氧化與抗氧化作用在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的機(jī)制研究進(jìn)展

馬亞龍，宮玉鎖，李金德，祿成龍，劉曉婷，康付平，陳旭帆，賴宇翔

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院（蘭州 730000）

2. 甘肅省中醫(yī)院創(chuàng)傷骨三科（蘭州 730000）

隨著人們生活水平日益提高，飲食習(xí)慣發(fā)生改變，痛風(fēng)已經(jīng)成為全球最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，男性患病率明顯高于女性，且隨著年齡增長，患病人數(shù)也不斷增多[1]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis, AGA）是痛風(fēng)最常見的發(fā)病類型，主要表現(xiàn)為肢體關(guān)節(jié)在數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)紅腫、疼痛或活動受限等，最常見部位為足部第一跖趾關(guān)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，單鈉尿酸鹽（monosodium urate,MSU）晶體是痛風(fēng)的主要病理因素。由于體內(nèi)尿酸（uric acid, UA）水平的不斷升高和排泄不足，UA 在關(guān)節(jié)周圍沉降、聚集形成MSU 晶體，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）反應(yīng)[2]。在治療AGA 上，西醫(yī)多采用降尿酸類藥物、免疫抑制劑、消炎鎮(zhèn)痛類藥物，中醫(yī)多采用清熱、祛濕、除痹、舒筋活絡(luò)等藥物，這些藥物的治療機(jī)制均涉及抗OS 反應(yīng)。既往研究多探討AGA 的炎癥反應(yīng)，對OS 反應(yīng)研究相對較少，本文對AGA 的OS 反應(yīng)機(jī)制及治療中抗OS 作用機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為臨床醫(yī)師治療AGA 及新藥研發(fā)提供新思路。

1 AGA炎癥反應(yīng)機(jī)制

AGA 的發(fā)作主要是由于機(jī)體UA 水平升高，聚集沉積后形成MSU 晶體，誘發(fā)炎癥反應(yīng)使關(guān)節(jié)或軟組織出現(xiàn)紅腫、疼痛、活動受限等臨床癥狀。UA 是一種弱酸，在生理?xiàng)l件下以去質(zhì)子尿酸陰離子的形式循環(huán)，與鈉離子結(jié)合后形成MSU 晶體。MSU 晶體具有三斜結(jié)構(gòu)，其中堆疊的嘌呤環(huán)片可用顯微鏡觀察到為針狀晶體[3]。

AGA 發(fā)作時，MSU 晶體在機(jī)體內(nèi)可激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及一系列炎性因子，如白介素-1（interleukin-1, IL-1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）、嘌呤受體2（P2X purinoceptor 7, P2X7）等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)完成信號傳導(dǎo)，引發(fā)一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4-5]。MSU 晶體在滑膜中的沉積會觸發(fā)成纖維細(xì)胞（如滑膜細(xì)胞）中活性氧（reactive oxygen species, ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）的釋放，激活炎癥反應(yīng)和OS 反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。已被證實(shí)為炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵因子的白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）是由巨噬細(xì)胞的Nod 樣受體蛋白-3（Nod-like receptor pyrin domain 3, NLRP3）炎癥小體產(chǎn)生，而NLRP3 被線粒體產(chǎn)生的ROS 物種誘導(dǎo)激活。有研究認(rèn)為NLRP3 炎性體的啟動需要兩步過程，MSU 晶體的沉積并不一定導(dǎo)致炎癥，臨床中也存在關(guān)節(jié)中有MSU 晶體而無明顯炎癥的情況，游離脂肪酸和酒精的大量攝入往往也是急性反應(yīng)的重要誘因，同時ROS又可作為炎癥反應(yīng)信號傳導(dǎo)中的第二信使，調(diào)節(jié)其靶基因IL-1β 的表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[7-8]。部分關(guān)節(jié)內(nèi)沉積MSU 晶體的患者會出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為急性痛風(fēng)發(fā)作。當(dāng)MSU 晶體與巨噬細(xì)胞相互作用形成并激活NLRP3 炎性體時，炎癥反應(yīng)開始。該過程由微管驅(qū)動的空間共定位線粒體促進(jìn)，涉及α 微管蛋白的乙酰化過程。由炎癥激活的胱天蛋白酶1 將IL-1β 前體轉(zhuǎn)化為成熟IL-1β，通過激活中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，進(jìn)而釋放大量促炎細(xì)胞因子、趨化因子和其他因子，如ROS、前列腺素E2 和溶酶體酶來擴(kuò)增炎癥反應(yīng)[9]。

