同時測定復方阿膠漿中間體中17 種化學成分的定量核磁方法

謝欣媛，楊嘉譽，潘堅揚，瞿海斌

浙江大學藥物信息學研究所，浙江 杭州 310058

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜法能同時提供定性和定量信息，是一種非靶向分析工具。其定量基本原理是信號強度與產生特定共振的原子核數量成正比。通過向樣本中加入已知濃度內標化合物，可以基于該比例關系實現相對定量，或結合摩爾質量換算實現絕對定量[1]。近年來，定量質子核磁共振（quantitative nuclear magnetic resonance，1H-qNMR）技術在制藥、代謝組學、食品等領域有著廣泛的應用[2-6]。1H-qNMR 具有樣品制備簡便、分析過程中不破壞樣品、無需被測物對照品的特點，雖然其靈敏度低于質譜技術，但上述特點使其比常規色譜技術更便捷、快速，適用于混合物分析[7]，因此，在中藥質量評價研究中具有優勢[8-10]。

復方阿膠漿（Compound E’jiao Jiang，CEJ）源自明代醫家張介賓《景岳全書》中的兩儀膏，是一種補益劑，臨床用于治療氣血兩虛證[11]。其制備工藝的第一步是合并煎煮紅參、黨參、熟地黃和山楂，得到提取液。阿膠則單獨加水煮沸，得到膠液。膠液與上述提取液混合后用碳酸鈉調整pH 值，濾過后濃縮至指定密度，再進行酸堿調節和濾過，最終得到成品制劑[12]。

為探究生產過程中物質傳遞規律，確定會導致顯著成分變化的工藝環節，需對中間體進行全成分分析。提取環節將化學成分從藥材轉移至溶劑，故提取液是物質傳遞規律研究的起點。提取液中化學成分可分為植物初級代謝產物、植物次級代謝產物和無機鹽離子3 大類，其中初級代謝產物的含量最高，包括氨基酸、小分子有機酸、核苷等化合物。目前報道的定量方法，均以藥效相關的植物次級代謝產物為主[13-17]，全成分視角尚且欠缺。

本研究基于1H-qNMR 技術開發了一種同時對其提取液中17 種化學成分準確定量的方法。該方法檢測時間短、制樣方式簡單，能實現更全面的定量分析，為CEJ 的生產過程物質轉移規律研究打下基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker Avance III 600 型核磁共振光譜儀，德國布魯克公司，配24 位自動進樣器與5 mm BBO 探頭，Topspin 工作站；XS105 型電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；5425 型高速離心機、Multipette M4 手動連續分液器、Research plus移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 試藥

3 批CEJ 的4 味藥材提取液樣本（中間體）由東阿阿膠股份有限公司提供，批號分別為1907075、1909010、2020616。3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉（TSP，批號SZBA183XV，質量分數≥99%）、氘代水（D2O，氘質量分數≥99.9%）、纈氨酸（批號P500172，質量分數98.9%）、異亮氨酸（批號P500099，質量分數98.9%）、丙氨酸（批號P500110，質量分數98.9%）、蘇氨酸（批號P500242，質量分數99.9%）、γ-氨基丁酸（批號BCCC4017，質量分數≥99%）、焦谷氨酸（批號BCCB9703，質量分數≥99%）、丙酮酸（批號G2119085，質量分數≥98%，20 ℃下密度1.267 g/mL）、尿苷（批號SLCB8621，質量分數≥99%）均購自美國Sigma-Aldrich 公司。乳酸（批號200617，質量分數98.30%）、乙酸鈉（批號190810，質量分數99.80%）、檸檬酸（批號211019，質量分數99.80%）、琥珀酸（批號200524，質量分數99.61%）、氯化膽堿（批號201028，質量分數99.53%）、葡萄糖（批號200323，質量分數99.80%）、果糖（批號210519，質量分數99.80%）、蔗糖（批號190825，質量分數98.83%）、半乳糖（批號191016，質量分數99.37%）、富馬酸（批號190914，質量分數99.47%）、甲酸鈣（批號200805，質量分數99.35%）均購自上海融禾醫藥科技有限公司。去離子水由純化水系統Milli-Q Synthesis（美國Millipore 公司）制備得到。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

