基于高通量測序的營養(yǎng)不良兒童腸道菌群多樣性研究

吳慧丹 黃崢 陽麗君 江美花 李揚帆 梅桂斌

營養(yǎng)不足是當各種營養(yǎng)素由于攝食過度或攝入量不夠或消化吸收障礙等各種因素引起產(chǎn)生的某種營養(yǎng)素失調(diào)癥狀［1］。營養(yǎng)不足是一種全球性的普遍性問題,在歐盟和美洲等發(fā)達國家以超重為主, 非洲及東南亞等發(fā)達國家以身材矮小及生長發(fā)育遲緩為主, 而南亞和東非等區(qū)域主要為出現(xiàn)5 歲內(nèi)的低體重兒, 其中有多達33%的兒童發(fā)生營養(yǎng)素不足和腸道的通透性顯著提高, 出現(xiàn)腹瀉及吸收障礙等一系列問題, 導致兒童的生長發(fā)育減緩［2］。就目前來說, 營養(yǎng)素干預及相應的飲食調(diào)整方法無法切實可行的治療營養(yǎng)不良對身體正常生長、發(fā)育產(chǎn)生阻礙作用, 提升疾病發(fā)生幾率。近期研究成果表明, 微生物群落作為人類第二基因組, 在很多層面影響了人類健康水平［3］。以腸道菌群為例,其共生在腸道中, 能夠提取食物中的營養(yǎng)物質(zhì), 增強食物消化和吸收能力, 尤其對腸道功能尚不健全的兒童來說, 腸道菌群的完整性和豐富性, 對其生長發(fā)育有著最為直接的影響。結合以往經(jīng)驗, 人體內(nèi)的腸道菌群結構組成和數(shù)量分布總體上處于動態(tài)平衡的狀態(tài), 如果倡導微生態(tài)的平衡出現(xiàn)一定程度的紊亂, 出現(xiàn)菌群失調(diào)等問題, 對人體腸道運動能力、營養(yǎng)吸收能力和能量換化能力產(chǎn)生消極影響［4］。本文就主要使用高通量測序方法和模式, 對比研究營養(yǎng)不良患兒和正常兒童中腸道菌群物種的多樣性及差異情況, 分析兒童營養(yǎng)不良和腸道微生物群落的具體聯(lián)系性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選擇2022 年1～6 月在本院門診就診中出現(xiàn)營養(yǎng)不良的患兒共20 例作為A 組, 其中男8 例, 女12 例。納入標準：由于喂養(yǎng)不當、飲食搭配不合理等原因出現(xiàn)營養(yǎng)不良的情況, 如挑食、偏食及沒有科學的喂食方法等；排除標準：近半年出現(xiàn)傳染性腹瀉及抗生素應用。選取20 例健康兒童視為B 組,其中男9 例, 女11 例。

1.2 診斷標準 按照國際通用標準判定兒童營養(yǎng)不足有關情況, 并在此基礎上開展有效估測和預算。

①根據(jù)患兒體重判定。根據(jù)同年齡段孩子的體重標準作為參考, 如果較正常體重低15%～25%之間, 屬于輕度營養(yǎng)不良；較正常體重低26%～40%則為中度營養(yǎng)不良；較正常體重低40%以上為重度營養(yǎng)不良［5］。②根據(jù)皮下脂肪厚度情況判定：腹壁皮下脂肪厚度為0.4～0.8 cm為輕度營養(yǎng)不良, 腹壁皮下脂肪厚度<0.4 cm為中度營養(yǎng)不良, 全身皮下脂肪幾乎消失為重度營養(yǎng)不良［6］。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 研究過程中嚴格按照規(guī)定的采樣流程, 使用采集盒開展采集工作。為防范樣本污染情況,采集環(huán)節(jié)應當科學運用采集勺, 采集重量為5 g 左右的糞便, 并放入到具有保存液的保存管中, 并馬上轉入到-80℃的環(huán)境保存［7］。

