TBX2基因在頭頸鱗癌中甲基化相關的預后分析

昝雨欣，丁 妍

1. 湖北醫藥學院生物醫藥研究院（湖北十堰 442000）

2. 湖北醫藥學院附屬太和醫院生命科學研究所（湖北十堰 442000）

3. 胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室（湖北十堰 442000）

頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）已在頭部和頸部的各個區域檢測到，診斷時存在遠處轉移，這與HNSCC 的高死亡率相關[1]。已有較多研究表明，基因甲基化影響HNSCC 的進展，如通過m7G 修飾的METTL1、m6A 修飾的RBM15及m5C 調控基因會促進或抑制HNSCC 細胞的侵襲、遷移和凋亡[2]。在成熟體細胞組織中，DNA 甲基化一般發生于CpG 雙核苷酸（cg 位點）部位，促甲狀腺激素釋放激素基因cg01009664 位點在健康細胞和口腔鱗狀癌細胞之間的甲基化水平差異最大，但關于HNSCC 其他亞類與cg 位點的研究較少[3]。

TBX2是T-box 家族成員之一，在多種癌癥中過表達。其甲基化與缺血性腦卒中、非小細胞肺癌、橫紋肌肉瘤等有密切聯系，但較少有TBX2基因甲基化和HNSCC 相關性和預后的研究[4]。本文基于數據庫研究闡明HNSCC 中TBX2基因表達與臨床病理參數和預后價值的關聯，進一步探索TBX2的甲基化cg 位點與HNSCC 預后的關系。

1 資料與方法

1.1 數據預處理和差異表達分析

從UCSC Xena 數據庫（http://xena.ucsc.edu/）[5]下載HNSCC 癌癥樣本和正常樣本的mRNA 表達譜、相關臨床數據和甲基化文件（TCGA-HNSC.methylation450.tsv）；采用Perl軟件從HNSCC 的HTSeq 中提取TBX2的mRNA 表達；從基因表達綜合（Gene Expression Omnibus, GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[6]下載GSE 6631、GSE 2379、GSE 83519 相關數據集，與健康對照相比；使用R 軟件ggpubr 包計算HNSCC癌癥樣本和對照樣本的TBX2mRNA的差異表達。

1.2 TBX2在HNSCC中的蛋白表達

人類蛋白質圖譜（Human Protein Atlas,HPA）數據庫（https://www.Proteinatlas.org/）[7]包含有關人體組織和細胞的蛋白質分布信息，在該數據庫輸入目的基因TBX2，選擇HNSCC 下的“單細胞”和“免疫組織化學”板塊。分析TBX2在HNSCC 組織和細胞水平上的蛋白差異表達。

1.3 TBX2在HNSCC中的臨床預后

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[8]是一個交互式門戶網站，用于繪制生存曲線和進行臨床病理差異分析。在網站輸入目的基因TBX2，鏈接窗口下選擇“生存”和“甲基化”板塊，分析HNSCC 患者不同臨床病理因素中TBX2mRNA表達與其預后的相關性。

1.4 TBX2 mRNA的表達和甲基化水平

UALCAN 用于研究HNSCC 中TBX2的啟動子甲基化水平。采用Perl 軟件分析“TCGA-HNSC.methylation450.tsv”文件中TBX2的甲基化水平。采用R 語言plyr 和ggpubr 包繪制甲基化箱線圖；采用R 軟件包dplyr 和ggpubr 分析TBX2DNA 啟動子區域cg 位點的甲基化水平。

1.5 cg位點甲基化水平和TBX2 mRNA表達的存活分析

基于TBX2mRNA 表達和甲基化水平將HNSCC 患者分為高表達組和低表達組。采用R軟件包survminer 和survival 對高表達組和低表達組進行生存分析。

1.6 TBX2單基因富集分析

以MSigDB 數據庫（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）[9]中的c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols.gmt 和c5.go.v7.5.1.symbols.gmt 數據集作為功能基因集，對TBX2進行單基因功能和通路富集（錯誤發現率＜0.05）。

