地龍藥材及其處方制劑散寒化濕顆粒中總砷及砷形態研究

王書娟，胡軍華 ，姚 雪 ，汪盛華 ，周恩麗 ，章晨峰 ，于桂芳 *，王振中, *

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023

2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001

3.中藥制藥過程控制與智能制造技術全國重點實驗室，江蘇 連云港 222001

砷（As）元素屬于類金屬元素，其化合物的種類在自然界中繁多，不同種類的砷化合物具有不同的形態、價態[1-2]。目前，常見的砷化合物主要有亞砷酸［arsenious acid，As(III)］、砷酸［arsenic acid，As(Ⅴ)］、一甲基砷（monomethylarsenic，MMA）、二甲基砷（dimethylarsenic，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）6 種[3-4]。毒理學研究表明，不同形態、價態的砷化合物的毒性不同。通常無機砷（inorganic arsenic，iAs）有劇毒，其中As(Ⅲ)的毒性是As(Ⅴ)的60 倍，有機砷（MMA 和DMA）的毒性中等，而AsB 和AsC 則被認為是無毒的[5-7]。目前，常見的砷形態分析的方法主要有高效液相色譜-原子熒光聯用技術（HPLC-AFS）、高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光度法（HPLC-HG-AFS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（HPLC-ICP-MS）等[8-12]。與其他分析方法相比，利用HPLC-ICP-MS 技術進行砷化合物的分析，能夠避免光譜和基底的干擾，靈敏度高、專屬性、精密度較好，分析速度快，操作簡便，具有明顯的優勢[13-15]。

散寒化濕顆粒（Sanhan Huashi Granules，SHG）是由江蘇康緣藥業股份有限公司根據《中藥注冊分類及申報資料要求》中3.2 類注冊要求和疫情期間臨床上實際使用藥物的生產工藝所研發上市的顆粒劑[16]。該方主要由麻黃、厚樸、煨草果、地龍等20味中藥組成，具有散寒化濕、祛毒通絡、宣肺透邪等功效，其臨床療效顯著，安全性良好[17-18]。該處方藥味中地龍為常用的動物藥，在中藥復方中具有不可替代的作用[19]，但其重金屬及有害元素含量超標的問題時有發生，特別是砷元素超標的情況[20-23]，其臨床使用的安全性問題一直是備受關注，也在一定程度上對地龍藥材及其復方制劑的應用和推廣造成影響。截至目前，關于SHG 中總砷和砷形態的含量及其限度的制定等研究尚未見相關報道。本研究通過采用ICP-MS 對地龍藥材、飲片、地龍飲片提取液、SHG 中的總砷含量進行測定分析，再采用HPLC-ICP-MS 對其中6 種不同形態、價態的砷含量進行測定，探究其傳遞規律；同時對多批次SHG 制劑及不同產地的地龍藥材進行分析，以期初步建立地龍藥材的內控標準，從源頭上控制藥材質量，確保SHG 的安全性，同時為地龍藥材的評價積累數據，也為其他含有地龍藥味的中藥復方制劑的風險防控提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Flexar 型高效液相色譜儀、NexION 300X 型電感耦合等離子體質譜儀，美國Perkin Elmer 公司；ETHOS UP 型微波消解儀，北京安南科技有限公司；Mettler Toledo AL204 型電子分析天平，德國梅特勒公司；Milli-Q Academic 型超純水儀，美國密理博公司；HH-6 型數顯恒溫水浴鍋，金壇市康華電子儀器制造廠；VB24 UP 型趕酸器，北京萊伯泰科有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器；KDM 型電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；實驗所用玻璃儀器均用20%硝酸溶液浸泡24 h 以上，并用超純水沖洗干凈，晾干備用。

1.2 材料

1.2.1 試劑 胃蛋白酶（批號220909）、碳酸銨（批號20200326）、無水乙醇（批號20220803）均購自于國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（批號11071120645）、磷酸氫二銨（批號11072920722）均購自于南京化學試劑有限公司；硝酸UP 級（電子級硝酸，金屬雜質含量小于10 ng/L），蘇州晶瑞化學試劑有限公司；水為超純水；硝酸人工胃液（按照《中國藥典》2020 年版四部通則2322 配制）；GraphPad Prism 軟件，Version 8.0，美國GraphPad Software 公司；SIMCA 軟件，Version 14.1，瑞典MKS Umetrics 公司。

