穿心蓮內(nèi)酯介導(dǎo)c-SKI抑制心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和心肌纖維化*

高 敏， 丁歡歡， 鄭麗華， 王 娟

（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830001）

心血管疾病是我國主要的死亡因素，其致死人數(shù)從2005年309萬增加到2020年458萬［1］，嚴(yán)重困擾著我國居民身心健康，加重了國家經(jīng)濟(jì)財(cái)政壓力。常見的心血管疾病主要包括冠心病、心肌梗死、主動(dòng)脈狹窄和心力衰竭等。心肌纖維化（myocardial fibrosis， MF）幾乎見于所有類型的心臟病［2］。因此，抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展極為關(guān)鍵。

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide， Andr）為穿心蓮的主要活性成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，對(duì)急性腎衰竭、糖尿病腎病和原發(fā)性腎病綜合征等多種腎臟疾病具有治療作用［3-4］，對(duì)四氯化碳所致肝纖維化和博來霉素所致肺纖維化具有明顯抑制作用［5-6］，在減少心臟纖維化和改善心臟功能方面有著顯著療效［7］，但其功效行使的生物學(xué)功能仍不明晰。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種多效細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，是心血管疾病的潛在治療靶點(diǎn)［8］。c-SKI （cellular Sloan-Kettering Institute）蛋白是TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)的重要核心抑制劑，能夠結(jié)合并抑制Smad蛋白活性［9-10］。本課題組前期工作已證實(shí)c-SKI和TGF-β1的關(guān)系，c-SKI能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人心肌成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）沉 積［11］，過 表 達(dá)c-SKI介 導(dǎo)TGF-β1/Smad和p38 MAPK信號(hào)通路能夠緩解心房顫動(dòng)［12］，抑制異丙腎上腺素（isoprenaline， ISO）誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化［13］，抑制人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［14］。過表達(dá)c-SKI可以減輕血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌纖維化［15］。因此，本研究擬通過構(gòu)建心肌纖維化小鼠模型，探究Andr通過c-SKI影響TGF-β1抑制心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和心肌纖維化的作用機(jī)制，以期為心肌纖維化的治療提供參考。

材料和方法

1 動(dòng)物

C57雄性小鼠18只，8周齡，（20.0±2.0） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。人心臟成纖維細(xì)胞（human cardiac fibroblasts， HCFBs）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）。

2 主要試劑

CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；mRNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒購于Thermo Fisher；c-SKI、纖連蛋白1（fibronectin 1， FN1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、I型膠原（collagen type I， Col I）和GAPDH抗體，以及兔抗鼠和鼠抗兔Ⅱ抗購于Abcam。

3 主要方法

3.1 小鼠心肌纖維化模型構(gòu)建 將18只雄性C57小鼠隨機(jī)分成3組：control組、模型組（ISO組）和ISO+Andr組，每組6只。ISO組和ISO+Andr組小鼠給予皮下注射5 mg/kg的ISO 1 d后，每天同一時(shí)點(diǎn)皮下注射2.5 mg/kg的ISO，持續(xù)注射30 d；control組注射生理鹽水［16］。ISO+Andr組Andr灌胃，control組和ISO組均給予等體積生理鹽水灌胃。給藥8周，處死小鼠，取心臟組織進(jìn)行病理檢測(cè)。

3.2 HE染色 將小鼠心臟組織在4%多聚甲醛中固定，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化、1%氨水返藍(lán)、伊紅復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡檢觀察心肌組織病理學(xué)變化。

3.3 Masson染色 將小鼠心臟組織于4%多聚甲醛固定，經(jīng)切片、脫蠟入水、透明、浸泡、蘇木素染色、乙酸分化、Masson返藍(lán)、麗春紅復(fù)染、脫水、封片，鏡檢觀察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析并計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)。

3.4 免疫組化 取小鼠心臟組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、切片，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，相應(yīng)Ⅱ抗處理15 min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡檢觀察并拍照。

3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HCFBs培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以不同濃度（0、10、50和100 μmol/L）的Andr干預(yù)HCFBs。接著用50 μmol/L Andr處理10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型，具體分組為：PBS組、模型組（TGF-β1組）和TGF-β1+Andr組。使用Lipofectamine 3000將sh-NC質(zhì)粒和sh-c-SKI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至TGF-β1誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞，并聯(lián)合Andr處理細(xì)胞，具體分組為：PBS組、TGF-β1組、TGF-β1+Andr組、TGF-β1+Andr+sh-NC組和TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組。收集細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。