1.7 統計分析

采用R 軟件（v4.1.3）對數據進行分析，采用Kaplan-Meier 分析計算HNSCC 高表達組和低表達組之間的生存差異，Spearman 相關性分析法計算TBX2基因甲基化水平和基因表達之間的關系。基于組間差異的卡方檢驗估計分類變量，采用Kruskal-Wallis 檢驗分析連續變量。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TBX2在HNSCC和正常組織中的表達

TBX2在HNSCC 腫瘤組中mRNA 表達高于對照組（P＜0.001），見圖1-A；通過GEO 數據庫的RNA-seq 數據進一步分析發現，TBX2在腫瘤組中的表達明顯升高（P＜0.05），見圖1-B；通過HPA 數據庫分析發現，TBX2的蛋白表達在腫瘤組中升高，多集中于細胞核（圖1-C），在HNSCC 細胞系中其多表達于RPMI-2650 細胞系（圖1-D）。

圖1 TBX2在HNSCC和正常組織中的表達Figure 1. Expression of TBX2 in HNSCC and normal tissues

2.2 TBX2表達與臨床病理特征的關系

通過Kaplan-Meier 分析評估TBX2表達與患者生存期之間的關系，未發現顯著差異（P=0.53），見圖2-A；在TBX2mRNA 表達水平與HNSCC 患者臨床病理特征進展關系方面，隨著年齡增長，其表達隨之上升（圖2-B）；在臨床分級中，腫瘤組中的1、2、3、4 級TBX2表達均高于對照組（P＜0.001），在臨床分期中，腫瘤組中的1、2、3、4 級TBX2表達均高于對照組（P＜0.05），見圖2-C、圖2-D。

圖2 TBX2的預后和臨床病理特征Figure 2. Prognostic and clinicopathologic characteristics of TBX2

2.3 TBX2在HNSCC中甲基化水平與mRNA表達的相關性

在UALCAN 數據庫中，甲基化分析板塊包含528 份HNSCC 樣品和50 份正常樣品。結果顯示，與正常樣本相比，HNSCC 組織中TBX2基因的甲基化程度較高（P＜0.01），見圖3-A。“TCGA-HNSC.methylation450.tsv”文件共包含580 份樣品，TBX2基因中有22 個甲基化CG 位點（圖3-B）。TBX2甲基化水平與mRNA 呈負相關（r=-0.19，P＜0.001）， 見圖3-C。TBX2六個不同位點（cg11031701、cg19021197、cg27027242、cg12163132、cg10930156、cg02577108）甲基化水平與mRNA 呈顯著負相關（P＜0.05），見圖3-D，與其他位點相關性差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 TBX2基因甲基化水平與mRNA表達的相關性Figure 3. Correlation between methylation level of TBX2 gene and mRNA expression

2.4 TBX2在HNSCC中各甲基化cg位點的預后

TBX2甲基化水平低的cg 位點（cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770、cg05162750、cg10930156）與不良OS相關（圖4-A），TBX2的cg位點（cg13274713、cg04304770、cg02577108、cg21977256、cg26932779、cg27027242、cg10492801、cg22449107）的低甲基化水平與不良PFS 相關（圖4-B），而其他甲基化cg 位點與HNSCC 患者的預后無關。

圖4 TBX2基因甲基化與臨床病理參數的關聯Figure 4. Association of TBX2 gene methylation with clinicopathological parameters

2.5 TBX2通過基因集富集分析進行通路富集

采用基因富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）探究TBX2對HNSCC 主要生物學過程的影響。基因本體（gene ontology, GO）功能富集分析結果顯示，TBX2主要富集于生物過程（biological process, BP）中非編碼RNA3'端加工、小核RNA 代謝過程、翻譯起始等；細胞組成（cellular component, CC）有免疫球蛋白復合物；分子功能（molecular function, MF）有翻譯調節劑活性核酸結合等（圖5-A）。從京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）基因集中富集到通路包括鈣信號通路、黏著斑、黑色素瘤、神經活性配體與受體相互作用、蛋白酶體等（圖5-B）。

