基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術與網絡藥理學研究趕黃草保肝潛在藥效物質基礎和作用機制

田海濤，蔡春穎，趙東升，張龍霏，鄧志鵬

山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355

趕黃草又名水澤蘭、水楊柳，為趕黃草屬PenthorumGronov.ex L.植物扯根菜Penthorum chinensePursh 的干燥地上部分，主要分布在我國華北、華東、中南及陜西、四川和貴州等地，其中四川古藺是其主要產地[1]。趕黃草先后被《重慶市中藥材標準（2022 年版第一批）》《四川省中藥材質量標準（2010 版）》《湖南省中藥材標準（2009 年版）》所收載，為苗族傳統(tǒng)用藥，在保肝方面發(fā)揮著重要作用，常用于治療各種肝病。現代藥理研究表明其具有治療肝損傷、抑制肝纖維化和肝硬化、治療慢性活動性肝炎等作用[2-3]，其單方制劑肝蘇顆粒常用于治療膽囊炎、黃疸、非酒精性及酒精性脂肪肝和感染性肝炎，具有良好的臨床療效。趕黃草中含有黃酮、木脂素、有機酸、苯丙素類等多種活性成分，其中黃酮和木酯素是最趕黃草中含量較高的成分，且研究顯示趕黃草中的黃酮和木酯素成分具有顯著保肝活性[4-5]。

本實驗通過檢索文獻構建趕黃草化學成分數據庫[6-8]，運用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術分析趕黃草信息，部分成分用標準品進行比對驗證，其余成分通過保留時間及二級質譜數據對比推斷確認，在此基礎上，應用網絡藥理學及分子對接方法探究趕黃草保肝作用靶點及作用機制。本研究結果對趕黃草的質量控制及藥效機制研究有一定的推動作用，為趕黃草藥材的研究開發(fā)提供一定實驗依據與參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，Thermo Fisher，美國）；乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；槲皮苷（批號PCS-210509）、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷（批號PCS-210609）、槲皮素（批號PCS-210921）、芹菜素（批號PCS-210513）、蘆丁（批號PCS-210717）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（批號PCS-211209）、山柰素（批號PCS-220321）、趕黃草苷A（批號PCS-210920）、趕黃草苷B（批號PCS-220716）、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷（批號PCS-211109）、阿福豆苷（批號PCS-210911）、山柰酚（批號PCS-211208）、原兒茶酸（批號PCS-211009）、喬松素-7-O-β-D葡萄糖苷（批號PCS-211120）、兒茶素（批號PCS-211018）、沒食子酸（批號PCS-210710）、喬松素（批號PCS-220316）對照品均購自成都植標化純生物技術有限公司，質量分數均＞98%；趕黃草（批號YL-772-2202-001）藥材購自安徽賀林中藥飲片科技有限公司，經山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定為虎耳草科植物扯根菜P.chinesePursh 的干燥地上部分。

1.2 儀器

超高壓液相串聯Ultimate 3000-Q-Exactive 高分辨質譜（Thermo Fisher Scientific，美國）；Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm；Phenomenex，美國）；ES-E120B 型電子分析天平（天津市德安特傳感技術有限公司）；Legend micro 17 微量離心機（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；PL-S20 超聲波清洗器（東莞康士潔超聲波科技有限公司）；YRE-501 型旋轉蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DLSB-Z C 型低溫循環(huán)真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.3 數據庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/index.php），PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org/），GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/），DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/），治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，http://bidd.group/index.html/）；UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/），DAVID 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），蛋白結構數據庫（PDB，http://www.rcsb.org/）；Cytoscape 3.7.2軟件；AutoDockTools1.5.6 軟件；AutoDockvina 插件；PyMOL 2.5.4 軟件；ChemDraw Professional 15.1軟件，Open Babel GUI 軟件。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

分別取趕黃草全草（含莖、葉、花）、莖、葉各50 g，切碎，加水煎煮3 次，每次加藥材量10 倍水煎煮2 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮，冷卻，加乙醇使含醇量達60%，攪拌，靜置，濾過，沉淀用60%乙醇洗滌3 次，合并洗液與濾液，回收乙醇并濃縮至稠膏。稠膏經干燥后，稱取500 mg 提取物溶于20 mL 60%甲醇中。所得樣品溶液經0.22 μm 濾膜濾過后進樣分析。