3.6 倒置熒光顯微鏡觀察 將HCFBs接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，藥物干預(yù)后，置于倒置顯微鏡下以不同視野、不同倍數(shù)明場(chǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長密度，并拍照。

3.7 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將HCFBs按實(shí)驗(yàn)分組處理后，接種至96孔板中，培養(yǎng)48 h，棄上清，每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm處的吸光度。

3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， qPCR） 提取組織和細(xì)胞總RNA，計(jì)算上樣體積，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過高溫變性、退火和延伸等步驟進(jìn)行qPCR分析，觀察熔解曲線并用2-ΔΔCt法分析c-SKI的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Figure 1.Sequences of the primers

3.9 Western blot 提取組織、細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取適量蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉、4 ℃過夜孵育Ⅰ抗、室溫孵育相應(yīng)Ⅱ抗2 h、顯影拍照，并使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制圖表。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差（ANOVA）分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Andr在小鼠心肌纖維化模型中的干預(yù)作用

HE和Masson染色顯示，control組小鼠胞核均一，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間緊密連接；ISO組小鼠細(xì)胞核固縮變形，心肌組織破壞、有大量藍(lán)色膠原纖維沉積，纖維化程度嚴(yán)重；與ISO組相比，ISO+Andr組小鼠心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞膜完整，膠原容積分?jǐn)?shù)顯著減少（P＜0.01），見圖1A、B。免疫組化和qPCR結(jié)果顯示，與control組相比，ISO組c-SKI表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與ISO組相比，ISO+Andr組c-SKI表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖1C、D。Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，ISO組c-SKI表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與ISO組相比，ISO+Andr組c-SKI表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖1E、F。

Figure 1.Effects of andrgrapholide（Andr） on myocardial fibrosis model in mice.A： HE staining（scale bar=50 μm）；B： Masson staining（scale bar=50 μm）；C： the level of c-SKI was detect by immunohistochemical staining（scale bar=50 μm）；D：the level of c-SKI mRNA was detected by qPCR；E： the level of c-SKI was detect by Western blot；F： the levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I（Col I） were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs isoprenaline （ISO） group.圖1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)小鼠心肌纖維化模型的干預(yù)作用

2 Andr對(duì)HCFBs增殖及ECM相關(guān)蛋白的影響

50 μmol/L和100 μmol/L Andr處理HCFBs 48 h后，c-SKI表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），見圖2A、B。選用50 μmol/L Andr作為最低有效劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示，與PBS組相比，Andr組FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖2C。

Figure 2.Effect of andrgrapholide （Andr） on the viability and extracellular matrix-related protein expression in human cardiac fibroblasts （HCFBs）.A： the protein level of c-SKI was detected by Western blot；B： the cell viability was detected by CCK-8 assay；C： the protein levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group.圖2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)人心臟成纖維細(xì)胞活力和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 Andr對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HCFBs的影響

與PBS組相比，TGF-β1組細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)改變；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，見圖3A。Western blot結(jié)果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組細(xì)胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖3B。qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組c-SKI表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組c-SKI表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3C、D。

Figure 3.Effect of andrgrapholide （Andr） on transforming growth factor-β1 （TGF-β1）-induced human cardiac fibroblasts （HCFBs）.A： the cell morphology was observed by microscope （scale bar=100 μm）；B： the levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot；C： the mRNA level of c-SKI was detected by qPCR；D： the protein level of c-SKI was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group；##P＜0.01 vs TGF-β1 group.圖3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的人心臟成纖維細(xì)胞的影響

4 敲減c-SKI聯(lián)合Andr對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HCFBs細(xì)胞增殖與ECM沉積的影響

Western blot結(jié)果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組c-SKI表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組c-SKI表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與TGF-β1+Andr+sh-NC組相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組c-SKI表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖4A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組細(xì)胞活力顯著上升（P＜0.01）；與TGFβ1組相比，TGF-β1+Andr組細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05）；與TGF-β1+Andr+sh-NC組相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組細(xì)胞活力顯著上升（P＜0.05），見圖4B。