MSU 誘導(dǎo)的痛風(fēng)炎癥反應(yīng)是由Nrf2/HO-1 抗氧化信號通路中的特定機(jī)制介導(dǎo)，核因子相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2）及其介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)可穩(wěn)定機(jī)體的OS 狀態(tài)，而MSU 的產(chǎn)生可激活病理性Nrf2 信號，觸發(fā)OS反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)，同時多種來源的ROS 也是NLRP3 介導(dǎo)IL-1β 分泌的關(guān)鍵因素。綜上所述，痛風(fēng)發(fā)作時，炎癥小體與OS 因子可相互作用、相互影響，在發(fā)生炎癥反應(yīng)的同時也發(fā)生OS 反應(yīng)。

2 AGA與OS反應(yīng)

AGA 發(fā)作時，機(jī)體的OS 反應(yīng)同時被激活，該反應(yīng)是由于ROS 的產(chǎn)生與抗氧化機(jī)制間的不平衡導(dǎo)致的[10-11]。ROS 在生理?xiàng)l件下的產(chǎn)生是生命活動所必需的，涉及多種轉(zhuǎn)換機(jī)制，如吞噬細(xì)胞的殺菌活性、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和氧化還原狀態(tài)[12]。氧化轉(zhuǎn)換機(jī)制是由ROS 和促炎細(xì)胞因子共同觸發(fā)，ROS 具有高度化學(xué)反應(yīng)活性，在特定條件及濃度下才能造成損傷，對不同的生物分子均可造成損害，如膜脂的過氧化、線粒體的損傷等，進(jìn)而加重OS 反應(yīng)[13]。AGA 是由于人體嘌呤代謝紊亂、尿酸產(chǎn)生過多、排泄不良導(dǎo)致MSU 結(jié)晶或UA 在細(xì)胞外液形成超飽和狀態(tài)，UA分子沉積在關(guān)節(jié)部位，現(xiàn)代分子生物學(xué)對其分子機(jī)理開展了大量研究。

2.1 UA與OS反應(yīng)

當(dāng)體內(nèi)UA 水平升高時，許多炎癥因子信號被激活，體內(nèi)炎癥因子的釋放和OS 反應(yīng)的發(fā)生加速了AGA 的發(fā)作，UA 的有害作用主要?dú)w因于其觸發(fā)ROS 的形成并激活NLRP3[14]。體外實(shí)驗(yàn)表明，高UA 模型大鼠的脂肪細(xì)胞組織中抗氧化作用降低，而氧化酶的活性提高，加重OS 反應(yīng)[15]。Sautin 等用可溶性UA 培養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS 隨UA 攝取的增加而增加，說明可溶性UA 可刺激成熟脂肪細(xì)胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶活性和ROS 生成增加[16]。可溶性UA 在體內(nèi)刺激NADPH 氧化酶增加其活性，使ROS 增多，進(jìn)而激活絲裂原活化蛋白（mitogen-activated protein, MAP）激酶p38和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK1/2），降低NO 利用度，導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞硝化和脂質(zhì)氧化增加。高UA 可以激活脂肪細(xì)胞氧化還原依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和OS 反應(yīng)，破壞脂肪組織氧化穩(wěn)態(tài)。汪善鋒等對痛風(fēng)患者與健康成人的臨床癥狀資料及OS 因子等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者UA、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）和晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidation protein products,AOPP）明顯升高，而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）明顯降低，說明UA 升高激發(fā)了OS 反應(yīng)[12]。

2.2 線粒體與OS反應(yīng)