圖5 GSEA通路富集Figure 5. Enrichment of GSEA pathways

3 討論

TBX2編碼參與發育過程調控的轉錄因子可作為診斷和預后生物標志物，甚至是新的治療靶點。目前僅有少量研究探索HNSCC 中TBX2表達與臨床病理參數和預后的關系。在喉癌、甲狀腺乳頭狀癌和鼻咽癌中，TBX2的mRNA 表達水平上調，且與淋巴結轉移、分化程度相關，但在HNSCC 中鮮有報道[10]。本研究探討了TBX2在HNSCC 中的表達和甲基化及其臨床病理參數和預后的關系，發現TBX2mRNA 和蛋白表達顯著高于鄰近正常組織，不同TBX2表達水平HNSCC患者的OS 無明顯差異，TBX2基因部分cg 位點甲基化水平與OS 和PFS 顯著相關，TBX2是HNSCC 中重要的診斷和預后生物標志物。

異常的DNA 甲基化已被證實會改變腫瘤微環境，可用于疾病診斷和預后預測。甲基化譜對于鑒定基因的功能狀態至關重要，因其表達依賴于DNA CpG 島的甲基化狀態。根據文獻，某些基因的異常DNA 甲基化可能在HNSCC 病理生理和發展中起著關鍵作用[11]。DNA 甲基化異常可使與細胞增殖相關的基因表達異常，從而導致細胞增殖異常。早期研究表明，同源重組DNA 修復途徑中XRCC3 c.722、Lig4 c.26 和Rad51 c.3429單核苷酸多態性與HNSCC 風險之間顯著相關，而單核苷酸多態性在CG 序列上出現最為頻繁[12]。本研究探討了cg 位點的甲基化水平與預后之間的關聯，結果顯示，與健康對照組相比，HNSCC 中的TBX2表達較高，但甲基化同樣較高。此外，TBX2甲基化水平低的cg 位點（cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770、cg05162750、cg10930156）與不良OS相關，TBX2cg位點（cg13274713、cg04304770、cg02577108、cg21977256、cg26932779、cg27027242、cg10492801、cg22449107）的低甲基化水平與不良PFS 有關， 提示cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770 這4 個位點是未來研究的重點，可能被用作HNSCC 的預后和治療靶點。由于有關TBX2基因的cg 位點研究有限，現僅發現其在高血壓中具有易感性[13]。

為進一步探討TBX2導致腫瘤發生的具體機制，本研究采用GSEA 探究了TBX2對HNSCC 主要生物學過程的影響。GO 富集分析到分子功能翻譯調節劑活性核酸結合。不論是非編碼RNA相關n6-甲基腺苷對免疫球蛋白的識別和3'端加工，還是小核仁RNA 都已被證明通過28'-O-甲基化修飾在癌癥發展中起著關鍵的調節作用，證實基因甲基化及其潛在的cg 位點在腫瘤預后中發揮著潛在作用[14-15]。從KEGG 基因集分析中富集到通路包括鈣信號通路、神經活性配體與受體相互作用、蛋白酶體和細胞外基質。有研究指出蛋白酶體抑制劑硼替佐米治療頭頸癌，TBX2可誘導HAS2基因表達并增加透明質酸沉積，從而重塑腫瘤微環境[16]。早期有研究顯示，原發癌細胞向遠處器官的轉移被認為是由上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）誘導控制的，TBX2可能通過調節EMT 和轉移前生態位的建立，在許多惡性腫瘤的轉移中起著至關重要的作用，TBX2過表達通過EMT 和ERK 信號通路促進胃癌增殖和侵襲，E-鈣黏蛋白增加可抑制細胞入侵[17]。研究表明TBX2抑制明顯增加了E-鈣黏蛋白的表達，并且抑制了體外鼻咽癌細胞的侵入與遷移[10]。生信結果與已有基礎研究結果相互驗證，但TBX2對HNSCC 的生物學過程還需要基礎實驗進一步驗證。

本研究存在一定的局限性，盡管采用了生物信息分析，但缺乏了實際臨床研究，降低了研究的可行性。綜上所述，TBX2表達與HNSCC 患者的腫瘤分級分期有關，但與OS 無關。此外，與正常樣本相比，HNSCC 組織中TBX2基因的甲基化程度較高，TBX2基因中某些cg 位點的低甲基化水平與不良的OS 和PFS 密切相關。整合甲基化和基因表達分析支持TBX2作為HNSCC 中的特異性診斷和預后生物標志物。