Figure 4.Effects of c-SKI knockdown combined with andrgrapholide （Andr） on the viability and extracellular matrix deposition of human cardiac fibroblasts （HCFBs） induced by transforming growth factor-β1 （TGF-β1）.A： the levels of c-SKI， fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot；B： the cell viability was measured by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs TGF-β1 group；△P＜0.05， △△P＜0.01 vs TGF-β1+Andr+sh-NC group.圖4 敲減c-SKI聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的人心臟成纖維細(xì)胞活力和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響

討 論

MF是對(duì)心肌損傷的反應(yīng)性重塑過程，主要表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞增殖，分泌ECM蛋白替代受損組織。然而，ECM的過度產(chǎn)生和沉積，以及I型和III型膠原比例的上升，導(dǎo)致病理性纖維化重塑，從而促進(jìn)心臟功能障礙的發(fā)展，最終導(dǎo)致心力衰竭，并增加死亡率。目前MF得不到很好的控制，是治療中仍待解決的難題。

Andr是從亞洲廣泛存在的草本穿心蓮中提取的二萜類化合物，因其具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性而被廣泛應(yīng)用，在保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［17］。Das等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，Andr能夠通過抑制NF-κB通路抑制腎炎小鼠腎組織纖維化，顯著抑制心肌梗死小鼠的心臟肥大、心臟纖維化、炎癥反應(yīng)等，緩解不良心臟重塑，增強(qiáng)Nrf2表達(dá)，減輕心肌梗死后的氧化應(yīng)激［19］。在本研究中，我們利用不同濃度的Andr干預(yù)HCFBs后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，c-SKI顯著上調(diào)，F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I顯著下調(diào)，表明Andr能有效抑制心肌纖維化，降低ECM相關(guān)蛋白水平，其作用可能與c-SKI表達(dá)相關(guān)。

TGF-β1是TGF-β最常見的一種亞型，對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)育和成熟、維持免疫耐受、體內(nèi)平衡及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)都極為關(guān)鍵［20］，在心臟和血管形態(tài)發(fā)生及心血管穩(wěn)態(tài)空間和時(shí)間調(diào)節(jié)中也起重要作用［21］。眾所周知，成纖維細(xì)胞的激活及其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是由TGF-β1介導(dǎo)的［22］。Liu等［23］發(fā)現(xiàn)，C188-9通過抑制TGF-β1信號(hào)通路誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化，緩解ISO誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化。Jurcic等［24］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ECM蛋白水平能促進(jìn)組織纖維化，而ECM的生成需要I型和III型膠原蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1組HCFBs數(shù)量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著上調(diào)，即TGFβ1能夠誘導(dǎo)心肌成纖維化；與TGF-β1組相比，加入Andr干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，細(xì)胞數(shù)量減少，F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著下調(diào)，即Andr能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維化，影響成纖維細(xì)胞活力，減少ECM沉積。

本課題組前期已證實(shí)過表達(dá)c-SKI可顯著抑制成纖維細(xì)胞和冠狀內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)［25］，同時(shí)c-SKI在快速心房起搏犬模型的心房組織中顯著下調(diào)，過表達(dá)c-SKI能抑制心房膠原沉積，且通過TGF-β1-Smad途徑逆轉(zhuǎn)心房顫動(dòng)誘導(dǎo)的心房重塑［26］。在治療腎纖維化的過程中，上調(diào)c-SKI表達(dá)可以抑制TGF-β1活性，阻止腎纖維化進(jìn)程［27］。凌佳等［28］發(fā)現(xiàn)，c-SKI沉默不會(huì)影響大鼠心肌細(xì)胞H9C2的增殖能力，但其侵襲和遷移能力均增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)先前已證實(shí)Andr促進(jìn)c-SKI表達(dá)，TGF-β1的作用則相反。之后，與TGFβ1+Andr+sh-NC組相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組c-SKI表達(dá)顯著下調(diào)，F(xiàn)N1、α-SMA、vimentin和Col I表達(dá)顯著上調(diào)，提示敲減c-SKI逆轉(zhuǎn)了Andr對(duì)HCFBs活力和ECM沉積的抑制作用。

綜上所述，Andr能有效抑制心肌纖維化和心肌成纖維細(xì)胞增殖，減少ECM沉積，其作用機(jī)制可能與調(diào)控c-SKI表達(dá)、影響TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)。下一步應(yīng)探究Andr介導(dǎo)c-SKI抑制心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和心肌纖維化與TGF-β1信號(hào)通路的具體分子作用機(jī)制，為心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供參考，給心力衰竭患者帶來新的治療思路。