，認為白術(shù)-菟絲子對緩解炎癥的作用，可以通過阻斷AGE-RAGE 的通路途徑，促進IL-17 和TNF 的通路途徑，進而改善胰島素的耐受性。

本研究顯示，白術(shù)-菟絲子可以通過調(diào)節(jié)多個靶點來調(diào)節(jié)PCOS 中的多種生理機制和信號通路，但相同的藥物可以調(diào)節(jié)多個靶點，顯示出多途徑多靶點的協(xié)同效應。因此，可以利用白術(shù)-菟絲子作為藥物對PCOS 的有效控制，從而為進一步探索其可能和機理奠定基礎。由于中藥網(wǎng)的限制，以及中藥中的有效成份在體內(nèi)產(chǎn)生了一種復合的化學作用，本研究的缺點在于沒有深入分析有效成分在人體中的作用機制。本研究對白術(shù)-菟絲子藥對的潛在治療作用進行了淺顯的討論，為臨床運用白術(shù)-菟絲子藥對治療PCOS 提供了初步的證據(jù)，仍需進一步的相關實驗研究進行驗證，進而明確白術(shù)-菟絲子藥對主要調(diào)控的蛋白靶點。