2.2 對照品溶液的制備

取槲皮苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮素、芹菜素、蘆丁、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山柰素、趕黃草苷A、趕黃草苷B、山柰素-3-O-阿拉伯糖苷、阿福豆苷、山柰酚、原兒茶酸、喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、兒茶素、沒食子酸、喬松素對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成槲皮苷1.12 mg/mL、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷 1.79 mg/mL、槲皮素 3.76 mg/mL、芹菜素1.21 mg/mL、蘆丁1.63 mg/mL、槲皮素-3-O-鼠李糖苷 1.67 mg/mL、山柰素 1.20 mg/mL、趕黃草苷A 1.56 mg/mL、趕黃草苷B 1.21 mg/mL、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷3.38 mg/mL、阿福豆苷1.25 mg/mL、山柰酚1.10 mg/mL、原兒茶酸2.34 mg/mL、喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷 1.13 mg/mL、兒茶素1.28 mg/mL、沒食子酸1.83 mg/mL、喬松素1.83 mg/mL 單標溶液，從各單標溶液中吸取10 μL 混合配制成混標溶液。

2.3 質譜檢測方法

2.3.1 色譜條件 Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相：0.05%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～40% B；30～35 min，40%～80% B；35～40 min，80% B；40～40.2 min，80%～5% B；40.2～45 min，5% B）；體積流量0.2 mL/min；進樣量3.0 μL；柱溫30 ℃；自動進樣器溫度4 ℃。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，噴霧電壓為3.5 kV，毛細管溫度350 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣，體積流量分別為10.5、3.0 L/min。分辨率70 000 進行全掃描，掃描范圍m/z80～1200，質譜掃描時間40 min。

2.4 趕黃草數據庫創(chuàng)建和分析

查閱國內外文獻資料以及檢索PubChem 數據庫、進行數據采集，整理趕黃草藥材所含的化學成分信息，包括化學成分、結構式、分子量等，構建趕黃草化學成分專屬數據庫，共收集整理105 種化合物。UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 獲得色譜峰一級、二級質譜，利用Thermo Scientific Xcalibur 軟件計算出高分辨精確相對分子質量，快速推測各色譜峰對應化合物的分子式，并與部分對照品的保留時間及二級質譜數據對比，運用ChemDraw 軟件繪制化合物結構并模擬碎片情況，與文獻二級碎片進行對照，推斷確認成分。

2.5 基于網絡藥理學趕黃草保肝機制預測

將鑒別的化合物依次輸入TCMSP 數據庫，依據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 篩選活性成分，TCMSP 數據庫中未收載成分結合文獻進一步篩選活性成分。運用PubChem 數據庫查找活性成分SMILES 結構，將活性成分SMILES 結構輸入SwissTargetPrediction 數據庫預測成分靶點，合并去重后得到趕黃草活性成分靶點。通過OMIM 數據庫、GeneCards 數據庫（Score≥5）、DisGeNET 數據庫（Score≥0.1）、TTD 數據庫檢索“hepatitis”與“hepatic injury”關鍵詞，獲取肝炎、肝損傷相關疾病靶點，合并去重后得到疾病靶點。運用微生信平臺（https://bioinformatics.com.cn/）取疾病靶點與化合物靶點交集，將交集靶點導入String 數據庫，評分條件設定為置信度＞0.7，獲得靶點間相互作用關系并導入Cytoscape 3.2.1 軟件，構建蛋白質-蛋白質互作（protein-protein interaction networks，PPI）網絡，同時計算degree 值，按照degree＞20 條件篩選獲得核心靶點。將核心靶點導入DAVID 6.8 數據庫進行基因本體（gene ontology，GO）生物過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，運用微生信平臺實現數據可視化，并利用Cytoscape 3.2.1 軟件進行拓撲計算，進一步篩選活性成分，構建“活性成分-核心靶點-通路”網絡。