精確稱取50 mg TSP 于100 mL 量瓶中，用D2O定容至刻度，混合均勻，得到含0.5 mg/mL TSP 的D2O 溶液。將提取液11 000 r/min 離心13 min，取上清，與水以體積比1∶5 混合得到樣品液。精密移取540 μL 樣品液與60 μL 含0.5 mg/mL TSP 的D2O溶液混合均勻，并轉移入5 mm 標準核磁管中，即得NMR 樣品。

2.2 分析參數

使用Bruker Avance III 600 型核磁共振光譜儀記錄所有樣品的1H-NMR 圖譜，光譜儀頻率為600.13 MHz，測定溫度為298 K。采用脈沖序列zg30優化中心頻率（O1），采用水信號預飽和脈沖序列Noesygppr1d 采集樣品的1H-NMR 圖譜。

具體采集參數如下：采樣數據點32 768，譜寬（SW）7 211.539 Hz，中心頻率（O1）2 828.63 Hz，90°脈沖寬度（P1）14.40 μs，弛豫延遲時長（D1）15.00 s，混合時間（D8）0.05 s，采集時間（AQ）2.27 s，接收器增益（RG）為50.8，掃描次數（NS）為32，空掃次數（DS）為4。

2.3 數據處理

在TopSpin 3.6.5（Bruker Bio Spin）工作站中對得到的1H-NMR 圖譜進行初步處理。首先用窗口函數并進行傅里葉變換，其中窗口函數選擇指數函數模式，線寬（LB）取0.3 Hz。以TSP 信號峰（δ0.00）為參考，校正化學位移，并進一步進行手動相位校正和基線校正。

將完成上述處理的圖譜數據導入MestReNova 14.0.0（Mestrelab Research S.L.）軟件中。首先進行多點基線校正，算法選擇Smooth Segments，再用“線性擬合”方法對定量峰和內標峰（TSP）進行積分，后根據式（1）計算各待測成分質量濃度[18]。

Cx和CTSP分別是待測化學成分和內標TSP 的質量濃度，Ax和ATSP分別是待測化學成分和內標TSP 的特征峰面積，Nx和NTSP分別是待測化學成分和內標TSP 的特征峰質子數，Mx和MTSP分別是待測化學成分和內標TSP 的相對分子質量

2.4 圖譜信號峰指認與定量峰選擇

前期對紅參、黨參、熟地黃和山楂分別進行了水提，并采集1H-NMR 圖譜進行定性分析。本研究通過文獻調研，結合前期定性分析結果，初步確定中間體的化學成分組成。在此基礎上，通過數據庫（Human Metabolome Database，https://hmdb.ca/）檢索以及標準品圖譜比對的方式，進行中間體的核磁譜峰歸屬，最后通過對照品加標法對指認結果進行確認。從1H-NMR 圖譜（圖1）中共歸屬出22 種化合物，包括7 種氨基酸（峰1 亮氨酸、峰3 異亮氨酸、峰2 纈氨酸、峰5 蘇氨酸、峰6 丙氨酸、峰8焦谷氨酸、峰9 γ-氨基丁酸），7 種小分子有機酸（峰4 乳酸、峰7 乙酸根、峰11 琥珀酸根、峰12 檸檬酸根、峰10 丙酮酸根、峰21 富馬酸根、峰22 甲酸根），6 種糖類（峰14 葡萄糖、峰16 果糖、峰17 蔗糖、峰18 半乳糖、峰15 甘露三糖、峰19 水蘇糖）和2 種核苷類成分（峰13 膽堿、峰20 尿苷）。譜峰指認結果見圖1，各化合物按峰化學位移順序進行編號。