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝中心，也是氧化磷酸化的主要場所，可持續(xù)產(chǎn)生ROS。ROS 是由呼吸鏈的電子傳遞鏈復(fù)合物向O2的電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，這被認(rèn)為是線粒體產(chǎn)生ROS 的主要來源[17]。研究表明，OS 可通過線粒體依賴性和非依賴性途徑引起細(xì)胞凋亡[18]。迄今為止，除呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移外，約10 種潛在的線粒體ROS 生成系統(tǒng)也被確認(rèn)為線粒體氧離子和H2O2的來源，其中較常見的兩個系統(tǒng)為α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶，二者均具有氧化作用[19-20]。值得注意的是，線粒體產(chǎn)生大量的H2O2，這與NADPH 的增加有關(guān)，這種升高的氧化劑負(fù)荷會增加線粒體復(fù)合物額外產(chǎn)生ROS，反過來又增加細(xì)胞的OS 反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞死亡[21]。

2.3 氧化酶與OS反應(yīng)

NADPH 氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂氧合酶、環(huán)氧合酶等可以催化其他物質(zhì)，通過花生四烯酸通路和有機(jī)化合物的自氧化反應(yīng)釋放ROS，其中NADPH 氧化酶是ROS 的主要來源之一[22-23]。NADPH 氧化酶在多個細(xì)胞中存在，除吞噬細(xì)胞外，內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等非吞噬細(xì)胞也含有NADPH 氧化酶成分，并可產(chǎn)生氧自由基[24-25]。氧離子（O2-）的主要來源之一是滲入滑膜的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的NADPH氧化酶。O2-作為超氧自由基，可損傷內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，增加微血管的通透性，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向炎癥病灶遷移。O2-也可以轉(zhuǎn)化為其他更具侵略性的ROS，如羥基自由基（HO-），它是O2-與游離鐵或銅離子作用時產(chǎn)生的，也能加重OS 反應(yīng)[25]。體內(nèi)UA 濃度較高時會引起血管內(nèi)皮損害，導(dǎo)致NADPH 氧化酶增多，其產(chǎn)生的超陰離子將加速OS 反應(yīng)，對機(jī)體造成損害[26]。

2.4 纖維滑膜細(xì)胞與OS反應(yīng)

與軟骨細(xì)胞相比， 成纖維滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS） 產(chǎn)生更多的SOD、 谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）。雖然這些細(xì)胞構(gòu)成先天免疫反應(yīng)的一部分，但由于NO-、O2-、OH-、RO-、ROO-、電子不穩(wěn)定分子（如H2O2）、次氯酸、臭氧的增加而觸發(fā)OS 過程[27-28]。Zamudio-Cuevas等采用75 μg/mL 的MSU 晶體刺激人體FLS 并培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)在MSU 晶體刺激下FLS 存活率下降30%，細(xì)胞凋亡率增加42%，且刺激后FLS 顯示H2O2含量增加2.1 倍、O2和NO 水平增加1.5倍，同時MSU 晶體引起FLS 形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增厚和不連續(xù)、形成空泡和錯誤折疊的糖蛋白等[29]。結(jié)果證明，MSU 晶體誘導(dǎo)FLS 釋放ROS 和 RNS 物種，隨后激活OS 反應(yīng)，氧化相關(guān)蛋白質(zhì)，改變細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化狀態(tài)，從而導(dǎo)致FLS 凋亡。

3 抗OS反應(yīng)

3.1 機(jī)體固有的抗OS機(jī)制

由于OS 反應(yīng)對機(jī)體有損害，所以生物體為對抗OS 反應(yīng)開發(fā)一種合適的抗氧化防御系統(tǒng)，以保護(hù)細(xì)胞免受ROS 的有害影響。細(xì)胞的抗氧化機(jī)制，由多種第二相解毒酶組成，如SOD 類、過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷氧還蛋白、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、GPx、過氧化還原蛋白、兩種硫氧還蛋白異構(gòu)體（TRX1 和TRX2）以及非酶谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物等[30]。機(jī)體中天然產(chǎn)物多糖和相關(guān)的倍半萜二醛類似物也正在作為潛在的抗炎藥用于治療中性粒細(xì)胞驅(qū)動的炎癥性疾病，如在MSU 晶體誘導(dǎo)的AGA 小鼠模型中可以抑制中性粒細(xì)胞的浸潤和ROS 的產(chǎn)生[31]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在OS 反應(yīng)末期會產(chǎn)生氧化蛋白AOPP，破壞機(jī)體多種分子，誘發(fā)炎癥，而SOD 是機(jī)體固有的氧自由基清除劑，能夠阻斷脂質(zhì)的OS 反應(yīng)進(jìn)程，促進(jìn)氧自由基的歧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞，且SOD 與AOPP 間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以通過提升SOD 水平抑制OS 反應(yīng)進(jìn)程[17]。UA 僅在親水條件下可作為一種有效的抗氧化劑，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受細(xì)胞外產(chǎn)生的ROS的氧化，但這種環(huán)境條件也是其發(fā)揮抗氧化功能的主要限制[32]。機(jī)體固有的抗氧化反應(yīng)機(jī)制易被干擾，而使其失去抗氧化作用，故在AGA 發(fā)作時由于ROS 的大量產(chǎn)生，線粒體被破壞、AOPP升高、膜脂氧化等過程均被激活，與機(jī)體抗氧化機(jī)制的平衡被打破，所以僅依靠機(jī)體本身進(jìn)行抗氧化、抗炎治療有一定局限性。