1.2.2 標準物質 Au 單元素標準溶液（1.000 mg/mL，批號GSB04-1715-2004）、As 單元素標準溶液（1.000 mg/mL，批號GSB04-1714-2004），Ge單元素標準溶液（1.000 mg/mL，批號GSB04-1728-2004）均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；亞砷酸根溶液標準物質［批號GBW0866，質量分數以砷（As）計為（75.7±1.2）μg/g］、砷酸根溶液標準物質［批號GBW0866，質量分數為（17.5±0.4）μg/g］、一甲基砷溶液標準物質［批號GBW08668，質量分數以砷（As）計為（25.1±0.8）μg/g］、二甲基砷溶液標準物質［批號GBW08669，質量分數以砷（As）計為（52.9±1.8）μg/g］、砷甜菜堿溶液標準物質［批號GBW08670，質量分數以砷（As）計為（38.8±0.1）μg/g］、砷膽堿溶液標準物質［批號GBW08671，質量分數以砷（As）計為（28.0±1.1）μg/g］均購自于中國計量科學研究院；調諧液（含Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U，質量濃度均為1 μg/L，Lot38-31GSX1）購自美國Perkin Elmer 公司。

1.2.3 樣品

（1）傳遞規律研究用樣品。對應關系1：地龍藥材（批號Y2101023）、地龍飲片（批號YP2104025）、缺地龍SHG 陰性樣品（SHG-陰性）、SHG（批號210401、210402、210403）。對應關系2：地龍飲片（批號YP2211066）、缺地龍SHG 陰性樣品（SHG-陰性）、SHG（批號221203）。地龍樣品分別來自于廣東、廣西，均為鉅蚓科環毛蚓屬動物參環毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)。

（2）多批次SHG。共28 批，批號分別為210401、210402、210403、221202、221203、221204、221205、221206、221207、221208、221209、221210、221211、221212、221213、221215、221216、221217、221233、221234、221235、221236、221237、221238、221240、221241、221242、221243，編號分別為SHG1～SHG28，均購自江蘇康緣藥業股份有限公司。

（3）多批次地龍藥材。共24 批，均購自于中藥材市場，均經南京中醫藥大學中藥資源學教研室（中藥資源與栽培技術中心）主任谷巍教授鑒定，結果分別為鉅蚓科環毛蚓屬動物參環毛蚓P.aspergillum(E.Perrier)、通俗環毛蚓P.vulgarisChen、威廉環毛蚓P.guillelmi(Michaelsen)的干燥體，習稱“廣地龍”或“滬地龍”，具體信息見表1。

表1 地龍藥材至制劑的總砷及砷形態測定結果Table 1 Determination results of total arsenic and arsenic speciation from Pheretima herbs to preparations

表1 地龍樣品信息Table 1 Information of Pheretima samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 ICP-MS 條件 總砷測定時采用碰撞反應池模式，等離子氣體流量16.0 L/min，霧化器流量0.94 L/min，輔助氣流量1.2 L/min，射頻功率1 600 W，脈沖階段電壓1 300 V，模擬階段電壓?2 200 V，蠕動泵的轉速為20 r/min，載氣為高純液氬，跳峰采集模式，測定時選取74Ge 為內標；砷形態測定時，ICP-MS 與HPLC 通過數據線連接傳遞信號，ICPMS 采集模式為時間分辨模式（time resolved mode，TRA），檢測質量數m/z為75（As），其他采集條件同總砷測定模式。

2.1.2 HPLC 條件 Hamilton PRP-X100（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為1.5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液（A）-100 mmol/L 碳酸銨溶液（B）；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；進樣體積為20 μL；梯度洗脫：0～2 min，10%～12% B；2～4 min，12%～100% B；4～9 min，100% B～10% B；9～10 min，10% B。在選定的條件下，6 種砷形態、價態的色譜圖、SHG、地龍藥材及SHG 地龍陰性典型樣品圖見圖1。

圖1 砷元素形態測定圖譜和典型樣品圖Fig.1 Determination of arsenic form and typical sample

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 總砷測定標準溶液 精密吸取As 單元素標準溶液適量，用5%硝酸稀釋，制成含砷為10 μg/mL的標準儲備液。精密量取該儲備液適量，用5%硝酸稀釋制成含砷元素分別為5、20、50、100、200、250 ng/mL 的系列標準溶液。

