經血源子宮內膜干細胞移植通過免疫調節緩解化療引起的小鼠腸道損傷和菌群失調*

劉 秦， 常夢源， 宋豪鋒， 杜晨旭， 李永海， 張勝輝， 劉彥禮△， 林俊堂，3

（1新鄉醫學院生命科學技術學院，河南 新鄉 453003；2新鄉醫學院干細胞與生物治療技術研究中心，河南 新鄉 453003；3新鄉醫學院醫學工程學院，河南 新鄉 453003）

腫瘤作為全球公共衛生的主要威脅之一，為患者及其家庭帶來了巨大的心理和生理負擔。據統計，2022年約有482萬例新發腫瘤病例和320萬例腫瘤死亡病例［1］。盡管靶向治療和免疫治療等醫學治療手段不斷進步，但化療、放療和手術仍然是腫瘤的主要治療手段。而常規化療藥物包括抗代謝物、烷基化劑、抗腫瘤抗生素和金屬鉑類絡合物等，均具有細胞毒性，在有效殺死腫瘤細胞的同時對健康細胞也產生毒性，會導致腸道黏膜炎、骨髓抑制、脫發及骨質疏松等癥狀［2-4］。約40%的標準劑量化療患者和100%的大劑量化療患者會出現惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等和腸黏膜炎相關的營養不良［5］。而化療引起的腸黏膜炎（chemotherapy-induced intestinal mucositis， CIM）是由化療藥物直接誘導的細胞毒性和異常炎癥過程引起的腸道黏膜損傷，不僅嚴重降低患者的生活質量，增加住院費用，而且還會影響患者抗癌治療的依從性，降低患者對化療的耐受性，從而導致化療方案實施的中斷、延遲等［6］。順鉑（cisplatin，Cis）作為常用的鉑類化療藥物之一，在臨床上已廣泛應用于不同類型腫瘤的治療，包括卵巢癌、乳腺癌、睪丸癌和頭頸部實體瘤等［7-9］。鉑類藥物對細胞的治療和毒性作用，與其與DNA上的嘌呤堿基的相互作用相關，可通過干擾DNA修復，抑制DNA合成和有絲分裂，隨后誘導細胞凋亡［10］。此外，Cis具有較強的腎毒性、耳毒性、神經毒性以及胃腸道毒性等毒副作用，顯著影響治療效果。研究表明，化療引起腸道毒性的主要機制在于氧化應激和炎癥反應，通過增加細胞產生活性氧自由基，激活促炎因子及促凋亡因子的表達，導致腸上皮細胞損傷及腸道微生物紊亂［11］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種多能性干細胞，具有良好增殖能力、營養及免疫調節能力，在諸多疾病的治療中展現出效果［12］。經血源子宮內膜干細胞（menstrual bloodderived endometrial stem cells， MenSCs）憑借其周期性、無創采集、來源豐富、良好的增殖能力以及可用于自體移植等優勢，逐漸成為干細胞治療的優良種子細胞［13-14］。因此，本研究旨在明確MenSCs移植對Cis引起的小鼠腸黏膜炎的治療效果，并進一步分析其中的機制及其對小鼠腸道菌群的影響，以期為臨床使用MenSCs治療CIM提供參考資料。

材料和方法

1 實驗動物

30只SPF級別ICR小鼠，6～8周，雌性，體重（26±2） g，許可證號為SCXK（京）2021-0006，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物均常規飼養于恒溫（25±1） ℃、恒濕（45%～65%）的潔凈動物房中，12 h/12 h明暗交替，可自由進食飲水。所有實驗程序均按照新鄉醫學院倫理委員會要求進行。

2 主要試劑

Cis注射液（云南生物谷藥業有限公司）；IL-10鼠單克隆抗體（Proteintech，60269-1-Ig）、Bax兔多克隆抗體（Proteintech，50599-2-Ig）、IL-6鼠單克隆抗體（Proteintech，66146-1-Ig）、Bcl-2兔多克隆抗體（Proteintech，26593-1-AP）、緊密連接蛋白ZO-1兔多克隆抗體（Proteintech，21773-1-AP）及occludin兔多克隆抗體（Proteintech，27260-1-AP）；IL-1β兔單克隆抗體（Cell signaling technology，12703S）；β-tubulin兔單克隆抗體（Abways，AB0039）；HRP標記的山羊抗兔IgGⅡ抗（absin，abs20040）和HRP標記的山羊抗鼠IgGⅡ抗（absin，abs20039）；HE染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

