藏紅花素緩解野百合堿誘導(dǎo)動脈型肺動脈高壓大鼠右心室損傷的機(jī)制研究*

盛艷玲， 宮小薇， 李志娟， 張 旋， 田 濤， 袁雅冬

（1華北石油管理局總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北 任丘 062552；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000）

動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）是一種惡性進(jìn)行性心肺疾病，以肺動脈遠(yuǎn)端閉塞為特征，引起肺血管阻力增加，并最終導(dǎo)致右心衰竭［1］。肺血管重塑，包括肺動脈狹窄和血管壁增厚，是PAH的病理基礎(chǔ)［2］，其中，炎癥被認(rèn)為在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，更是肺血管重塑的關(guān)鍵因素［3］。研究表明，炎癥細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等的浸潤是PAH發(fā)病機(jī)制中的重要觸發(fā)和驅(qū)動因素［4］。目前急需有效的治療方法來逆轉(zhuǎn)肺血管重塑和改變疾病進(jìn)程，因為現(xiàn)有的靶向藥物僅僅針對肺血管內(nèi)皮功能障礙，無法實現(xiàn)這一目標(biāo)［5］。應(yīng)用中藥治療疾病在我國歷史悠久，并且相比西藥安全性高，作用溫和持久，具有較大的開發(fā)價值和潛力。藏紅花是我國傳統(tǒng)的中藥材，一直以來用于治療各種疾病，包括哮喘、肝病、月經(jīng)紊亂、疼痛和腫瘤等。藏紅花中的黏蛋白能快速激活核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）和蛋白激酶C，進(jìn)而活化巨噬細(xì)胞，因而具有免疫調(diào)節(jié)的功能。藏紅花素（crocin），又稱為西紅花苷，是藏紅花的主要生物活性成分，也是自然界唯一存在的水溶性類胡蘿卜素。藏紅花素具有抗癌、抗凋亡、抗炎和抗氧化等作用［6-7］。研究表明，藏紅花素通過抑制炎性因子caspase1和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）表達(dá)保護(hù)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷小鼠的鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［8］。Li等［9］也發(fā)現(xiàn)藏紅花素能通過誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化而減輕冠狀動脈粥樣硬化。目前關(guān)于藏紅花素對PAH的影響的研究報導(dǎo)極少，本研究旨在分析藏紅花素能否通過調(diào)節(jié)炎癥從而緩解野百合堿（monocrotaline， MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室損傷。

材料和方法

1 實驗材料

藏紅花素（25 g；分子式：C44H64O24；分子量：976.97；批號：SSLBJ-MB）購自東京化學(xué)工業(yè)有限公司；MCT（20 mg；批號：AGPG-89251）購自上海廣銳生物科技有限公司；西地那非（sildenafil；50 mg；批號：1160012）購自廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒均購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；NF-κB P65抗體（80979-1-RR）和CCL2抗體（66272-1-Ig）購 自Proteintech；p-NF-κB P65抗 體（3033S）購自CST；p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）抗 體（bs-0637R）、p-p38 MARK抗體（bs-5476R）、CCR2抗體（ab273050）和CD68抗 體（ab201340）購 自Bioss。VECG-2303B動物心電圖機(jī)購自廣州市三銳電子科技有限公司；FA1004型電子天平購自上海精科天平；動物天平TCS.200購自中國武漢；PowerLab生理記錄儀購自澳大利亞AD儀器公司；石蠟包埋機(jī)及恒溫冷凍切片機(jī)購自Leica；PCR儀購自Bio-Rad；-80 ℃超低溫冰箱、電泳儀及多功能讀板機(jī)購自Thermo Fisher；凍臺購自武漢俊杰電子有限公司；恒溫?fù)u床購自蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；脫色搖床及勻漿儀購自賽維爾生物；光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；酶標(biāo)檢測儀購自Rayto；蛋白濃度定量儀及移液槍購自Eppendorf；光源購自Zeiss。

2 實驗動物分組

40只SPF級雄性SD大鼠，體重（200±20） g，購自北京華富康動物公司（實驗動物使用許可證號為IRM-DWLL-2020075），并遵循美國國家學(xué)術(shù)研究委員會實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南。大鼠在帶有飼料的塑料籠中飼養(yǎng)，定期添加和更換飲用水和墊料。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，大鼠隨機(jī)分為normal組、PAH組、crocin組和sildenafil組，每組10只。PAH組、crocin組和sildenafil組大鼠單次皮下注射MCT（50 mg/kg），以建立PAH模型；normal組大鼠皮下注射等體積生理鹽水。自MCT注射之日起，crocin組大鼠給予藏紅花素（200 mg/kg）［10］，sildenafil組大鼠給予sildenafil（30 mg/kg），PAH組和normal組大鼠給予等體積生理鹽水，每日1次灌胃，持續(xù)4周。