2.6 分子對接

將篩選出的活性成分與核心靶點依次進行分子對接。運用PubChem 數據庫查找下載活性成分3D結構sdf 格式文件，進一步采用Open Babel GUI 軟件將sdf 格式文件轉化為pdbqt 格式文件。在PDB數據庫下載核心靶點蛋白3D 結構pdb 格式文件。進一步使用Autodock Tools 1.5.6 對蛋白數據進行加氫、除水等處理并保存為pdbqt 格式。運用Autodock vina 對活性成分和核心靶點對接打分，采用PyMOL 2.5.4 制作活性成分與核心靶點的結合模式圖。

3 結果

3.1 趕黃草化學成分鑒定

通過UPLC-Q-Exactive-MS 方法，在上述色譜和質譜條件下對趕黃草全草、莖、葉進樣分析，得到樣品正、負離子掃描模式的總離子流圖，見圖1。采用一級質譜全掃描和提取離子峰的方法，確定了趕黃草全草、莖、葉中64 個色譜峰（表1），其中確定49 個化合物，還有pinocembrin-7-O-[3′′-Ogalloyl]-glucoside 及同分異構體共5 個、趕黃草素A、趕黃草素B、趕黃草酮C、趕黃草酮D 及同分異構體共6 個、2′,6′-dihydroxydihydrochalcone-4′-O-[3′′-O-galloyl]-glucoside 及同分異構體共4 個。經過與對照品的保留時間、精準相對分子質量比較，準確鑒定出14 個化合物（趕黃草苷A、趕黃草苷B、阿福豆苷、兒茶素、槲皮素、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮苷、蘆丁、沒食子酸、喬松素、喬松素-7-Oβ-D-葡萄糖苷、芹菜素、山柰酚、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷）；通過與文獻研究提供的保留時間、相對分子質量、結構式、離子碎片，推測了其他35 個化合物結構。49 個化合物包括黃酮、有機酸、木脂素、苯丙素類化合物。

表1 趕黃草化學成分UPLC-Q-Exactive-MS 色譜/質譜信息Table 1 Chromatographic and MS information of chemical composition of P.chinense by UPLC-Q-Exactive-MS

圖1 趕黃草總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of P.chinense

3.1.1 黃酮類成分質譜解析 黃酮類化合物在趕黃草中數量較多，主要為槲皮素、喬松素和山柰酚的衍生物，質譜裂解容易發(fā)生脫糖基、脫水、環(huán)裂解。正負離子掃描模式下，槲皮素在19.61 min 產生準分子離子m/z301.035 0 [M－H]?和m/z303.049 7[M＋H]+，與槲皮素對照品一致。化合物13、16、18、20、22、24、25 均為槲皮素糖苷類化合物，正離子模式下產生m/z303 碎片離子（槲皮素苷元），負離子模式下產生m/z301 碎片離子（槲皮素苷元）。其中化合物16 保留時間為12.36 min，產生準分子離子[M＋H]+m/z611.160 5（C27H31O16）和 [M－H]?m/z609.146 4（C27H29O16），與對照品比對確定為蘆丁。化合物24 保留時間為14.73 min，產生準分子離子[M＋H]+m/z449.107 4（C21H21O11）和 [M－H]?m/z447.093 7（C21H19O11），與對照品比對確定為槲皮苷。化合物20 和22 為同分異構體，正負離子模式下均產生準分子離子 [M＋H]+m/z435.092 2（C20H19O11）和 [M－H]?m/z433.077 6（C20H17O11），正負離子模式下均丟失m/z132 產生槲皮素苷元碎片離子，推測為分別丟失木糖或阿拉伯糖部分，對比相關文獻和對照品[7]，鑒定化合物20、22 分別為槲皮素-3-O-木糖苷和槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷。