3 主要方法

3.1 Cis誘導小鼠腸道損傷模型構建及MenSCs移植：本模型構建方法以腹腔注射Cis（2 mg/kg）引起小鼠腸黏膜炎為基礎［15］，模擬臨床化療相關腸黏膜炎的發病原因，構建小鼠化療后腸道損傷模型。將符合實驗標準的30只ICR小鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常（normal）組、Cis組和Cis+MenSC組，每組10只。除正常組小鼠外，其余小鼠從第1天（Day 1）開始，連續5天腹腔注射Cis（2 mg/kg）；正常組小鼠經腹腔注射接受等體積生理鹽水。第7天Cis+Men-SC組小鼠經尾靜脈移植MenSCs［每只小鼠1×106（300 μL）］，正常組和Cis組小鼠經尾靜脈輸入等體積生理鹽水（圖1A）。2周后采用頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠全部腸道做HE染色、免疫組化染色和Western blot實驗，收集各組小鼠腸道糞便，進行高通量16S rDNA擴增子測序。

Figure 1.Flow chart of animal experiment and body weight changes of mice in each group.A： flow chart of animal experiment；B：body weight changes of mice in each group.Compared to the Cis group， the MenSCs-treated mice showed significantly increased body weight.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs Cis group at same time.圖1 動物實驗流程及各組小鼠體重變化

3.2 體重檢測 自Day 1開始觀察，每隔3天定時稱量各組小鼠體重，同時觀察小鼠毛發、活動情況、精神狀態等。

3.3 HE染色 將各組小鼠腸道組織于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水、石蠟包埋后進行切片，厚度為5 μm。將組織切片經二甲苯脫蠟后進行HE染色、無水乙醇脫水、中性樹膠封片后于倒置顯微鏡下觀察拍照。

3.4 免疫組化染色 小鼠腸道石蠟切片常規脫蠟、乙醇梯度孵育復水，抗原修復；使用封閉緩沖液封閉標本60 min，4 ℃條件下加入Ⅰ抗（F4/80，1∶200；IL-6，1∶200）孵育過夜；蘇木素復染、脫水、風干后將切片密封并在顯微鏡下成像。

3.5 Western blot 小鼠腸道組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液于組織勻漿破碎儀中提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度；樣本進行SDS-PAGE分離，400 mA恒流轉膜45 min，5% BSA室溫封閉1 h，4 ℃條件下加入Ⅰ抗（β-tubulin、ZO-1、occludin、IL-1β、IL-6、IL-10、Bax和Bcl-2）分別孵育過夜，室溫下加入Ⅱ抗孵育1 h；ECL發光后凝膠成像儀采集圖片。Image J軟件分析目的條帶灰度值，以β-tubulin為內參照，分析目的蛋白的表達水平。

3.6 腸道微生物的分析測定 小鼠糞便樣本高通量16S rDNA擴增子測序由華大基因完成。首先提取糞便中細菌的總DNA，取質量合格的基因組DNA樣品30 ng及對應的融合引物配置PCR反應體系，設置PCR反應參數進行PCR擴增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴增產物進行純化并溶于Elution Buffer，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫根據插入片段大小，選擇HiSeq平臺進行測序。

4 統計學處理

通過GraphPad Prism 8.0軟件對本研究數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MenSCs顯著改善Cis誘導小鼠體重

正常組小鼠體重隨時間逐步增加，排便正常，活動自如。Cis組小鼠體重下降，出現腹瀉，毛發粗糙，活動逐漸緩慢。給予MenSCs移植后，小鼠毛發光滑，活動能力增強，體重顯著恢復（P＜0.05），見圖1。進一步解剖取材顯示，Cis組小鼠腸道外觀呈暗紅色，無光澤，腸道解剖位置改變；而Cis+MenSC組小鼠腸道血供良好，呈鮮紅色，腸道解剖位置正常。

2 MenSCs顯著改善Cis誘導小鼠腸道微觀結構及上調緊密連接蛋白

HE染色結果可見，正常組小鼠小腸和結腸組織腸絨毛纖細，腺體結構完整，排列有序，無炎癥與組織水腫表現；而Cis組小鼠腸道組織與正常組相比，腸黏膜變薄，絨毛縮短，腺體排列雜亂，杯狀細胞減少，炎癥細胞浸潤嚴重，腸壁組織有存在缺血區域；經MenSCs移植后，小鼠腸道黏膜損傷和炎癥浸潤減輕，見圖2A。隨后小鼠腸道組織緊密連接蛋白檢測結果顯示，經MenSCs移植后，ZO-1和occludin在小腸和結腸組織中的表達均顯著上調（P＜0.05），見圖2B。