2.2.2 形態砷測定標準溶液 分別精密稱取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC、AsB 對照品適量，加0.02 mol/L 乙二胺四醋酸二鈉溶液制成各含2.0 μg/mL（以As 計）的混合對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，加入0.02 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液制成各含1、5、20、50、100、200 ng/mL 的系列標準曲線混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取浸膏的制備 精密稱取混合均勻的地龍飲片（過三號篩，批號YP2104025、YP2211066）約4 g，精密加入水50 mL，加熱回流提取2 h，濃縮成浸膏（密度1.10 g/cm3），待用。

2.3.2 總砷測定供試品溶液 精密稱取混合均勻的樣品（過三號篩）約0.5 g 于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10 mL，混勻，待氣泡散盡，置預先設置好參數的微波消解儀中（消解功率為1 500 W，在20 min 內升溫至190 ℃，消解40 min），消解完全后放置室溫，取出，待蒸氣散盡后，將消解液轉移至50 mL 聚丙烯量瓶中，用水洗滌消解罐2～3 次，洗液與消解液合并，加水定容至刻度線，搖勻即可。如果測定提取浸膏中的總砷，則精密稱取提取浸膏適量于聚四氟乙烯消解罐中，自“加入硝酸10 mL”起，保持相同操作。同法制備試劑空白溶液。

2.3.3 形態砷測定供試品溶液 精密稱取混合均勻的樣品（過3 號篩）約0.2 g 于50 mL 離心管中，精密加入硝酸人工胃液10 mL，40 ℃水浴震蕩8 h，待冷卻至室溫后，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。如果測定提取浸膏中的砷形態，則精密稱取提取浸膏適量于50 mL 離心管中，自“加入硝酸人工胃液10 mL”起，保持相同操作。同法制備空白溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍考察 采用HPLC-ICP-MS，分別精密吸取配制好的6 種砷形態化合物質量濃度為1、5、20、50、100、200 ng/mL 的溶液各20 μL 進樣，以質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數，結果分別為AsCY＝3 137.229 9X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；AsBY＝3 823.738 9X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；As(III)Y＝2 841.969 3X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；DMAY＝4 077.541 7X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；MMAY＝4 054.937 0X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；As(V)Y＝4 217.265 7X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL。結果顯示，各成分在1～200 ng/mL 線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 精密稱取地龍樣品1 份（S15），按“2.3.2”項下方法平行制備供試品溶液，連續進樣6 次，計算AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)峰面積的RSD 分別為2.11%、0.87%、2.37%、1.62%，符合微量元素分析的要求，表明儀器進樣精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密稱取地龍樣品1 份（S15），按“2.3.2”項下方法平行制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h 進樣測定，計算得到AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)峰面積的RSD 分別為3.81%、5.68%、6.82%、3.26%，符合微量元素分析的要求，表明供試品溶液在8 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取地龍樣品的供試品溶液（S15）6 份，按“2.3.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣20 μL，計算得到AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)質量分數的均值分別為0.22、1.60、1.24 μg/g，RSD 分別為6.06%、5.79%、13.96%、7.06%，符合微量元素分析的要求，表明重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取適量重復性試驗樣品（S15）6 份置50 mL 離心管中，分別加入混合對照品溶液（1 μg/mL）1 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣20 μL，測定并計算加樣回收率。結果表明，AsC、AsB、As(III)、DMA、MMA、As(Ⅴ)的平均加樣回收率分別為111.61%、103.78%、96.08%、94.15%、94.77%、79.20%，其RSD 分別為5.4%、6.9%、7.2%、8.0%、6.9%、7.8%，符合微量元素分析的要求，說明該方法準確性良好。

2.5 樣品測定結果

2.5.1 傳遞規律研究 通過對研究傳遞規律批的地龍藥材、地龍飲片、飲片提取液、SHG 中的樣品進行處理。采用ICP-MS 對上述樣品進行總砷含量的測定，并采用HPLC-ICP-MS 對其進行相應的砷形態及價態分析，測定結果見表1。由結果可以看出，地龍藥材、飲片、提取液及SHG 在傳遞過程中總砷含量呈遞減趨勢，其中，總砷在對應關系1 中各物料的轉移率（即藥材→飲片→提取液→SHG）分別為85.58%、78.95%、76.97%；基于制劑處方，藥材到制劑中的平均轉移率為52.00%，飲片到制劑中的平均轉移率為60.81%；總砷在對應關系2 中各物料的轉移率（即飲片→提取液→SHG）分別為76.11%、80.60%，飲片到制劑中的轉移率為64.79%。SHG 陰性樣品中檢出極少量的砷，且采用同一批地龍制備的3 批制劑中6 種砷形態含量以及總砷含量相近，可推測SHG 中的砷幾乎均來自地龍藥材，地龍對SHG 的砷含量起決定性作用。