化合物59 在30.64 min 處產生準分子離子m/z255.066 3 [M－H]?和m/z257.080 8 [M＋H]+，與喬松素對照品一致。化合物35、46、55、56、60 均為喬松素糖苷類化合物，在正離子模式下產生m/z257碎片離子（喬松素苷元）、負離子模式下產生m/z255碎片離子（喬松素苷元）。化合物35、55、60 保留時間、準分子離子以及二級碎片離子與對照品一致，分別確定為喬松素-7-O-葡萄糖苷、趕黃草苷B、趕黃草苷A。化合物46 在26.10 min 處產生準分子離子m/z721.140 0 [M＋H]+和m/z719.125 4 [MH]?，化合物56 在29.24 min 處產生準分子離子m/z873.150 9 [M＋H]+和m/z871.136 3 [M－H]?，正負離子模式下，2 個化合物均產生m/z303/301（六羥基二苯基）、m/z257/255（喬松素苷元）、m/z153/151特征離子，分別推測為 pinocembrin-7-O-[4′,6′-HHDP]-glucoside、PGHG。化合物42 在23.41 min產生準分子離子m/z271.096 2 [M＋H]+和m/z269.082 0 [M－H]?，產生m/z167/165 特征碎片，表明有甲基取代，推測為山姜素。化合物27 保留時間15.84 min，產生準分子離子 [M＋H]+m/z433.148 9(C22H25O9)，二級裂解失去葡萄糖基（162）生成m/z271.096 1 碎片離子，此外還產生m/z167.033 8 特征碎片離子，推測為山姜素-7-O-葡萄糖苷。

化合物41 在23.34 min 產生準分子離子峰m/z287.055 0 [M＋H]+和m/z285.040 5 [M－H]?，與對照品比對確定為山柰酚。化合物19、26、29 均為山柰酚糖苷類化合物，在正離子模式下產生m/z287 碎片離子（山柰酚苷元）、負離子模式下產生m/z285碎片離子（山柰酚苷元）。化合物19、26、29 保留時間、準分子離子以及二級碎片離子與對照品一致，分別確定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷、阿福豆苷。

其他黃酮類有化合物5、23、34、37、39、44、49，其中化合物5、39 保留時間、準分子離子以及二級碎片與對照品一致，確定為兒茶素和芹菜素。化合物23、34、37、44、49 的準分子離子以及二級碎片與文獻一致[6-7,9-10]，初步推測為柚皮素葡萄糖苷、芹菜苷、柚皮素、2',4',6'-trihydroydihydrochalcon-4'-glucoside、趕黃草苷。

3.1.2 木脂素類成分質譜解析 化合物50、54 均產生準分子離子 [M＋H]+m/z343.117 3（C19H19O6），二級質譜裂解產生m/z325 和m/z203 特征離子，結合文獻報道推測為趕黃草酮A 和趕黃草酮B[6]。

3.1.3 有機酸成分質譜解析 化合物1、2、6、7、8、10、11、12、14、17 均為有機酸類化合物，化合物2 保留時間、準分子離子以及二級碎片與對照品一致，確定為沒食子酸。化合物7 保留時間為6.94 min，產生 [M＋H]+m/z197.081 2（C10H13O4），二級質譜裂解產生碎片m/z179（C10H11O3，[M＋HH2O]+），m/z151（C9H9O，[M＋H－H2O?CO2]+），推測為短葉蘇木酚。化合物6 保留時間為6.57 min，產生準分子離子[M＋H]+m/z293.028 6（C13H9O8)，二級生成m/z247 [M＋H－HCOOH]+、m/z219 [M＋H－HCOOH－CO]+、m/z191 [M＋H－HCOOH－2CO]+碎片，與文獻報道一致[11]，推測為短葉蘇木酚酸。化合物 11 產生準分子離子 [M＋H]+m/z307.044 8（C14H11O8），較短葉蘇木酚酸多14，推測為甲基化物，在正離子模式下二級質譜產生m/z247、219、191 碎片離子，推測為短葉蘇木酚酸甲酯。化合物17 產生準分子離子 [M－H]?m/z319.045 9（C15H11O8），較短葉蘇木酚 [M－H]?m/z291.014 6酸多28，推測為乙基化物，根據碎片離子結合文獻報道推測為短葉蘇木酚酸乙酯[11]。化合物1、8、10、12、14 二級碎片與文獻記載進行比對[6,12-14]，初步推測為柯子次酸、香草酸、云實素、丁香醛、鞣花酸。

3.1.4 苯丙素類成分質譜解析 化合物15、30、31為苯丙素類化合物。化合物30、31 為同分異構體，產生準分子離子 [M ＋H]+m/z505.170 3（C25H29O11），二級碎片產生m/z325（C19H17O5，[M＋H－H2O－C6H10O5]+）和m/z203（C12H11O3）特征碎片，結合文獻報道[6]推測為 2,3'-dihydroxy-3-methoxy-6′-methanone-benzophenone-4-O-glucoside、2,4-dihydroxy-3-methoxy-6′-methanone-benzo-phenone-3'-O-glucoside。化合物15 產生準分子離子 [M－H]?m/z607.094 7（C26H23O17），二級碎片產生m/z437（C19H15O12，[M－H－C7H8O5]?）、m/z293（C12H10O8，[M－H－C14H13O9]?）特征峰，結合文獻報道[9]推測為趕黃草苷C。