Figure 2.MenSCs transplantation significantly improved the intestinal microstructure and up-regulated the expression of tight junction related proteins in Cis-treated mice.A： HE staining was performed to evaluate the micromorphology of small intestine and colon tissues in mice.The results showed that MenSCs transplantation significantly relieved intestinal lymphocytes infiltration， alleviated intestinal villous edema， and orderly arranged glands in intestinal tissues in Cis-treated mice（n=5）；B： the expression of tight junction related proteins in small intestine and colon was detected by Western blot and quantified using Image J software.The results demonstrated that MenSCs transplantation significantly up-regulated the expression of intestinal tight junction related proteins ZO-1 and occludin in Cis-treated mice.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs normal group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs Cis group.圖2 MenSCs移植顯著改善Cis誘導的小鼠腸道微觀結構并上調緊密連接蛋白的表達

3 MenSCs顯著下調腸道組織中促炎因子及促凋亡蛋白的表達

小鼠腸道炎癥因子檢測結果顯示，經MenSCs移植后小鼠腸道組織中F4/80和IL-6染色陽性細胞率顯著降低（P＜0.01）；促炎因子IL-1β和IL-6的表達顯著下調（P＜0.01），抑炎因子IL-10的表達顯著上調（P＜0.01），見圖3。進一步檢測結果顯示，經MenSCs移植后小鼠腸道組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著上調（P＜0.01），而促凋亡相關蛋白Bax表達顯著下調（P＜0.01），見圖4。

Figure 3.Effect of MenSCs transplantation on Cis-induced expression of inflammatory factors in the intestinal tissue of mice.A： the expression of F4/80 and IL-6 in the intestinal tissue of mice was detected by immunohistochemical staining and quantified using IPP software.The results demonstrated that MenSCs transplantation significantly inhibited the macrophages infiltration in the intestinal tissues of Cis-induced mice， and down-regulated the expression of IL-6；B： the expression of IL-1β，IL-6 and IL-10 in intestinal tissues was detected by Western blot and quantified using Image J software.The results indicated that MenSCs transplantation significantly down-regulated the expression of pro-inflammatory factors （IL-1β and IL-6）and up-regulated anti-inflammatory factor （IL-10） in the intestinal tissues of Cis-induced mice.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Cis group.圖3 MenSCs移植對Cis誘導的小鼠腸道炎癥因子表達的影響

Figure 4.Effect of MenSCs transplantation on Cis-induced expression of apoptotic factors in the intestinal tissues of mice.The results indicated that MenSCs transplantation significantly up-regulated the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and downregulated the pro-apoptotic protein Bax in the intestinal tissues of Cis-induced mice.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Cis group.圖4 MenSCs移植對Cis誘導的小鼠腸道凋亡因子表達的影響

4 MenSCs改善小鼠腸道微生物群的多樣性和豐富度

小鼠糞便16S rDNA測序結果顯示，在所有樣本的362個操作分類單元（operational taxonomic unitis，OUT）中，共檢測到255個通用OTU。Cis組、Cis+MenSC組中分別有50個和57個獨特的OTU（圖5A）。對兩組間的Alpha多樣性指數進行差異分析的檢驗，結果顯示與Cis組小鼠相比，Cis+MenSC組小鼠腸道微生物辛普森多樣性指數（ACE index）和香農-威納指數（Shannon index）都有顯著增加（P＜0.05），見圖5B、C。物種差異分析結果顯示，MenSCs移植后不僅顯著降低Cis組小鼠腸道中有害微生物艾森伯格氏菌（Eisenbergiella tayi）和人結腸厭氧棍狀菌（Anaerotruncus colihominis）的豐度（P＜0.01），同時還顯著增加腸道中有益微生物乳桿菌（Lactobacillus apodemi）的豐度（P＜0.05），見圖5D、E。而進一步差異微生物群落功能富集結果顯示，Cis組和Cis+Men-SC組小鼠腸道差異微生物主要富集在如下顯著改變的代謝途徑，包括氨基酸代謝（amino acid metabolism）、消化系統（digestive system）、折疊分類及降解（folding， sorting and degradation）等部分，見圖5F。