3 主要實驗方法

3.1 血流動力學(xué)及指數(shù)的測定 4周后，所有大鼠稱量體重，予3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于蛙板上，剪去大鼠右側(cè)頸部體毛，75%醫(yī)用乙醇消毒，做右頸部外上至內(nèi)下斜行切口至鎖骨上部，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露右側(cè)頸外靜脈，游離約1 cm，棉線結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)心端后，提起頸外靜脈，朝心室方向剪開一個2～3 mm“V”形切口，插入微導(dǎo)管，并通過壓力傳感器連接至Powerlab生理記錄儀，導(dǎo)管送至右心室，測定心率，在生理記錄儀顯示屏上可以見到振幅較大的心室波，通過顯示的波形曲線和壓力值測量右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure， RVSP），導(dǎo)管繼續(xù)往里前進(jìn)，通過壓力波形變化來判斷導(dǎo)管所處位置，待導(dǎo)管行至肺動脈后記錄大鼠平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure， mPAP）。測壓結(jié)束后放血處死大鼠，取出大鼠心臟并稱重，去除脂肪、血管及心房、心耳組織，沿室間隔分離右心室游離壁，剩余的部分即為左心室及室間隔組織。隨后，吸干水分，天平秤量右心室和左心室+室間隔的重量，計算右心室質(zhì)量指數(shù)［right ventricular mass index， RVMI；RVMI=右心室重量（mg）/體重（g）］和右心室肥大指數(shù)（right ventricular hypertrophy index， RVHI；RVHI=右心室重量/左心室及室間隔重量），以反映右心室肥大程度。

3.2 右心室組織學(xué)檢查 將大鼠右心室組織浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h，脫水后二甲苯透明化，石蠟包埋固定，切成5 mm切片。切片用masson三色染色，光學(xué)顯微鏡觀察右心室染色標(biāo)本，檢測右心室膠原纖維及心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

3.3 ELISA測量炎癥細(xì)胞因子 取右心室組織0.1 g，置于0.9%生理鹽水中超聲研磨。之后以3 000 r/min離心15 min獲得肺組織和右心室組織勻漿。ELISA試劑盒測定炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白含量，具體程序參照試劑盒說明書操作。

3.4 RT-qPCR測量炎癥細(xì)胞因子 使用RNA提取試劑盒從100 mg大鼠右心室組織中制備和純化總RNA，以紫外分光光度計測定總RNA的濃度與純度，將提取的總RNA分裝每管2 μL，于-80 ℃冰箱保存。取2 μL總RNA配成gDNA去除反應(yīng)體系混合液，另外配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液，將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液加到gDNA去除反應(yīng)體系混合液中充分混勻，42 ℃孵育15 min，之后95 ℃孵育3 min，得到cDNA。配制反應(yīng)體系20 μL，行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，66 ℃延伸32 s，40個循環(huán)。內(nèi)參照選用β-actin。用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.5 Western blot檢測p38 MAPK、p-p38 MAPK、NFκB P65、p-NF-κB P65和CCL2水平 取大鼠右心室100 mg放入勻漿器中提取組織蛋白，配制BCA工作液，加熱使蛋白變性，用酶標(biāo)儀在562 nm波長下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計算蛋白濃度及上樣量。制備凝膠，在30 mA恒流下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后在電壓100 V、電流200 mA下以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移動至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜上，時間為2 h。室溫下將膜密封在Tris-buffered saline/0.1% Tween 20/5%脫脂奶粉（TBST/B）中1 h，然后將膜與Ⅰ抗溶液（抗體稀釋比例：p38 MAPK為1∶500，p-p38 MAPK為1∶500，NFκB P65為1∶1 000，p-NF-κB P65為1：1 000，CCL2為1∶1 000，GAPDH為1∶1 000）在4 ℃下輕輕搖動孵育過夜，用TBST/B洗膜3次后立即轉(zhuǎn)移到Ⅱ抗［HRPGoat Anti-Rabbit IgG（H+L）］溶液中，室溫孵育1 h，將膜再次洗滌3次，并用Luminata crescendo Western HRP底物顯色。使用Molecular Imager ChemiDoc XRS系統(tǒng)凝膠成像分析儀獲取圖像，用ImageJ圖像軟件分析各條帶的灰度值，比較各組間差異。

