益智醇提物抗抑郁活性研究

甘安娜，王詩宇，晉炎君，吳博，顏廷旭，賈英

（沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院，遼寧 沈陽 117004）

抑郁癥是一種常見的精神障礙，患者表現為心境低落、精神沮喪、焦慮恐慌、意志活動、反應力減退等癥狀，是一種被公認為具有高患病率、高致殘率、高致死率的慢性精神疾?。?］。世界衛生組織指出，隨著時間的推移，抑郁癥的患者將會逐年增加，預計到2030 年，西方國家抑郁癥的患病率預計將會排在首位。抑郁癥的發病機制及生理病因尚未明確，故其藥物治療效果及預后康復并不如人意［2］。我國抑郁癥發病率也存在逐年上升趨勢，且目前主要的抗抑郁藥物治療效果滿足不了患者的需求，而中醫藥憑借其副作用小等優點，越來越廣泛地應用于抑郁癥的臨床治療中［3］。

益智（sharp－leaf glangal fruit）是姜科山姜屬的多年生植物益智（AlpiniaoxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實，始載于《本草拾遺》［4］，為中國四大南藥之一［5］。主產于海南、廣東、廣西、福建等地，為海南道地藥材，是衛生部公布的藥食同源的藥材之一［6］。2020 版《中華人民共和國藥典》記載本品性溫味辛，入脾、胃經，有溫脾止瀉、攝唾涎、腎虛遺尿、小便頻數、遺精白濁的功效［7］?，F代藥理和臨床研究表明，益智具有鎮靜、鎮痛、抗腫瘤、抗應激、抗氧化、抗衰老、強心、抗潰瘍、止瀉、降血脂和保肝提高記憶力等作用。益智的黃酮類化合物有抗抑郁的活性［8］，為了更好地了解益智治療抑郁的作用機制，本實驗從氧化應激以及炎癥的方向研究益智的抗抑郁作用。

1 材料

1.1 動物

健康昆明種SPF級小鼠，由沈陽藥科大學動物管理中心提供，雄性，體質量約25 g，合格證號：SCXK（遼）2020－0001。

1.2 藥材

益智（遼寧省沈陽市同仁堂藥店）經沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院賈英教授鑒定為益智（sharpleaf glangal fruit），是姜科（Zingiberaceae）多年生植物益智（AlpiniaoxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實。

1.3 藥品與試劑

羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190318）；生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司，批號：230314D04）；95%乙醇（沈陽市富康消毒藥劑廠，批號：20220322）；氟西汀、DPPH、ABTS、VC（大連美倫科技有限公司，批號：M0905A、CHB210105、S0929C、F0221A）；冰醋酸、鐵氰化鉀、水楊酸、過氧化氫、鹽酸（山東禹王實業有限公司，批號：20200418、20150507、20220801、20190105、20220519）；過硫酸鉀、鄰苯三酚（西隴化工股份有限公司，批號：20210121、20200928）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（碧云天生物技術有限公司，批號：122921220922）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）測定試劑盒、一氧化氮合成酶（NOS）分型測試盒（南京建成生物科技有限公司，批號：20211120、20201028）；環氧合酶－2（COX－2）測試盒、核因子－κB（NF－κB）ELISA 檢測試劑盒、炎癥小體（NLRP3）ELISA 檢測試劑盒、白介素－1β（IL－1β）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：ml0442236－J、ml063331、ml037234、mIC50300－1）。

1.4 儀器

BP210S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；數顯電熱恒溫水浴鍋HH－4（國華電器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZTW 調溫電熱套（北京市永光明醫療儀器廠）；離心機TGL－16C（上海安亭科學儀器廠）；Varioskan Flash 酶標儀（默飛世爾科技公司）；旋轉蒸發儀RE－52A（上海亞榮生化儀器廠）；BP210S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；真空泵SHZ－Ⅲ（上海亞榮生化儀器廠）；ZS－ZFT 自發活動視頻分析系統（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）；DY89－Ⅱ勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 益智醇提物的制備

取益智干燥品400 g，粉碎，加10 倍體積的95%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h。過濾后，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味，蒸干后，收集益智提取物浸膏60.5 g。益智醇提物浸膏需用CMC－Na 溶液助溶。