圖1 CEJ 中間體的1H-NMR 譜峰指認Fig.1 Signal identification of 1H-NMR spectrum of intermediate of CEJ

逐一為成功歸屬的化合物選定定量峰。為保證定量結果的可靠性，要求定量峰的信噪比不小于10。最理想的定量峰應不與其他無關化合物峰重疊。由于中藥為復雜混合物，常含有十余種甚至數十種組分，導致1H-NMR 圖譜較為擁擠，實際定量工作中難以找到最理想的定量峰。對于重疊部分少的峰，若其積分受到的干擾非常小，則亦可選為定量峰。若化合物有多組峰，則優先選擇響應更高的峰作為定量峰。葡萄糖、果糖、半乳糖在水溶液中存在不同構型，不同構型間會相互轉化且處于動態平衡之中。為得到可靠的定量結果，以不同構型對應峰的峰面積之和來進行計算[19-20]。發現β-半乳糖對應的δ4.58 處的雙峰受水峰壓制影響，出現了嚴重的峰形扭曲，且存在較多重疊，無法用于定量。因此，選擇α-半乳糖對應的δ5.27 處的雙峰作為定量峰。本研究在相同條件下分析已知準確質量濃度的D-半乳糖溶液，通過式（2）換算，得出該定量峰實際對應的質子數，用于后續計算。最終為17 個化合物選定定量峰，各定量峰的峰型及位置如圖2 所示，具體參數以及化學結構中對應的氫原子見表1 和圖3，同一化合物編號與圖1 相同。

表1 定量峰的具體參數Table 1 Parameters of quantitative peaks

圖2 17 種化學成分定量峰Fig.2 Quantitative peaks of 17 chemical components

圖3 定量峰在化學結構中對應的氫原子Fig.3 Corresponding protons in structures of quantitative peaks

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 將纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸鈉、γ-氨基丁酸、焦谷氨酸、琥珀酸、氯化膽堿、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、尿苷、富馬酸、甲酸鈣對照品置于裝有五氧化二磷（P2O5）的干燥器中，減壓干燥24 h 以上。精密稱取一定量的對照品，用去離子水定容，得到相應的對照品母液；移取一定體積的丙酮酸液體，用去離子水定容得到母液。設置7 檔質量濃度梯度，取上述對照品母液以及去離子水配制不同質量濃度梯度的樣品液。將樣品液與“2.1”項配制的含0.5 mg/mL TSP 的D2O溶液以體積比9∶1 混合得到待測樣品。

按“2.2”項所述參數采集樣品的1H-NMR 圖譜，并對目標成分的特征峰進行積分。以對照品和內標化合物的峰面積之比為縱坐標（Y），以待測樣品中對照品和內標化合物的質量濃度比值為橫坐標（X）進行線性回歸。得到的17 個成分回歸方程見表2，相關系數（r）均不小于0.999 5，證明該方法線性關系良好。

2.5.2 檢測限與定量限 以化合物定量峰響應為3倍信噪比時的質量濃度為檢測限，10 倍信噪比時的質量濃度為定量限。信噪比的計算利用MestReNova 14.0.0 軟件完成，其中每個成分均取3 次結果的平均數。各成分的檢測限與定量限結果如表2 所示。

2.5.3 精密度 隨機取一批（批號1909010）中間體，按“2.1”項所述方法制備1 份供試樣品，連續采集6 張1H-NMR 圖譜，按“2.3”項所述方法進行圖譜處理，并計算目標成分質量濃度。精密度結果用6 組質量濃度計算值的RSD 表示，結果見表2。各成分的結果均小于2.7%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性 隨機取一批（批號1909010）中間體，按“2.1”項所述方法平行制備6 份供試樣品，分別采集1H-NMR 圖譜，按“2.3”項所述方法進行圖譜處理，并計算目標成分質量濃度。重復性結果用6 組質量濃度計算值的RSD 表示，結果見表2。各成分的結果均小于2.5%，證明制樣重復性良好。