3.6 免疫熒光分析 右心室組織切片與波形蛋白抗體（1∶200）、CCR2抗體（1∶200）和CD68抗體（1∶200）在4 ℃下培養(yǎng)過夜，添加Ⅱ抗［CoraLite594 標(biāo)記的純山羊抗小鼠IgG（H+L）］，37 ℃孵育 2 h。細(xì)胞核用4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染。在熒光顯微鏡下觀察組織的病理變化。使用Image-Pro Plus 6.0對免疫熒光染色進(jìn)行量化。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗中所有變量數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，通過單因素方差分析來檢查各組之間的統(tǒng)計差異，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。曲線擬合使用GraphPad Prism 5進(jìn)行。

結(jié) 果

1 藏紅花素對大鼠一般情況的影響

在適應(yīng)性飼養(yǎng)階段，各組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色光亮，進(jìn)食好，活躍，反應(yīng)靈敏，無異常。在實驗過程中，normal組大鼠一般情況較前無明顯變化；PAH組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、食量減少、反應(yīng)遲鈍、體毛晦暗和呼吸急促等癥狀，最后以靜臥為主；crocin組和sildenafil組大鼠一般情況介于對照組和PAH組大鼠之間。

2 藏紅花素對大鼠體重及心率的影響

實驗開始前，各組間大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4周后，各組間大鼠體重及心率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 藏紅花素對大鼠體重和心率的影響Table 2.Effects of crocin on rat body weight and heart rate

3 藏紅花素對大鼠血流動力學(xué)的影響

與normal組相比，PAH組大鼠RVSP及mPAP顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組和sildenafil組大鼠RVSP顯著下降（P＜0.01）；crocin組和sildenafil組大鼠mPAP顯著下降（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Effects of crocin on rat hemodynamics.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs normal group；●P＜0.05， ●●P＜0.01 vs PAH group.圖1 藏紅花素對大鼠血流動力學(xué)的影響

4 藏紅花素對大鼠右心指數(shù)的影響

與normal組相比，PAH組大鼠RVHI及RVMI顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組和sildenafil組大鼠RVHI及RVMI顯著下降（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.Effects of crocin on rat right ventricular indexes.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs Normal group；●●P＜0.01 vs PAH group.圖2 藏紅花素對大鼠右心指數(shù)的影響

5 藏紅花素對大鼠右心室組織病理學(xué)的影響

Masson染色顯示右心室膠原纖維藍(lán)染。Normal組大鼠心肌細(xì)胞呈紅色，緊密排列，細(xì)胞核呈褐色，心肌細(xì)胞間隙窄而清晰可見，基質(zhì)中有少量藍(lán)色膠原纖維，分布稀疏，染色淺；PAH組大鼠心肌間隙明顯增寬，心肌纖維大小不等，排列混亂，部分?jǐn)嗔眩募〖?xì)胞水腫，部分細(xì)胞核溶解消失，間質(zhì)內(nèi)可見較多藍(lán)色膠原纖維，與心肌間質(zhì)呈現(xiàn)出紊亂的漩渦狀或柵欄狀排列；crocin組和sildenafil組大鼠的心肌細(xì)胞排列緊密，輕度水腫，膠原纖維輕度增生，見圖3。

Figure 3.Masson staining of rat right ventricles.Scale bar=20 μm.圖3 大鼠右心室masson染色

6 藏紅花素對大鼠右心室IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與PAH組相比，藏紅花素及西地那非干預(yù)降低了以上3種炎癥細(xì)胞因子的蛋白水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4A。RT-qPCR顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組及sildenafil組IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA顯著降低（P＜0.01），見圖4B。

Figure 4.Effect of crocin on protein levels （A） and relative mRNA expression levels （B） of IL-1β， IL-6 and TNF-α in rat right ventricles.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs Normal group；●P＜0.05， ●●P＜0.01 vs PAH group.圖4 藏紅花素對大鼠右心室IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響

7 藏紅花素對大鼠右心室p38 MAPK/NF-κB通路的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室細(xì)胞中p-p38 MAPK表達(dá)顯著上調(diào)，p-p38 MAPK與p38 MAPK比值顯著升高（P＜0.05），p-NF-κB P65表達(dá)顯著上調(diào)，p-NF-κB P65與NF-κB P65比值顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組、sildenafil組大鼠右心室細(xì)胞中p-p38 MAPK表達(dá)顯著下調(diào)，p-p38 MAPK與p38 MAPK比值顯著降低（P＜0.05），p-NF-κB P65表達(dá)顯著下調(diào)，p-NFκB P65與NF-κB P65比值顯著降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5.Effects of crocin on the p38 MAPK/NF-κB pathway in rat right ventricle lung tissues.Relative protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.☆P＜0.05， ☆☆P＜0.01 vs normal group；●P＜0.05 vs PAH group.圖5 藏紅花素對大鼠右心室p38 MAPK/NF-κB通路的影響