3.1.5 其他化合物質譜解析 化合物3、4、9、21、28、32、58，其中化合物3 在2.60 min 產生準分子離子m/z283.044 8（C12H11O8，[M＋H]+），二級碎片產生m/z237（C11H9O6，[M＋H－HCOOH]+）、m/z219（C11H7O5，[M＋H－H2O－HCOOH]+）、m/z191（C10H7O4，[M＋H－2HCOOH]+）的特征碎片，推測為penthorumnin B。化合物9 在8.35 min 處產生準分子離子m/z331.102 4（C14H19O9，[M＋H]+），二級碎片產生m/z169（C8H9O4，[M＋H－C6H10O5]+）、m/z151（C8H7O3，[M＋H－H2O－C6H10O5]+）的特征碎片，推測為2,6-二羥基苯乙酮-4-O-葡萄糖苷。化合物4、21、28、32、58 二級碎片與文獻記載對比[6,15]，初步推測為巖白菜素、2,6-二羥基苯乙酮-5-(2′-亞甲基-2(5H)-呋喃酮)-4-O-葡萄糖苷、2,6-二羥基苯乙酮-4-O-[4′,6′六羥基聯苯二酰基]?葡萄糖苷、penthorumnin C、2-hydroxyacetophenone-4-O-[4′,6′-hexahydroxydiphenoyl]?glucoside。

3.2 基于網絡藥理學趕黃草保肝作用機制預測

3.2.1 趕黃草活性成分篩選及其靶點預測 將上述49 個確定化合物輸入TCMSP 數據庫，依據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 篩選活性成分，數據庫中未收載成分根據文獻報道進一步篩選，得到活性成分28 個。將篩選出的活性成分輸入PubMed 數據庫查詢活性成分SMILES 結構，將SMILES 結構輸入SwissTargetPrediction 數據庫預測成分靶點，合并去重后得到趕黃草活性成分靶點335 個。

3.2.2 疾病靶點獲取 通過 OMIM 數據庫、GeneCards 數據庫（Score≥5）、DisGeNET 數據庫（Score≥0.1）、TTD 數據庫檢索“hepatitis”與“hepatic injury”關鍵詞，獲取肝炎、肝損傷相關疾病靶點，將4 個數據庫所得靶點合并后刪除重復項，獲得靶點1 554 個。運用微生信平臺取疾病靶點與化合物靶點交集，獲得交集靶點126 個，作為進一步分析的潛在作用靶點（圖2）。

圖2 成分靶點與疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of component target and disease target

3.2.3 PPI 網絡構建及核心靶點篩選 將126 個交集靶點導入String11.5 數據庫，設置關聯評分0.7，導出原始PPI 網絡圖（圖3）并下載TSV 文件，將TSV 文件導入Cytoscape 3.2.1 軟件，構建靶點PPI網絡（圖4）。結果顯示有118 個節(jié)點（去除8 個孤立節(jié)點），710 條邊，節(jié)點顏色越深，代表度值越大，說明該節(jié)點與其他蛋白相互作用多。以度值中位數的2 倍為界限篩選出24 個核心靶點，核心靶點具體信息見表2。

表2 24 個核心靶點具體信息Table 2 Specific information of 24 core targets

圖3 交集靶點原始PPI 網絡Fig.3 Original PPI network of intersection target

圖4 交集靶點PPI 網絡Fig.4 PPI network of intersection target

3.2.4 富集分析結果 將 24 個核心靶點導入DAVID 6.8 數據庫進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析根據FDR≤0.05 篩選得到163 個GO 條目，其中生物學過程（bioprogress，BP）條目122 個，包括蛋白激酶B 信號轉導的正調控、細胞遷移的正調控、凋亡過程的負調控、磷脂酰肌醇3-激酶信號、蛋白質磷酸化的正調控等方面；15個細胞組分（cell components，CC）條目，包括細胞質、細胞膜、質膜、細胞漿、細胞質核周區(qū)等方面；分子功能（molicular function，MF）條目26 個，包括激酶活性、胰島素受體底物結合、相同蛋白結合、ATP 結合、蛋白磷酸酶結合等方面。取各項前20 條導入微生信平臺進行可視化展示（圖5）。KEGG 通路根據FDR≤0.05 篩選得到131 條通路，主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、內分泌抵抗、癌癥信號通路、HIF-1 信號通路等，取前20條信號通路進行可視化分析（圖6）。