2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗

小鼠經環境適應性喂養一周后，將小鼠隨機分為對照組（Control 組）、阿司匹林組（Aspirin 組）、益智醇提物低劑量給藥組（AOY treated groupⅠ組）和益智醇提物高劑量給藥組（AOY treated group Ⅱ組），每組10只。對照組灌胃給予CMC－Na；阿司匹林組灌胃給予阿司匹林腸溶片溶液（200 mg/kg）；益智醇提物低劑量給藥組灌胃給予益智醇提物150 mg/kg；益智醇提物高劑量給藥組灌胃給予益智醇提物300 mg/kg。

小鼠連續給藥7 d，每日1次，給藥劑量0.01 mL/g。末次給藥后30 min，將小鼠耳朵用蒸餾水沖洗，取100%二甲苯50 μL 均勻涂于小鼠右耳前后兩面致炎。1 h后用游標卡尺測量給予二甲苯前后的耳廓厚度，計算耳腫脹度和腫脹度的抑制率。

2.3 小鼠棉球肉芽腫實驗

小鼠經環境適應性喂養一周后，將小鼠隨機分為對照組（Control 組）、阿司匹林（Aspirin 組）、益智醇提物低劑量給藥組（AOY treated groupⅠ組）和益智醇提物高劑量給藥組（AOY treated groupⅡ組），每組10 只。對照組灌胃給予CMC－Na；阿司匹林組灌胃給予阿司匹林腸溶片溶液（200 mg/kg）；益智醇提物低劑量給藥組灌胃給予益智醇提物150 mg/kg；益智醇提物高劑量給藥組灌胃給予益智醇提物300 mg/kg。

小鼠連續給藥7 d，每日1次，給藥劑量0.01 mL/g。腹腔注射水合氯醛400 mg/kg 麻醉，在小鼠的背部正中央去毛用碘酒消毒，75%酒精棉脫碘后，用手術剪刀開0.5 cm 長的小口，用眼科鑷子將質量為5 mg 的滅菌棉球植入皮下，隨即縫合小鼠皮膚。末次給藥后24 h，打開切口，將棉球連同周圍結締組織一起取出，剔除脂肪組織，在80 ℃烘箱中恒溫干燥12 h 后，稱重，將稱得的重量減去棉球重量（5 mg），即得肉芽腫重量。

2.4 抗氧化活性實驗

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻［9］中的方法做適當修改。用無水乙醇制備濃度為6.5 × 10-5mol/L 的DPPH 自由基（?DPPH）儲備液，在試管中依次加入不同濃度的供試品溶液1.5 mL和DPPH 自由基儲備液2.5 mL，搖勻并于暗處靜置30 min，在517 nm 波長處測定其吸光度分別記為Ai（i= 1～10）；以1.5 mL無水乙醇代替供試品溶液測得的吸光度為空白吸光度記為A0；以無水乙醇代替DPPH自由基儲備液測得的吸光度為供試品本底吸光度記為Aj；每個濃度同時做3個平行樣，取吸光度的平均值，以VC做陽性對照，按照以上方法處理并測定吸光度，計算供試品溶液對DPPH的抑制率，并計算出IC50值。

2.4.2 ABTS自由基清除能力的測定

參照文獻［10］中的方法做適當修改。用無水乙醇制備濃度為7.00 mmol/L 的 ABTS 溶液，量取ABTS 溶液10 mL 加入提前配好的2.45 mmol/L K2S2O8水溶液10 mL，在避光的條件下室溫放置過夜，形成一定濃度的ABTS 自由基（?ABTS＋）儲備液，下一步實驗前用無水乙醇稀釋至734 nm 波長處吸光度為（0.700 ± 0.02）左右，備用。在試管中依次加入不同濃度的供試品溶液0.1 mL 和稀釋后的ABTS 自由基溶液5.0 mL，充分混勻后避光放置6 min，在734 nm 波長處測其吸光度Ai（i= 1～10）；以0.1 mL 無水乙醇代替供試品溶液測得的吸光度為空白吸光度記為A0；以5.0 mL 無水乙醇代替ABTS 溶液測得的吸光度為供試品本底吸光度記為Aj；每個濃度同時做3 個平行樣，取吸光度的平均值，以VC 做陽性對照，按公式（1）計算供試品對ABTS自由基的抑制率，并計算出IC50值。