2.5.5 耐用性 隨機取一批（批號2020616）中間體，按“2.1”項所述方法制備1 份供試樣品，分別于296.5、297.0、297.5、298.0、298.5、299.0 K 溫度下進行分析，按“2.3”項所述方法進行圖譜處理，并計算目標成分質量濃度。方法耐用性結果用6 組質量濃度計算值的RSD 表示，結果見表2。各成分的結果均小于2.6%，證明分析溫度在296.5～299.0 K 波動時對測定結果無顯著影響。

2.5.6 穩定性 隨機取一批（批號1909010）中間體，按“2.1”項所述方法制備1 份供試樣品，在室溫下保存，分別于第0、2、4、8、12、24 小時采集1H-NMR 圖譜，按“2.3”項所述方法進行圖譜處理，并計算目標成分質量濃度。樣品穩定性結果用6 組質量濃度計算值的RSD 表示，結果見表2。各成分的結果均小于2.6%，說明樣品溶液在室溫下存放24 h 內穩定性良好。

2.5.7 準確度 本研究通過2 種方式考察準確度。首先是加樣回收試驗，取已完成定量分析的批次（批號1909010），分別加入相當于原樣品質量濃度80%、100%、120%的待測成分對照品，記為低、中、高質量濃度組，每組平行制備3 份樣品進行分析。按“2.3”項所述方法進行圖譜處理，并計算目標成分質量濃度。各成分的最終回收率結果取3 份的平均值，并計算RSD，如表2 所示。各成分的平均加樣回收率在90.0%～105.0%，RSD 小于2.2%，證明方法分析準確度良好。

其次，將分析值與參考值作比，以考察所提出方法的分析準確度。將纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸鈉、γ-氨基丁酸、焦谷氨酸、琥珀酸、氯化膽堿、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、尿苷、富馬酸、甲酸鈣對照品置于裝有P2O5的干燥器中，減壓干燥24 h 以上。精密稱取一定量的對照品，用去離子水定容得到相應的對照品母液；移取一定體積的丙酮酸液體，用去離子水定容得到母液。設置高、中、低3 檔質量濃度，取上述對照品母液以及去離子水配制不同質量濃度的樣品液，以配制質量濃度為參考值。

將樣品液與“2.1”項配制的含0.5 mg/mL TSP的D2O 溶液以體積比9∶1 混合得到待測樣品。按“2.2”項所述參數采集樣品的1H-NMR 圖譜，并按“2.3”項所述進行數據處理，得出分析值。將分析值與參考值進行比較，結果用平均相對偏差（RD）表示，RD 值的計算式如式（3）所示，其中c和cr分別為分析值和參考值。結果纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸根、γ-氨基丁酸、丙酮酸根、焦谷氨酸、琥珀酸根、膽堿、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、尿苷、富馬酸根、甲酸根的RD 分別為3.38%、3.43%、2.21%、2.77%、3.15%、3.32%、3.75%、3.28%、3.94%、2.89%、3.90%、1.69%、1.52%、3.89%、3.00%、3.49%、3.55%，結果顯示，各成分的RD 值均在4.0%以內，證明方法分析準確度良好。

2.6 樣本測定

對3 批CEJ 中間體樣本進行檢測，各項測定結果均高于定量限，且滿足線性范圍。17 個化合物的定量結果見表3。

表3 3 批CEJ 中間體中17 種化學成分的1H-qNMR 方法定量結果Table 3 Quantitative results of 17 chemical components in three batches of intermediate of CEJ

3 批中間體樣本中，大多組分的質量濃度在0.1～1.0 mg/mL，質量濃度最低的是異亮氨酸，最高的是果糖。質量濃度低于0.1 mg/mL 的有纈氨酸、異亮氨酸和富馬酸根。4 種糖類成分的質量濃度均大于1.0 mg/mL，其中葡萄糖、果糖質量濃度均大于15.0 mg/mL。