3.2 藥物的抗OS機(jī)制

《痛風(fēng)管理指南》指出，AGA 的首選治療藥物是非甾體抗炎藥、皮質(zhì)類固醇和秋水仙堿（colchicine, COL），其藥物作用機(jī)制多涉及抗OS反應(yīng)[1]。最早被用于治療AGA 的COL 具有較好的抗氧化作用，COL 已被證明可以衰減脂質(zhì)過氧化和穩(wěn)定細(xì)胞膜，顯著降低缺血再灌注損傷肌肉組織中丙二醇、TNF-α 和IL-1β 的水平，并提高SOD 活性，抑制OS 反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[33]。王稼農(nóng)等使用不同濃度的COL 飼養(yǎng)斑馬魚，發(fā)現(xiàn)在COL進(jìn)入機(jī)體內(nèi)初期，SOD 活性明顯提升，體內(nèi)的抗氧化機(jī)制被促進(jìn)，但長時間后SOD 活性下降，且COL 對不同內(nèi)臟及器官組織中的SOD 活性提升效果存在顯著差異[34]。近年來長期臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)COL 的副作用較嚴(yán)重，現(xiàn)已被其他藥物替代。

目前臨床中治療AGA 較常用的雙氯芬酸鈉、塞來昔布等藥物也被證實(shí)具有抗OS 作用。Boarescu 等指出，雙氯芬酸鈉可抑制大鼠血清和組織中巨噬細(xì)胞上表達(dá)型一氧化氮合成酶的表達(dá)，減少氮化物的生成，降低大鼠血清和組織的總氧化狀態(tài)水平，提高總抗氧化能力和總硫醇水平，進(jìn)而減少OS 反應(yīng)的發(fā)生[35]。依托考昔的抗氧化原理是對選擇性環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）有抑制作用，而COX-2 通過氧化反應(yīng)可生成前列腺素，并通過脫氫酶等催化形成電羰基衍生物（EFOX），其在COX-2/Nrf2 信號通路中具有重要作用[36]。COX-2與Nrf2 通過EFOX 相互作用，EFOX 可誘導(dǎo)Nrf2分解并抑制環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 的功能，從而激活Nrf2/ARE 內(nèi)源性抗OS 通路[37]。布洛芬在體內(nèi)也可以保護(hù)部分SOD 和CAT 的活性，阻止OS的發(fā)生[38]。ROS 是在AGA 發(fā)作的過程中產(chǎn)生的，因此，抗氧化劑維生素C 對痛風(fēng)發(fā)作具有有利的影響[39]。其他抗氧化分子，如沒食子酸，可抑制成纖維細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-1β 和IL-6 及多種趨化因子的基因表達(dá)，從而抑制機(jī)體OS 反應(yīng)[40]。

生物制劑——尿酸氧化酶（urate oxidase,Uox）類藥物也被應(yīng)用于AGA 的臨床治療，Uox是一種可參與嘌呤分解代謝的酶，能將UA 氧化為尿囊酸排出體外。與多數(shù)動物相比，高等靈長類動物缺乏Uox，人類的進(jìn)化很可能使Uox 基因沉默[41]。自然界中也存在多種能夠分解UA 的氧化酶/嘌呤酶，如黃曲霉來源、微細(xì)菌ZZJ4-1 來源、假絲酵母來源、枯草芽孢桿菌來源等[42]。部分Uox 類藥物半衰期短，可快速緩解AGA 癥狀，但不適用于慢性痛風(fēng)患者，且部分藥物長期使用會產(chǎn)生抗藥性，且由于使用方法均為注射給藥，患者的順應(yīng)性較差[43]。因此，Uox 生物制劑類藥物在給藥方式及免疫原性問題方面有待進(jìn)一步研究。