2.4.3 羥基自由基清除能力的測定

參照文獻［11］中的方法做適當修改。在試管中加入配好的9 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1.0 mL 和9 mmol/L水楊酸－乙醇溶液2.0 mL，混勻，不同濃度的供試品溶液2.0 mL，加入8.8 mmol/L過氧化氫溶液2.0 mL啟動反應，37 ℃水浴放置30 min后于510 nm 處測得吸光值Ai（i= 1～10），以2.0 mL 無水乙醇代替供試品溶液測得的吸光度為空白吸光度記為A0，以2.0 mL 無水乙醇代替水楊酸－乙醇溶液測得的吸光度為本底吸光度記為Aj。每個濃度同時做3 個平行樣，取吸光度的平均值，以VC 做陽性對照，按公式（1）計算樣品對?OH自由基的抑制率，并計算出IC50值。

2.4.4 超氧陰離子清除能力的測定

參照文獻［12］中的方法做適當修改。在試管中加入提前配制好的50 mmol/L Tris－HCl 緩沖液（pH =8.2）4.5 mL和蒸餾水4.2 mL，充分混勻，于25 ℃水浴中放置20 min，取出后立即加入用HCl配制的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，空白管中用HCl 代替鄰苯三酚HCl 溶液，迅速搖勻，然后在325 nm 每隔30 s 測定一次吸光值A，鄰苯三酚的自氧化速率A1是在線性范圍內每1 min 吸光度的增加值。取Tris－HCl 緩沖液4.5 mL、供試品1.0 mL 和蒸餾水3.2 mL 混勻，其他步驟同上，鄰苯三酚的自氧化速率A2是在線性范圍內每1 min 吸光度的增加值。每個濃度同時做3 個平行樣，取吸光度的平均值，以VC 做陽性對照，按公式（2）計算樣品對?O2-的抑制率，并計算出IC50值。

2.5 慢性不可預知溫和應激（CUMS）小鼠模型實驗

造模方式：①禁食24 h；②禁水24 h；③斜籠飼養24 h；④無墊料飼養24 h；⑤晝夜顛倒12 h；⑥濕籠飼養24 h；⑦噪聲4 h；⑧冰水游泳5 min；⑨夾尾1 min。以上造模方式必須隨機單獨進行4周。

小鼠適應一周后，將48只小鼠隨機分為6組，具體分組及給藥情況如下：空白組（Control 組）灌胃給予CMC－Na；CUMS 組（CUMS）灌胃給予CMC－Na；CUMS－ 陽性藥組（CUMS－FLU）腹腔給予氟西?。?2 mg/kg）；空白給藥組（Control－AOY）灌胃給予益智醇提物（300 mg/kg）；CUMS－益智醇提物低劑量給藥組（CUMS－AOYⅠ）灌胃給藥（150 mg/kg）；CUMS－益智醇提物高劑量給藥組（CUMS－AOYⅡ）灌胃給藥（300 mg/kg）。

其中CUMS 組、CUMS－陽性藥組、CUMS－益智醇提物低劑量給藥組和CUMS－益智醇提物高劑量給藥組小鼠進行連續4 周的CUMS 造模。實驗進行到第7 天時，空白組和CUMS 組小鼠分別連續3 周灌胃給予0.5%CMC－Na，每天1 次；CUMS－陽性藥組連續3 周腹腔注射給予FLU，每天1 次；空白給藥組、CUMS－益智醇提物高劑量給藥組以及CUMS-益智醇提物低劑量給藥組連續3 周給予益智醇提取物，每天1 次。實驗第28 天時對各組小鼠依次進行糖偏好實驗，第29 天后進行強迫游泳實驗以及懸尾實驗，第30 天處死動物，迅速取出小鼠全腦，將其放在生理鹽水中低溫保存，將大腦中的海馬組織取出放在-80 ℃超低溫冰箱進行保存，并按試劑盒說明對其進行生化檢測。