為評價該方法可定量成分總量，用干燥衡重法測定了3 批中間體的總固體含量，并計算可定量成分在總固體含量中的質量占比。結果見表4，3 批中間體可定量成分的質量占比分別為71.09%、84.44%、70.09%。另分別計算了氨基酸、小分子有機酸、糖類和核苷4 類成分的質量占比。結果顯示，糖類的質量占比均高于65%，為CEJ 中間體中的主要成分，其余可定量成分質量占比不足5%。

表4 各類可定量成分質量濃度在總固體中的占比Table 4 Proportion of mass concentration of various measurable components in total solids

3 討論

為證明所提出1H-qNMR 方法的可靠性，進行了一系列方法學考察。線性考察旨在評價測試結果與試樣中被測物濃度成比例關系的程度，以相關系數為指標。精密度考察旨在評價多次測定所得結果之間的接近程度，重復性考察評價的是多次制樣對測定結果的影響，耐用性考察評價采集溫度發生變動時測定結果受影響的程度，穩定性考察評價樣品在室溫條件下存放時長對測定結果的影響，上述3項考察均以分析值的RSD 作為指標。準確度考察評價的是方法測定結果與實際值或參考值接近的程度，此處采用兩種方式進行考察，其一為加樣回收實驗，以回收率作為指標；其二是通過配制標準品溶液得到參考值，計算分析值與參考值的RD 值來進行評價。

成功歸屬出的22 種化合物中，17 種（如表1所列）得到了理想的方法學考察結果，證明所提出方法可行且可靠。余下5 種化合物中，亮氨酸、蘇氨酸、檸檬酸根均譜峰重疊相對嚴重，無法選定合適的定量峰，導致無法進行定量；甘露三糖和水蘇糖雖分別選定了重疊最少的峰作為定量峰，但是在加樣回收實驗中得出的回收率非常糟糕，無法通過方法學驗證，故無法準確定量。這一結果說明所選擇的定量峰不夠合理，峰重疊程度對積分產生了過大負面影響。

樣品檢測結果顯示，批號2020616 的糖類質量濃度明顯低于另2 批，其中果糖質量濃度約為另2批的70%，葡萄糖質量濃度約為另2 批的58%。化學成分的組成和含量決定了提取液的物理屬性情況，由批號2020616 樣本糖類含量最低可以推測其密度最低，該推論與實際密度測定結果相符。在藥典中，密度為提取液、浸膏的檢查項之一。由此展望，全面成分定量有望成為提取液、浸膏化學組成與關鍵物理屬性關系發現研究的基礎工作。

與目前廣泛應用的基于液相色譜技術的定量方法相比，1H-qNMR 方法的分析范圍更廣，且一次檢測可定量的成分數目更多，更適合混合物高效分析；檢測快捷，檢測單個樣本的儀器占用時間在10 min以內，對高通量分析友好；定量無需建立隨行標準曲線，大大減少對照品和有機溶劑的消耗，在降低時間和經濟成本的同時更加環保。目前1H-qNMR 方法推廣的主要阻力來自核磁波譜儀的高昂成本，設備共享平臺的構建是一種解決方案。方法的局限性在于靈敏度相對較低，且NMR 技術不具備分離混合物的能力，化合物頻域峰重疊會對定性和定量造成負面影響。如將低含量的植物次級代謝產物以及個別由于頻域峰重疊導致無法正常進行核磁定量的成分利用色譜或質譜技術進行定量，則能彌補上述局限，從而實現真正的全成分定量分析，有望拓寬1H-qNMR 技術的適用范圍。

綜上所述，本研究基于1H-qNMR 技術開發了CEJ 中間體的定量分析方法，能同時定量17 種成分，包括4 種氨基酸、7 種小分子有機酸、4 種糖類以及2 種核苷，具有耗時短、定量信息全面、環境友好等特點，能作為CEJ 生產過程物質傳遞規律研究的基礎工作，對實現制藥全過程控制有積極意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突