討 論

腫瘤不僅是全球死亡人數的第二大因素，也一直是生物醫學研究與實踐的焦點，盡管隨著醫學診療技術不斷發展和進步，但化療仍然是大多數晚期腫瘤患者的主要治療手段［16］。在化療過程中，使用大劑量具有細胞毒性化療藥物的患者常出現惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和化療性腸粘膜炎等相關的營養不良癥狀［17］。研究表明，氧化應激、凋亡和腸道微生物群失調均參與了CIM的發生和發展［18］。MSCs及其多種衍生物（外泌體、胞外囊泡及活性因子等）在受損組織的愈合和修復過程中發揮積極作用，為其保護正常細胞免受化療引發的組織損傷提供依據。同時，MSCs憑借強大的免疫調節能力，可通過抑制炎癥反應改善正常組織細胞免受細胞毒性藥物的損害，緩解化療引發的毒副作用［19］。而MenSCs可通過無創的方法、周期性地從經血樣本中分離獲得，其表現出良好的增殖能力、低免疫原性和自體移植潛能，有效地促進組織修復，在臨床應用中展示出巨大的應用前景。因此，本研究使用Cis誘導小鼠出現化療性腸黏膜炎癥狀，并經MenSCs移植后，明確MenSCs改善Cis引起的CIM的效果，并進一步分析潛在機制。

現已明確在化療相關性腸黏膜炎的發病機制中，腸道屏障的破壞影響腸通透性和緊密連接功能，可使細菌及其產物進入體循環，促炎因子的表達和炎癥通路的激活均會加重黏膜損傷［20］。而化療藥物具有明確的細胞毒性，殺傷腫瘤細胞的同時也會抑制腸道細胞增殖，并通過誘導腸道細胞凋亡來引起腸道損傷。因此，維持腸道細胞穩態可以有效減輕化療引起的腸道炎癥和損傷。而MSCs已被證實可通過抑制炎癥細胞的增殖及促炎因子的產生發揮其抗炎作用及促再生功能［21］。Lv等［22］研究表明Men-SCs移植可通過減少結腸組織淋巴細胞浸潤和腸道內炎癥反應，顯著改善葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠癥狀和組織形態學變化。近來，Wei等［23］研究顯示MSCs來源的外泌體攜帶的miR-129-5p，可通過靶向ACSL4抑制細胞內脂質過氧化和鐵死亡，從而改善DSS誘導的小鼠腸道內炎癥并修復腸道損傷。此外，本課題組前期研究表明MenSCs可改善受Cis化療影響的卵巢結構和功能，提高了卵巢顆粒細胞的活性，并顯著上調了其抗凋亡能力［24］。與前期結果一致，在本研究中，經MenSCs移植后，可顯著下調小鼠腸道組織中促炎因子IL-1β、IL-6以及促凋亡蛋白Bax的表達，上調抑炎因子IL-10及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，顯著改善Cis誘導小鼠腸道結構及功能。

此外，腸道微生物群在人體健康中發揮重要的代謝功能，并通過刺激免疫系統調節炎癥反應，對于維持與免疫細胞的共生關系至關重要［25］。隨著測序技術不斷發展，腸道菌群與CIM的關系已成為CIM發病機制及治療研究的熱點［26］。研究表明，化療藥物可殺傷腸道內有益菌，導致腸道對有害菌的抵抗力減弱，有害菌大量增殖，破壞腸道菌群平衡，加重腸道黏膜炎癥［27-28］。MSCs移植不僅可通過調節調節性T淋巴細胞-免疫球蛋白A（Tregs-IgA）反應，促進IgA分泌，進而促進腸道菌群的恢復來改善葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎癥狀［19］；而且還可通過調節結腸炎小鼠代謝紊亂，使異常的腸道菌群功能恢復至正常水平［29］。與前期研究結果一致，在本研究中，經MenSCs移植后可改善Cis誘導的小鼠腸道菌群種類，促進腸道有益菌的增加，有利于恢復腸道菌群的平衡，改善腸道炎癥。

綜上，本研究明確了經MenSCs移植可顯著改善Cis誘導小鼠腸道黏膜損傷及炎癥反應，修復腸道免疫屏障，增加有益菌含量，改善化療相關性腸道菌群失調，該結果為臨床使用MSCs改善化療性腸黏膜炎提供了參考資料。