2.5.1 糖偏好實驗（SPT）

將小鼠放到一個含有兩瓶濃度都為1%的糖水水瓶的籠子當中適應24 h，然后斷水24 h，再將小鼠放在籠中飼養，并在該籠左右放進2 只水瓶，水瓶中分別裝有100 mL糖水和100 mL水，12 h之后記錄糖水和水的消耗情況。

2.5.2 強迫游泳實驗（FST）

將小鼠放進一個裝有水的燒杯中（燒杯高25 cm，直徑14 cm，水深10 cm），水溫控制在24～26 ℃。一次實驗進行6 min，小鼠適應時間為2 min，然后觀察記錄小鼠后4 min 的游泳情況。其中小鼠不動的標志是只做基本的保持頭部不下沉的運動。

2.5.3 懸尾實驗（TST）

將小鼠尾巴固定在30 cm 高度的橫桿上，頭部向下，一次實驗進行6 min，小鼠適應2 min，然后觀察記錄小鼠后4 min 的掙扎情況。小鼠不動的標志是為只做基本的保持頭部向下不動的行為。

2.6 生化指標檢測

按照試劑盒說明書進行操作處理試劑，并根據標準品的濃度及相對應的吸光度值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的吸光度值，計算出對應的SOD、GSH－Px、iNOS、COX－2、NF－κB、NLRP3 和IL－1β樣品濃度。

2.7 統計學方法

采用SPSS19.0 統計軟件進行分析，行為學實驗數據和生化指標測定數據均以±s表示，各組之間參數比較采用One－way ANOVA 和Student'st－test 進行統計學分析。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠耳腫脹情況比較

小鼠的左耳在實驗結束后耳廓厚度并無明顯的差異，可以排除小鼠之間的個體差異的影響。小鼠右耳耳廓經二甲苯致炎后，出現了明顯的腫脹，與空白組比較，阿司匹林組（P＜ 0.01，抑制率58.34%）、益智醇提物高低劑量給藥組（P＜ 0.01，抑制率41.67%、25.00%）表現出顯著的腫脹抑制作用。結果表明，益智醇提物能夠抑制二甲苯所造成小鼠的急性炎癥，且高劑量的AOY給藥效果更好。結果見表1。

表1 各組小鼠耳腫脹實驗結果比較（±s）

表1 各組小鼠耳腫脹實驗結果比較（±s）

注：與Control組比較，**P ＜ 0.01。

組別Control組Aspirin組AOY treated groupⅠ組AOY treated groupⅡ組抑制率/%—58.34 25.00 41.67 n 10 10 10 10左耳/mm 0.15 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.16 ± 0.02 0.16 ± 0.02右耳/mm 0.28 ± 0.03 0.21 ± 0.02**0.25 ± 0.02 0.23 ± 0.03**腫脹程度/mm 0.12 ± 0.02 0.05 ± 0.02**0.09 ± 0.01**0.07 ± 0.03**

3.2 各組小鼠棉球肉芽腫情況比較

與空白組比較，阿司匹林組（P＜ 0.01，抑制率48.60%）、益智醇提物高劑量給藥組（P＜ 0.01，抑制率35.49%）以及益智醇提物低劑量給藥組（P＜ 0.05，抑制率14.77%）表現出顯著的腫脹抑制作用。結果表明，益智醇提物能夠抑制小鼠的慢性炎癥，且高劑量的AOY給藥效果更好。結果見表2。

表2 各組小鼠棉球肉芽實驗結果比較（±s）

表2 各組小鼠棉球肉芽實驗結果比較（±s）

注：與Control組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

組別Control組Aspirin組AOY treated groupⅠ組AOY treated groupⅡ組抑制率/%—48.60 14.77 35.49 n 10 10 10 10肉芽/mg 13.27 ± 2.89 6.82 ± 1.78**11.31 ± 1.68*8.56 ± 1.86**

3.3 益智醇提物對自由基清除能力的影響

3.3.1 益智醇提物對DPPH自由基清除能力

DPPH 是一種穩定的氮中心的自由基，廣泛用于定量測定中藥和食品的抗氧化能力。益智醇提物在0.2～80 mg/mL 范圍內，隨著濃度的升高DPPH 自由基的清除能力增強，當濃度為2 mg/mL 時，清除能力達93.1%，接近VC水平，IC50= 0.36 mg/mL。結果見表3。