痛風(fēng)屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，治療多用祛風(fēng)濕、止痹痛類藥物。研究表明，中藥材的許多有效成分同樣具有抗OS 作用，如秦艽提取物可以提高AGA 大鼠組蛋白去乙酰化酶1（SIRT1）和抑癌基因（p53）蛋白乙酰化的表達(dá)，降低miR-34a 和p53 蛋白表達(dá)，激活抗氧化物質(zhì)的活性，減輕OS 對機(jī)體的損傷[44]。黃柏的有效成分提取物，如醇類提取物、水類提取物均具有抗OS 作用，但醇類提取物中酚類和類黃酮物質(zhì)濃度更高，類黃酮物質(zhì)可以清除體內(nèi)的氧自由基，抗OS 效果更好[45]。槲皮素、木瓜提取物等通過提高機(jī)體內(nèi)部SOD 水平發(fā)揮抗氧化劑的作用，降低炎癥介質(zhì)（IL-1β 和NO）的水平來抑制AGA 大鼠模型的炎癥[46-47]。白藜蘆醇也具有抗OS、抗炎的作用，其主要通過抑制MSU 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號通路，提高巨噬細(xì)胞抗氧化能力，提高機(jī)體SOD 水平，減少ROS 的激活，發(fā)揮抗OS 作用[48]。此外，中成藥也能阻止機(jī)體OS 反應(yīng)的發(fā)生，如痛風(fēng)康寧方、資生腎氣丸等均可緩解機(jī)體OS 反應(yīng)，減輕關(guān)節(jié)等組織的損傷[49-50]。

4 小結(jié)

通過AGA 的分子、細(xì)胞和病理生理機(jī)制，可以證實(shí)OS 反應(yīng)對AGA 急性發(fā)作有重要影響。AGA 的高尿酸狀態(tài)及其形成的MSU 晶體不僅可以激活炎癥小體誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)，也可破壞線粒體、滑膜細(xì)胞等激活OS 因子從而誘發(fā)OS 反應(yīng)。發(fā)生OS 反應(yīng)的關(guān)鍵因素ROS 也可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，使兩種反應(yīng)相互影響、相互催化，不斷加重AGA患者病情，因此探究抑制ROS 生成與增強(qiáng)抗OS作用對AGA 的治療至關(guān)重要。

線粒體正常條件下持續(xù)產(chǎn)生的ROS 機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)生理和病理?xiàng)l件產(chǎn)生的ROS 相關(guān)，但線粒體病理性ROS 的具體產(chǎn)生位點(diǎn)及其在原位和體內(nèi)的運(yùn)作機(jī)制尚未明確，該機(jī)制可在抑制OS 反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，為AGA 分子治療提供新的方向。同時，在通過抗OS 反應(yīng)治療AGA 時，中藥、西藥及生物制劑對OS 過程均有一定的阻斷或緩解作用，其中大多通過調(diào)節(jié)抗氧化信號通路提高抗氧化酶活性。SOD 是機(jī)體抗氧化的第一道防線，其屬于Nrf2 內(nèi)源性抗氧化通路的下游酶，可通過降低ROS 水平抑制OS 反應(yīng)進(jìn)程。但在與OS 相關(guān)的信號通路中其他抗氧化酶發(fā)掘較少，因此對該通路上游、中游的其他相關(guān)因子進(jìn)行發(fā)掘及運(yùn)用可在早期發(fā)揮更好的抗氧化作用。其次，在與AGA 相關(guān)炎性因子研究中，可拓展其與ROS 的聯(lián)系，通過緩解炎癥反應(yīng)從而減輕OS 反應(yīng)。不同階段的抗氧化因子都可能闡明抗氧化劑在開發(fā)新的治療靶點(diǎn)中的潛在作用，這些靶點(diǎn)旨在阻斷或緩解參與局部和全身性關(guān)節(jié)損傷的OS 反應(yīng)途徑，并為AGA 患者提供新的治療方法。