8 藏紅花素對大鼠右心室CCL2/CCR2通路及巨噬細(xì)胞的影響

8.1 藏紅花素對大鼠右心室CCL2的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示，與normal組相比，PAH組大鼠右心室中CCL2蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組及sildenafil大鼠CCL2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖6。

Figure 6.Effect of crocin on CCL2 in rat right ventricles.Relative protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs normal group；●P＜0.05 vs PAH group.圖6 藏紅花素對大鼠右心室CCL2的影響

8.2 藏紅花素對大鼠右心室CCR2及巨噬細(xì)胞的影響 將大鼠右心室切片進(jìn)行CCR2和CD68免疫熒光共染。結(jié)果顯示，normal、PAH、crocin和sildenafil組大鼠右心室CCR2+反應(yīng)區(qū)（紅色熒光所示）均與CD68+反應(yīng)區(qū)（綠色熒光所示）相重疊。與normal組相比，PAH組中CCR2+/CD68+熒光表達(dá)明顯增多；與PAH組相比，crocin及sildenafil組CCR2+/CD68+熒光表達(dá)明顯減少。見圖7。

Figure 7.Immunofluorescence staining of rat right ventricles.Scale bar=50 μm.White arrows indicate CD68+/CCR2+ positive areas.圖7 大鼠右心室免疫熒光染色

對免疫熒光染色進(jìn)行量化分析發(fā)現(xiàn)，與normal組相比，PAH組大鼠右心室中CCR2+/CD68+反應(yīng)強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01）；與PAH組相比，crocin組及sildenafil組CCR2+/CD68+反應(yīng)強(qiáng)度顯著下降（P＜0.01），見圖8。

Figure 8.Effects of crocin on the intensity of CCR2+/CD68+ reaction in rat right ventricles.Mean±SD.n=10.☆☆P＜0.01 vs normal group；●●P＜0.01 vs PAH group.圖8 藏紅花素對大鼠右心室CCR2+/CD68+反應(yīng)強(qiáng)度的影響

討 論

在本研究中我們使用了由MCT誘導(dǎo)的嚙齒類PAH動物模型，結(jié)果顯示PAH組mPAP異常升高，表明PAH模型的建立是成功的。先前的研究證實，在大鼠單次注射野百合堿后 21 d內(nèi)誘發(fā)的惡病質(zhì)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的體重減輕［11］，本研究未發(fā)現(xiàn)PAH組大鼠與其它組別相比有明顯的體重下降，其原因可能與PAH大鼠在中后期行動減少并且出現(xiàn)胸腔積液有關(guān)，導(dǎo)致體重?zé)o明顯差異。西地那非是治療PAH的有效藥物，在許多研究PAH的文章中用做陽性對照藥物。在本研究中，我們也將西地那非用做陽性對照藥物，結(jié)果表明，藏紅花素可顯著緩解MCT誘導(dǎo)PAH大鼠的右心室損傷，其作用與本實驗劑量下西地那非的作用相當(dāng)。

右心室功能是PAH患者臨床預(yù)后和生存的主要決定因素，隨著PAH的進(jìn)展，肺血管阻力不斷增加，右心室出現(xiàn)肥大擴(kuò)張及纖維化［12］，最終導(dǎo)致右心衰竭，是PAH患者死亡的主要原因［13］。因此，積極尋找PAH 患者右心重塑的發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行早期干預(yù)，對患者的預(yù)后非常關(guān)鍵。

心力衰竭與炎癥密切相關(guān)。Hanna等［14］報道炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)所有心肌細(xì)胞的表型和功能，抑制心肌細(xì)胞的收縮功能，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥激活，刺激微血管炎癥和功能障礙，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的基質(zhì)降解表型。在許多心肌疾病中，成纖維細(xì)胞活化是由炎癥反應(yīng)觸發(fā)導(dǎo)致的［15］。本研究也在PAH大鼠的右心室觀察到膠原纖維沉積，而藏紅花素干預(yù)對大鼠右心室的膠原沉積有明顯的改善作用。