表3 不同濃度AOY DPPH自由基清除能力比較（±s）

表3 不同濃度AOY DPPH自由基清除能力比較（±s）

濃度/（mg/mL）0.2 0.5 1 2 5 10 20 40 60 80 n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 AOY/%36.28 ± 0.13 64.51 ± 0.45 80.68 ± 0.40 93.10 ± 0.89 93.04 ± 0.14 94.87 ± 0.15 94.84 ± 0.28 94.83 ± 0.71 95.70 ± 0.87 95.83 ± 0.15 VC/%68.25 ± 0.67 89.90 ± 0.17 94.84 ± 0.50 95.95 ± 0.49 94.98 ± 0.14 95.43 ± 0.68 97.23 ± 0.68 96.94 ± 0.68 97.83 ± 0.15 97.82 ± 0.14

3.3.2 益智醇提物對ABTS自由基清除能力

在適當的氧化劑作用ABTS 可氧化成綠色的ABTS自由基，當有抗氧化劑存在時可抑制自由基的產生，在734 nm 處測定吸光度可計算供試品的抗氧化能力。益智醇提物在0.2 ～ 80 mg/mL范圍內，隨著濃度的升高ABTS 自由基的清除能力增強，當濃度為5 mg/mL時，清除能力達95.8%，接近VC水平，IC50= 1.92 mg/mL。結果見表4。

表4 不同濃度AOY ABTS自由基清除能力比較（±s）

濃度/（mg/mL）0.2 0.5 1 2 5 10 20 40 60 80 n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 AOY/%14.62 ± 0.33 24.61 ± 0.24 32.36 ± 0.17 54.76 ± 0.17 95.80 ± 0.18 97.35 ± 0.18 97.35 ± 0.19 98.77 ± 0.25 97.45 ± 0.18 98.66 ± 0.17 VC/%80.33 ± 0.21 94.95 ± 0.18 98.41 ± 0.21 99.16 ± 0.16 99.96 ± 0.16 99.37 ± 0.21 98.34 ± 0.20 98.84 ± 0.19 99.06 ± 0.16 99.50 ± 0.21

3.3.3 益智醇提物對羥基自由基清除能力

羥基自由基的反應活性很高，若將反應體系加入水楊酸能夠有效捕捉羥基自由基，同時產生有色物質，在510 nm 波長處有強吸收。益智醇提物在0.2～80 mg/mL范圍內，隨著濃度的升高羥基自由基的清除能力增強，當濃度為20 mg/mL 時，清除能力達90.1%，接近VC水平，IC50= 7.18 mg/mL。結果見表5。

表5 不同濃度AOY羥基自由基清除能力比較（±s）

表5 不同濃度AOY羥基自由基清除能力比較（±s）

濃度/（mg/mL）0.2 0.5 1 2 5 10 20 40 60 80 n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 AOY/%10.36 ± 0.21 13.87 ± 0.19 21.88 ± 0.20 23.76 ± 0.16 30.75 ± 0.18 75.44 ± 0.19 90.10 ± 0.19 95.13 ± 0.12 94.74 ± 0.20 98.73 ± 0.21 VC/%18.37 ± 0.21 20.49 ± 0.19 31.30 ± 0.18 55.07 ± 0.17 92.78 ± 0.21 99.04 ± 0.16 98.94 ± 0.19 99.87 ± 0.15 99.29 ± 0.21 99.97 ± 0.06

3.3.4 益智醇提物對超氧陰離子清除能力

鄰苯三酚在堿性條件下可發生自氧化反應并釋放超氧陰離子（·O2-），生成的中間產物有色且該中間產物在325 nm 波長處有較強吸收。益智醇提物在0.2～80 mg/mL范圍內，隨著濃度的升高超氧陰離子的清除能力增強，當濃度為80 mg/mL時，清除能力達90.6%，從趨勢看可接近VC水平，IC50= 15.21 mg/mL。結果見表6。