2.5.2 地龍藥材與SHG 的多批次測定 采用“2.3”項下方法，對市售地龍藥材及多批次的SHG 進行測定，測定結果見表2、3。結果顯示，24 批次地龍藥材中總砷含量在3.96～24.55 mg/kg，平均值為12.31 mg/kg，反映出不同產地的地龍藥材中總砷含量差異較大，且均高于《中國藥典》2020 年版植物類“重金屬及有害元素一致性限量”指導值（砷不得過2 mg/kg）[4]，游離的無機砷（inorganic arsenic，iAs）含量較高，占總砷含量的90%以上，且其形態與總砷含量之間并非呈現簡單的正相關，因此有必要對多批次地龍作進一步的分析，探究不同產地對地龍中砷含量的影響，以便更加方便直觀對其進行評價，從源頭上保障制劑的安全性。28 批SHG 中的總砷含量在0.84～2.21 mg/kg，平均值為1.60 mg/kg，游離的iAs 占檢出總量的89.2%～97.2%，其中As(III)最高檢出量為1.61 mg/kg，As(Ⅴ)最高為0.68 mg/kg，iAs 總量平均值為0.55 mg/kg，檢出少量的AsC、AsB、MMA，而DMA 大多未檢出。

表2 地龍中總砷和砷形態測定結果Table 2 Determination results of total As and arsenic speciation in Pheretima

表3 SHG 中總砷和砷形態測定結果Table 3 Determination results of total As and arsenic speciation in SHG

聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）是用于中藥化學成分與物料性質等歸類的一種常用方法[24-26]。為進一步闡明地龍藥材中無機砷的分布特征，采用SIMCA 軟件對24 批地龍藥材中總砷與5 種主要砷形態、價態含量進行聚類分析（DMA 均未檢出）。結果（圖2）顯示，S7 與S8 聚為一類；S22～S24 聚為一類；S5～S6、S14～S16 與S19 聚為一類；S1～S4、S9～S13、S17～S18 與S20～S21聚為一類。結果顯示，除來自湖北的3 批藥材聚為一類外，其他產地地龍藥材中總砷形態化合物存在一定的交互現象，說明地龍藥材中普遍存在這5 種砷化合物，其在質量傳遞過程中的變化影響可做進一步分析。

圖2 多批次地龍藥材總砷與砷形態聚類分析Fig.2 Cluster analysis of total arsenic and arsenic form in many batches of Pheretima herbs

主成分分析法（principal component analysis，PCA）是基于數學降維思路對原來變量重新組合成幾個能反映多數變量信息、對復雜因子下的變量進行簡單化的統計方法[27-28]，也是藥材質量評價的主要手段之一。研究中采用SIMCA 軟件，對24 批地龍藥材中5 種主要砷化合物含量，進行主成分信息提取分析。由提取到的信息（表4）可知，主成分1（PC1）與主成分2（PC2）方差貢獻率分別為45.98%、25.89%，累積貢獻率達71.87%，可以解釋大部分變量對模型的影響。為進一步分析各形態元素間的相互關系，對構成PC1 與PC2 的5 種化合物形態做相關性分析。

表4 PCA 數學模型的提取信息Table 4 Extraction information of PCA mathematical model

由GraphPad Prism 軟件繪制得到的二維矩陣熱點圖（圖3）結果可知，As(Ⅲ)與MMA、As(Ⅴ)呈顯著相關（P＜0.05）；MMA 與As(Ⅴ)呈顯著相關（P＜0.05）。可以發現，As(III)、MMA 與As(Ⅴ) 3 種形態化合物間相互關聯性較強，同時As(Ⅴ)受其他2 種化合物影響，反映出As(Ⅴ)是地龍藥材重金屬中起主要影響作用的砷化合物，也是質量控制過程中需重點關注的檢測指標。

圖3 多批次地龍藥材中5 種砷元素間二維矩陣熱點圖Fig.3 Two-dimensional matrix hot spot map of five arsenic elements in multiple batches of Pheretima herbs