圖6 KEGG 通路富集分析結果Fig.6 KEGG enrichment analysis results

3.2.5 “活性成分-靶基因-通路”網絡構建 將28個活性成分、24 個核心靶點、KEGG 信號通路富集分析的前20 條通路導入Cytoscape 3.2.1 軟件構建“活性成分-靶基因-通路”網絡進行可視化分析，見圖7。通過“Analyze Network”分析網絡圖，得到60個節(jié)點，359 條邊，得到關鍵有效成分15 個（表3）。

表3 趕黃草關鍵有效成分Table 3 Key effective components of P.chinense

圖7 “活性成分-靶基因-通路”網絡Fig.7 Network of “active component-target gene-pathway”

3.3 分子對接驗證

將篩選出的15 個關鍵有效成分與24 個核心靶點依次進行分子對接，有效成分見表3。對接結果顯示，小于?5 kJ/mol 的結果占總數99.2%，?5～?7.0 kJ/mol 的結果占總數32.2%，小于?7.00 kJ/mol 的結果占總數的66.9%，關鍵有效成分與核心靶點結合能均小于?4.5 kJ/mol，顯示他們具有良好的結合活性。GAPDH、PIK3CA、MTOR、SRC、PIK3CD 與各成分均具有良好的結合活性，其中2′,4′,6′-三羥基二氫查耳酮-4′-β-D-葡萄糖苷可與GAPDH、MTOR、CASP3、SRC 相結合，與MTOR 結合能最低為?9.9 kJ/mol，作用位點是殘基谷氨酸49、半胱氨酸276、谷氨酰胺225、亮氨酸224；喬松素-7-O-葡萄糖苷可與GAPDH、MTOR、PIK3CA 相結合，與MTOR結合能為?9.0 kJ/mol，作用位點是精氨酸1945、亮氨酸1904、蘇氨酸1908；趕黃草苷可與GAPDH、PIK3CA、SRC、PIK3CD 相結合，與PIK3CA 結合能最低為?9.0 kJ/mol，作用位點是半胱氨酸838、谷氨酰胺630、天冬酰胺756；槲皮素3,4'-二葡糖苷可與GAPDH、PIK3CA、PIK3CD、MTOR 相結合，GAPDH 結合能最低為?11.3 kJ/mol，作用位點是天酰胺287、天冬酰胺239、蘇氨酸252、丙氨酸238；喬松素可與GAPDH、PIK3CA、PIK3CD 相結合，與PIK3CD 結合能為?8.2 kJ/mol，作用位點是蘇氨酸471；鞣花酸可與PIK3CA、GAPDH、MTOR 相結合，與GAPDH 結合能最低為?10.4 kJ/mol，作用位點是脯氨酸236、亮氨酸203、丙氨酸238、天冬氨酸239、天冬氨酸287，分子對接模式圖見圖8。

圖8 部分關鍵有效成分與核心靶點分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking diagram of some key active ingredients and core targets

4 討論

趕黃草是云貴川地區(qū)常用保肝藥材，其用藥歷史悠久，保肝療效顯著，在市場上已有單味藥成方的中成藥肝蘇制劑，現階段趕黃草研究報道相對較少，大部分集中在近十年，其相關研究尚不充分，中國藥典尚未收載趕黃草藥材。本實驗分析研究了趕黃草主要化學成分，并結合網絡藥理學與分子對接探討了趕黃草保肝藥效物質和潛在作用靶點及作用機制，為趕黃草進一步研究開發(fā)提供一定的依據。