表6 不同濃度AOY超氧陰離子清除能力比較（±s）

表6 不同濃度AOY超氧陰離子清除能力比較（±s）

濃度/（mg/mL）0.2 0.5 1 2 5 10 20 40 60 80 VC/%40.62 ± 0.30 44.13 ± 0.32 82.20 ± 0.30 95.41 ± 0.43 96.14 ± 0.33 97.62 ± 0.30 99.13 ± 0.33 98.60 ± 0.29 98.87 ± 0.25 99.23 ± 0.33 n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 AOY/%24.92 ± 0.29 28.43 ± 0.30 34.09 ± 0.22 36.93 ± 0.30 42.04 ± 0.33 44.12 ± 0.25 55.21 ± 0.24 69.80 ± 0.30 80.65 ± 0.34 90.60 ± 0.29

3.4 各組小鼠糖偏好實驗（SPT）結果比較

造模后，CUMS 組小鼠糖水偏好指數明顯低于Control 組（P＜ 0.01）；與CUMS 組比較，CUMS－FLU組、CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組的糖水偏好指數顯著升高（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。結果提示，氟西汀和AOY 高、低劑量均能緩解抑郁模型小鼠的抑郁癥狀。結果見表7。

表7 各組小鼠糖水偏好指數比較（±s）

表7 各組小鼠糖水偏好指數比較（±s）

注：與Control 組比較，##P ＜ 0.01；與CUMS 組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01。

糖水偏好指數/%60.77 ± 6.60 45.69 ± 7.32##59.48 ± 6.92**58.61 ± 6.80 56.78 ± 5.76*59.37 ± 6.27**組別Control組CUMS組CUMS－FLU組Control－AOY組CUMS－AOYⅠ組CUMS－AOYⅡ組n8 8 8 8 8 8

3.5 各組小鼠強迫游泳實驗（FST）結果比較

造模后，與Control 組比較，CUMS 組小鼠FST 比較靜止時間顯著增加（P＜ 0.01）；與CUMS 組比較，CUMS－FLU 組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠FST 靜止時間顯著減少（P＜ 0.01，P＜0.05）。結果提示，氟西汀和AOY 高、低劑量均能緩解抑郁模型小鼠的抑郁癥狀。結果見表8。

表8 各組小鼠FST靜止時間比較（±s）

表8 各組小鼠FST靜止時間比較（±s）

注：與Control 組比較，##P ＜ 0.01；與CUMS 組比較，*P ＜ 0.01，**P ＜0.01。

FST靜止時間/s 87.17 ± 11.15 116.7 ± 8.88##102.4 ± 6.10**85.24 ± 1.53 104.7 ± 8.47*100.6 ± 8.17**組別Control組CUMS組CUMS－FLU組Control－AOY組CUMS－AOYⅠ組CUMS－AOYⅡ組n8 8 8 8 8 8

3.6 各組小鼠懸尾實驗（TST）結果比較

造模后，與Control 組比較，CUMS 組小鼠TST 靜止時間顯著增加（P＜ 0.01）；與CUMS 組比較，CUMSFLU 組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠TST 靜止時間顯著減少（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。結果提示，氟西汀和AOY 高低劑量均能緩解抑郁模型小鼠的抑郁癥狀。結果見表9。

表9 各組小鼠TST靜止時間比較（±s）

表9 各組小鼠TST靜止時間比較（±s）

注：與Control 組比較，##P ＜ 0.01；與CUMS 組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01。

TST靜止時間/s 97.58 ± 7.80 123.40 ± 8.55##109.50 ± 6.94**106.90 ± 5.70 109.90 ± 5.09**112.00 ± 6.84*組別Control組CUMS組CUMS－FLU組Control－AOY組CUMS－AOYⅠ組CUMS－AOYⅡ組n8 8 8 8 8 8

3.7 各組小鼠海馬中SOD、GSH－Px、iNOS、COX－2、NF－κB、NLRP3和IL－1β水平比較

與Control 組比較，CUMS 組小鼠海馬中SOD 和GSH－Px的活力顯著降低（P＜ 0.01）；與CUMS組比較，CUMS－FLU組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠海馬中SOD的活力顯著升高（P＜ 0.01），GSHPx變化趨勢與SOD 相似（P＜ 0.01）。這說明氟西汀和AOY能通過增強模型組小鼠海馬當中的SOD和GSHPx 的活力來緩解CUMS 小鼠的抑郁癥狀。Control－AOY組中SOD和GSH－Px的活力值雖然較Control組的活力值低，但是沒有統計學意義，這說明AOY不會對空白組小鼠的SOD 和GSH－Px 的活力產生顯著性影響。結果見表10。