3 討論

3.1 供試品制備方法優化

砷形態化合物的提取應該在不使原有形態發生改變和互相轉化的前提下進行。目前砷形態化合物的提取方法種類繁多，如水提取、稀硝酸提取、酶解析提取、乙酸提取等[29]。本實驗選用硝酸人工胃液提取，通過仿生手段模擬胃腸環境，以期得到的成分更接近人體真實情況；同時參考《中國藥典》2020 年版四部通則2322 中汞、砷元素形態及價態中供試品溶液的制備方法[4]，在此基礎上對供試品處理條件進行優化，考察了水浴加熱與水浴震蕩2種提取方式，并對提取時間、靜置時間進行篩選，通過比較6 種不同砷形態、價態的化合物的含量及總量。結果表明，選擇水浴加熱時，20 h 提取的效果更充分；提取方式為水浴震蕩時，8 h 提取的較為充分；同時比較水浴加熱20 h 與水浴震蕩8 h 的提取效果，發現兩者效果相當；是否需靜置2 h 的結果顯示影響較小。綜上，在達到相同的提取效果的前提下，選擇硝酸人工胃液為溶劑，水浴震蕩8 h 后直接離心能夠有效縮短提取時間，故采用該優化后的方法。

3.2 色譜條件的選擇

基于美國Perkin Elmer 公司液相儀器的碳酸鹽體系特性，選用Hamilton，PRP-X100 陰離子交換色譜柱；與0.025 mmol/L 的磷酸二氫銨（氨水調節pH值至8.0）-水對比，1.5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液-100 mmol/L 碳酸銨溶液作為流動相，不需調節pH 值，操作較為方便，色譜圖基線噪音較小，基線較為平穩；且碳酸銨系統進入ICP-MS 后，被分解成易揮發的氣體，能夠有效減少鹽的殘留，減輕對采樣錐的污染，進而選擇1.5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液和100 mmol/L 碳酸銨溶液作為流動相。

3.3 建立地龍藥材與SHG 的內控標準

《中國藥典》2020 年版一部中地龍重金屬檢查項下，規定用通則0821 第二法檢查，含重金屬不得過30 mg/kg。該法是通過供試品溶液與硫代乙酰胺作用顯色，再與一定量的標準鉛溶液同樣處理后的顏色進行比較[30]。此法是一種半定量分析方法，僅憑肉眼判斷重金屬的含量是否超標，準確度有限，更無法分析其中含有的化合物形態。因此，有必要采用更精確的檢測方法對地龍以及復方制劑中的砷總量及價態進行研究，以確保用藥安全與藥品的質量可控。根據本課題組積累的多批次地龍藥材重金屬含量測定結果與相關文獻報道[20-23]，對結果進行統計分析發現市售地龍總砷含量普遍偏高。考慮地龍市場供應的實際情況以及動物藥療效的不可替代性等因素，同時參考臨床批制劑所用地龍藥材中總砷的含量情況（11.78 mg/kg），暫擬定地龍藥材中As的限度為15.00 mg/kg。結合量-值傳遞規律及制劑處方，得出SHG 中總砷的限度為2.25 mg/kg，換算公式如下：SHG 中的總砷含量＝地龍藥材中砷轉移的量＋SHG 陰性樣品砷含量＝15.00 mg/kg×250 g×52.00%/1.000 kg＋0.30 mg/kg＝2.25 mg/kg（250 g 為SHG 中地龍藥材在制劑中的處方量，1.000 kg為SHG工藝生產時最后的制得量）。

因此，暫擬定SHG 中總砷的限度為2.50 mg/kg，又因藥材及制劑中均以毒性較大的無機砷為主，所以暫不擬定砷形態及價態限度。

4 結語

本實驗基于HPLC-ICP-MS 法首次對地龍藥材及SHG 中的總砷及砷形態進行分析研究，反映了地龍藥材到SHG 制劑中的量-值傳遞規律，并對其中的地龍藥材及SHG 制定初步的總砷含量限度，以期科學評價地龍藥材及SHG 的安全性。鑒于目前課題進展與后續實驗安排，該總砷含量值只是目前暫定的參考值，后期還將對其進行蓄積性研究，分析其吸收排泄規律，以期建立更加準確的地龍藥材總砷的安全值，為SHG 的安全性提供保障；同時建議盡快建立地龍等動物藥及相關制劑中高毒形態與高含量（如iAs）的重金屬形態限量標準，以期保障動物藥及相關制劑的安全性，進而促進中藥的可持續發展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突