本實驗利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術對趕黃草中的化學成分進行分析。通過對照品、保留時間、碎片信息、自建數據庫綜合識別了趕黃草水提物的化學成分，結果共鑒定出64 個色譜峰，49 個化合物。其中黃酮化合物有26 種，木脂素化合物2 種，有機酸化合物10 種，苯丙素類化合物4種，其它化合物7 種。對比趕黃草全草、莖、葉化學成分，三者化學成分種類相差較小，后續(xù)需要對部分化合物進行定量，探究化合物含量差異，以期為趕黃草藥材加工炮制提供一定幫助。

本研究網絡藥理學部分篩選出24 個核心靶點，網絡拓撲參數分析計算的結果顯示：HSP90AA1、STAT3、SRC 為度值排名前3 的靶點蛋白。利用Cytoscape 3.2.1 軟件構建“活性成分-靶基因-通路”網絡進一步篩選出的15 個關鍵有效成分中有11 個黃酮類化合物，2 個木脂素類化合物，2 個有機酸類化合物，說明這3 類物質可能是趕黃草主要保肝活性物質。分子對接結果顯示，除沒食子酸外其余成分均與度值排名前3 的靶點蛋白有強烈的結合活性。通過網絡分析發(fā)現，趕黃草活性成分發(fā)揮保肝作用的主要通路有HIF-1、PI3K-Akt、VEGF、TNF等信號通路。研究報道HIF-1 通路可以調控TNF-α炎癥因子，趕黃草可通過HIF-1 通路下調TNF-α 表達，抑制肝纖維化[16]。核心靶點中的HSP90AA1 是一種熱休克蛋白，熱休克蛋白具有分子伴侶活性，對于癌細胞的存活、增值、遷移及腫瘤血管的生成等功能至關重要，抑制HSP90AA1 表達，可以減少腫瘤細胞增殖，抑制核心靶點之一的VEGF 表達誘導的腫瘤轉移，同時抑制腫瘤血管生成，降低肝癌病變風險[17]。此外，核心靶點中的PIK3R、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 屬于PI3K 亞基，有文獻報道肝細胞癌中 Krüppel 樣轉錄因子 8（Krüppelliketranscription factor 8，KLF8 ） 在人肝癌SMMC7721 細胞中也可能通過PI3K-Akt 信號通路誘導VEGFA 的表達，進而調控腫瘤血管新生[18]。STAT3 是機體內調控細胞增殖、凋亡、上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和糖代謝等多種生物過程的重要轉錄因子，在肝癌中會被過度激活，因此抑制STAT3 活性可抑制肝癌細胞增值[19]。SRC 是酪氨酸蛋白激酶，參與細胞內多條信號傳導途徑，已有研究報道當PKC-Pyk2/SRC 通路中的SRC 蛋白表達受到抑制，人源肝星狀細胞HSC-LX2 的增殖就會被阻止[20]。

據相關文獻報道山柰酚、喬松素和槲皮素都對對乙酰氨基酚誘導產生的肝損傷有明顯的保護作用，喬松素保護機制可能是抑制肝細胞氧化應激，山柰酚和槲皮素保護機制可能與調控凋亡通路JNK 的表達水平有關[21-23]。槲皮素、沒食子酸和鞣花酸對CCl4所致小鼠急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與增強抗氧化損傷能力，降低TNF-α 炎癥因子水平有關[24-25]。且槲皮素還可以通過誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助因子1-α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α）表達，激活脂肪酸β 氧化、減輕氧化應激以及抑制炎性反應，發(fā)揮雌激素樣作用，最終改善肝細胞脂肪變性[26]；鞣花酸能夠通過抑制NF-κB/COX-2 炎癥通路活化，抑制炎癥反應及氧化應激，改善AKT基因轉染誘導的小鼠非酒精性脂肪性肝病[27]。趕黃草酮A 可以抑制人肝癌細胞SMMC-7721 增殖，且對醋氨酚誘導的肝細胞HL7702 損傷具有保護作用[28-29]，趕黃草酮B 對H2O2和醋氨酚分別誘導的肝細胞LO2損傷都具有一定的保護作用[30]。趕黃草苷保肝作用未查到文獻報道，有待進一步研究。

綜上所述，本研究借助 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 方法鑒定了趕黃草主要化學成分，并結合網絡藥理和分子對接技術預測趕黃草保肝潛在作用靶點及通路，為闡明趕黃草保肝藥效物質基礎，及進一步臨床應用和機制研究提供實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突