表10 小鼠海馬中的SOD和GSH－Px活力比較（±s）

表10 小鼠海馬中的SOD和GSH－Px活力比較（±s）

注：與Control組比較，##P ＜ 0.01；與CUMS組比較，**P ＜ 0.01。

組別Control組CUMS組CUMS－FLU組Control－AOY組CUMS－AOYⅠ組CUMS－AOYⅡ組GSH－Px/（U/mg protein）151.28 ± 4.07 134.84 ± 6.61##147.37 ± 3.57**145.94 ± 3.60 145.36 ± 4.34**147.33 ± 2.85**n8 8 8 8 8 8 SOD/（U/mg protein）25.07 ± 0.06 24.04 ± 0.16##24.94 ± 0.17**24.94 ± 0.11 24.66 ± 0.32**25.00 ± 0.10**

與Control 組比較，CUMS 組小鼠iNOS 含量顯著升高（P＜ 0.01）；與CUMS 組比較，CUMS－FLU 組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠iNOS 含量顯著降低（P＜ 0.05）。與Control組比較，CUMS組小鼠COX－2 含量顯著增加（P＜ 0.01）；與CUMS 組比較，CUMS－FLU 組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠COX－2 含量顯著減少（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。Control－AOY組小鼠海馬中iNOS與COX－2的含量與Control組比較無統計學意義。結果見表11。

表11 各組小鼠海馬中iNOS 和COX－2蛋白表達情況比較（±s）

表11 各組小鼠海馬中iNOS 和COX－2蛋白表達情況比較（±s）

注：與Control 組比較，##P ＜ 0.01；與CUMS 組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01。

COX－2/（U/L）16.73 ± 1.43 25.28 ± 2.48##16.96 ± 2.40**17.65 ± 1.74 22.11 ± 1.48*21.14 ± 1.66**組別Control組CUMS組CUMS－FLU組Control－AOY組CUMS－AOYⅠ組CUMS－AOYⅡ組n8 8 8 8 8 8 iNOS/（U/mL）1.17 ± 0.42 1.83 ± 0.17##1.42 ± 0.22*1.27 ± 0.11 1.43 ± 0.19*1.46 ± 0.22*

與Control 組比較，CUMS 組小鼠NF－κB 含量顯著升高（P＜ 0.01）；與CUMS 組比較，CUMS－FLU 組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠NF－κB含量顯著降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。與Control 組比較，CUMS組小鼠NLRP3含量顯著升高（P＜ 0.01）；與CUMS組比較，CUMS－FLU組和CUMS－AOY Ⅰ組和CUMSAOYⅡ組小鼠NLRP3 含量顯著降低（P＜ 0.01）。與Control組比較，CUMS組小鼠IL－1β 含量顯著升高（P＜0.01）；與CUMS組比較，CUMS－FLU 組含量和CUMSAOY Ⅰ組和CUMS－AOYⅡ組小鼠IL－1β含量顯著降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。與空白組比較，Control－AOY組小鼠海馬中NF－κB、NLRP3和IL－1β的含量無統計學意義。結果見表12。

表12 各組小鼠海馬中NF－κB、NLRP3和IL－1β蛋白表達情況比較（±s）

表12 各組小鼠海馬中NF－κB、NLRP3和IL－1β蛋白表達情況比較（±s）

注：與Control組比較，##P ＜ 0.01；與CUMS組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

IL－1β/（pg/mL）51.07 ± 1.09 74.45 ± 1.07##57.57 ± 1.18**55.72 ± 1.61 60.92 ± 1.60*52.08 ± 1.12**組別Control組CUMS組CUMS－FLU組Control－AOY組CUMS－AOYⅠ組CUMS－AOYⅡ組n8 8 8 8 8 8 NF－κB/（pg/mL）215.70 ± 1.30 310.60 ± 1.73##290.50 ± 1.36**243.60 ± 1.61 296.50 ± 1.86*259.50 ± 1.23**NLRP3/（pg/mL）166.40 ± 1.40 318.70 ± 1.71##191.40 ± 1.81**195.50 ± 1.53 192.60 ± 1.65**252.30 ± 1.70**