NF-κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，研究顯示NF-κB的激活與PASMCs的增殖有關(guān)［16］。P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）是MAPK家族中調(diào)控炎癥反應(yīng)最重要的成員，當(dāng)無炎癥時p38 MAPK呈低表達(dá)，在受到炎性因子刺激后p38 MAPK磷酸化水平升高，可以調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達(dá)［17］，被認(rèn)為是天然藥物抗炎作用的潛在靶點。研究表明p38 MAPK與肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［18］和PASMCs增殖［19］密切相關(guān)。有報道抑制p38 MAPK的磷酸化，能抑制炎癥反應(yīng)，降低PAH［20］。NF-κB是p38 MAPK的下游信號分子之一，p38 MAPK信號通路與NF-κB可以通過交互作用共同影響炎癥的發(fā)生發(fā)展［21］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-a等激活p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，磷酸化的p38 MAPK通過特異性底物激活NF-κB通路，使胞質(zhì)內(nèi)NF-κB 部分磷酸化，進(jìn)而啟動炎癥因子的翻譯轉(zhuǎn)錄，釋放大量的炎癥因子比如IL-1β、 IL-6和TNF-α等［22］，導(dǎo)致炎癥因子的“瀑布效應(yīng)”。而抑制 p38 MAPK可抑制NF-κB的活性進(jìn)而降低TNF-α、IL-1β及IL-6 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕肺部病理損傷［23］。在巨噬細(xì)胞中下調(diào)NF-κB和MAPK信號通路，可下調(diào)IL-1β、 IL-6、TNF-α和CCL2的表達(dá)，進(jìn)而降低巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)［24］；而對p38 MAPK 的抑制可介導(dǎo)對NF-κB通路的抑制作用［25］。以往的研究就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，中藥成分可以通過抑制MAPK和NF-kB信號通路而發(fā)揮抗炎作用［26］。本研究結(jié)果也顯示，PAH模型大鼠肺組織以及右心室中p-p38 MAPK和p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平較正常大鼠顯著升高，p38 MAPK及NF-κB P65 磷酸化水平反映其活化狀態(tài)，提示其共同參與了MCT誘導(dǎo)的PAH的炎癥調(diào)控過程。經(jīng)藏紅花素干預(yù)后p38 MAPK 及NF-κB P65 磷酸化水平與模型組比較呈明顯降低，同時NF-κB下游因子的表達(dá)水平也被顯著下調(diào)，提示藏紅花素的抗炎作用與抑制p38 MAPK /NF-κB信號通路有關(guān)。這表明NF-κB與p38 MAPK可能是PAH中潛在的作用靶點。

巨噬細(xì)胞在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著巨大的作用。吸引巨噬細(xì)胞的趨化因子很多，其中以CCL2 最為重要，它通過與巨噬細(xì)胞表面受體CCR2結(jié)合發(fā)揮作用， 是單核/巨噬細(xì)胞細(xì)胞募集和激活的最具生物活性的趨化因子［27］，可將巨噬細(xì)胞吸引至炎癥部位。活化的巨噬細(xì)胞釋放包括IL-1 、IL-6、IL-8以及TNFa 等多種細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)［28］。CD68是巨噬細(xì)胞標(biāo)志物［29］，為了驗證CCR2主要在巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，我們將右心室組織進(jìn)行CCR2 和CD68免疫熒光共染。結(jié)果顯示：各組CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)區(qū)域均與CCR2+表達(dá)區(qū)域明顯重合。結(jié)果還表明，PAH組大鼠右心室中巨噬細(xì)胞浸潤較正常組明顯增加，而藏紅花素及西地那非干預(yù)組右心室中巨噬細(xì)胞浸潤較PAH組明顯減輕，說明巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在PAH右心室損傷中也發(fā)揮了作用。Al-Qazazi等［30］也在PAH模型和患者失代償?shù)挠倚氖抑邪l(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的激活，從而認(rèn)為右心室炎癥也是PAH右心室衰竭的原因，而不僅僅是由右心室負(fù)荷升高引起的，這為PAH提出了一種新的治療模式。經(jīng)過刺激的巨噬細(xì)胞，可以活化NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。Zimmer等［31］還發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞中的 CCL2水平受到NF-κB的調(diào)節(jié)，這說明巨噬細(xì)胞與NF-κB相互影響、相互促進(jìn)，使炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大。本研究也顯示CCL2/CCR2 通路和巨噬細(xì)胞分布的變化趨勢與p38 MAPK/NF-κB的變化相同。因此，抑制CCL2 的過度表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞的聚集，從而抑制NF-κB等炎癥因子的釋放，使失控的炎癥反應(yīng)得以控制，將有望成為治療PAH的新思路。

本研究也存在一些局限性：首先，抗炎已成為治療PAH的理念之一，但目前的研究僅限于動物模型，尚未應(yīng)用于PAH患者，本研究也是如此。再者，巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)對疾病的具體作用以及NF-κB通路與CCL2 相互促進(jìn)的具體機(jī)制尚不完全清楚，有待于進(jìn)一步的研究。