4 討論

炎癥發生、氧化應激都是抑郁發病的風險因素，會引發或加重抑郁病變。研究表明，抑郁癥患者常伴促炎細胞因子水平的升高，如腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、IL－1β和IL－6等［13］，類風濕關節炎等與炎癥相關性疾病常與抑郁癥共病［14］?？挂钟羲幠軌蛟谝欢ǔ潭壬辖档鸵钟舭Y患者的炎癥標志物水平，非甾體抗炎藥等抗炎藥物也被發現具有一定抗抑郁作用［15-16］。神經炎癥和腦內的氧化應激發生與人的生理和病理現象有密切的關系，能夠導致腦內神經元的損傷，以及一系列危及人體的不良危害。大量研究顯示，氧化應激損傷與多種疾病如神經退行性疾病、高血壓、腫瘤、糖尿病等密切相關，也參與了抑郁癥的發生和發展［17］。自由基是呼吸鏈的重要產物之一，可以通過攻擊DNA 堿基、蛋白質以及膜脂質誘導細胞產生過氧化反應，從而引起細胞損傷。通常，自由基可通過機體自身的抗氧化應激系統將其清除，包括SOD、GSH－PX 和CAT 等，但當自由基水平超過機體清除能力時，機體負荷過大產生脂質過氧化損傷，干擾細胞正常功能，參與抑郁癥的發生。本實驗通過小鼠耳腫脹實驗、小鼠棉球肉芽腫觀察小鼠的腫脹率、肉芽腫增長情況，證明了益智醇提物具有良好的抗炎活性；又通過考察AOY 對自由基的清除能力，證明了益智醇提物具有良好的抗氧化活性。

益智具有神經保護的作用，并且其黃酮類成分作用于BDNF靶點有一定的抗抑郁活性［8］，為了進一步研究益智的抗抑郁作用機制，本實驗建立了CUMS 小鼠抑郁模型，CUMS 可使小鼠海馬中SOD 含量以及GSH－Px含量下降。谷胱甘肽（GSH）是非酶促抗氧化系統的一個重要組成部分，包括還原型（GSH）和氧化型（GS－SG）兩種形式［18］。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它能催化GSH 變為GSSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。GSH 的變化與GSH－Px 和GLR（谷胱甘肽還原酶）的酶活性相關，CUMS 小鼠海馬內GSHPx 降低致使GSH 變為GSSG 反應速率減慢，小鼠氧化態成分增加，過氧化物增加，機體產生氧化反應，進一步使機體氧化生物標志物增加，如ROS、MDA 等。轉錄因子核因子－κB（NF－κB）是影響氧化應激和腦損傷相關的重要因素［19］。ROS 等氧化因子的激活導致IκB 的蛋白水解降解，伴隨NF－κB 的p50 和p65 異源二聚體產生核易位，致使NF－κB 靶基因進行轉錄，產生NF－κB［20］。在CUMS 小鼠中，SOD 以及GSH－Px 含量下降，誘導海馬內促氧化劑－抗氧化劑平衡向促氧化劑狀態轉變，激活核轉錄因子－κB（NF－κB），而經氟西汀和AOY 治療后，可改善上述情況。研究表明，NF－κB 的過度激活，可導致環氧合酶－2（COX－2）的轉錄，并與NOS2 5'側翼區中的κB 元件相互作用，引發iNOS 基因轉錄［21-22］。COX－2的激活可能導致額外的自由基和炎性細胞因子的釋放［23］，以及前列腺素的生物合成，進一步促進細胞產生炎癥反應，產生炎癥因子。在CUMS 小鼠海馬中NF－κB 受谷胱甘肽系統的影響，有明顯的增加，進而誘導iNOS、COX－2 含量增加，產生炎癥反應，使NLRP3 和IL－1β 炎癥相關因子含量增加。經氟西汀和AOY 治療后，均能產生回調的現象。本實驗設立Control－AOY 組，結果顯示，益智提取物對于正常小鼠無顯著性影響，一定程度上表明益智提取物對于動物不會產生毒性作用。

以上結果表明，AOY 作用于炎癥反應和氧化應激系統從而發揮抗抑郁的作用。