1.3.2 DNA 的提取和測序 采集和使用QLAAMP 試劑盒進行糞便樣本的抽取提煉, 使用濃度為12%的瓊脂凝膠進行抽取, 得到基因組的DNA, 通過PCR 的模式實現(xiàn)文檔構建, 利用525 和926 引物進行擴增, 之后使用相關檢測平臺, 將接頭、測序引物和其他標簽列加入到兩端位置, 使用美國AXYGEN 公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒進行回收, 使用實時熒光定量PCR 儀FTC-3000 技術進行熒光的定量分析, 在均一化混合完成后通過文庫進行構建研究, 使用ILLUMIAN 進行文庫的測序。

1.3.3 稀釋性曲線 對研究過程中獲得的系列數(shù)據(jù),借助TRIMMOMATIC 軟件對低質(zhì)量序列進行去除, 對去除后的序列使用FLASH 軟件開展序列的二次拼接,在此基礎上, 借助MOTHUR 對序列開展質(zhì)量控制, 從而獲得最優(yōu)化的序列［8］。從實際效果來看, MOTHUR軟件對數(shù)據(jù)的處理可以有效排除冗余數(shù)據(jù)、干擾數(shù)據(jù)的影響, 形成最具代表性的OTU 稀釋性曲線, 以更加真實地反映出質(zhì)量系列變化情況, 最大程度地保證測序數(shù)據(jù)的豐富程度, 為后續(xù)研究工作高質(zhì)量開展提供便利［9］。如果曲線最終達到平穩(wěn)后表明測序科學合理,對優(yōu)化的序列通過97%的相似性進行對比分析, 并進行相應的信息標注處理。

1.3.4 多樣性分析 本研究借助MOTHUR 軟件, 對ALOHA 開展多樣性分析和計算, 從最終研究獲得的ALPHA 指標中, 評估分析CHAO 和ACE 的指數(shù)變化情況［10］。結合過往經(jīng)驗, CHAO 和ACE 指數(shù)越大, 表明SIMPSON 實際數(shù)值越小, 檢測樣本中的微生物種類越多、類型越豐富。使用R 語言進行分析, 箱線圖實現(xiàn)展示樣品組中存在的多樣化分布, 實現(xiàn)數(shù)據(jù)的分布情況, 具體差異使用P 值進行表示, 箱體中也就證明該組數(shù)據(jù)中50%的分布區(qū)間和中間線都確定為中位數(shù),如果范圍<1.5 箱體則為最大值或最小值［11］。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2、q、w 檢驗或Fisher 確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組基本情況比較 兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較［n, ±s, n(%)］

表1 兩組一般資料比較［n, ±s, n(%)］

注：兩組比較, P>0.05

組別 例數(shù) 性別 平均月齡(個月) 剖宮產(chǎn) 早產(chǎn)兒 母乳喂養(yǎng)男女A 組 20 8 12 18±15 4(20) 3(15) 4(20)B 組 20 9 11 22±12 2(10) 2(10) 2(10)χ2/t 0.102 0.931 0.784 0.229 0.784 P 0.749 0.358 0.376 0.633 0.376

2.2 兩組物種豐度及生物多樣性分析 兩組糞便中共得到1394074個有效序列, 優(yōu)化序列數(shù)量為1268032個,平均長度410。通過對上述序列分析, 實現(xiàn)序列數(shù)當代表的OTU 進行稀釋性的結構曲線分析, 可見大部分樣本呈平坦趨勢達到飽和, 但部分樣本曲線沒有達到平坦, 證明兩組微生物種類都較為豐度。通過箱線圖像進行顯示, 兩組生物多樣性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。證明兩組腸道菌群的豐度和均勻度無顯著差異。見圖1。

圖1 OTU 水平系數(shù)曲線和Shannon 指數(shù)圖

2.3 兩組腸道菌群物種分析 兩組樣本中共發(fā)現(xiàn)微生物154 種。A 組腸道菌群的OTU 為320, B 組大腸產(chǎn)甲烷菌群的OTU 為348, 以及其共同OTU 為290, 兩組腸細菌群門的細菌中共檢出14 個。為更好地展現(xiàn)檢測結果, 本研究依托柱狀圖優(yōu)勢, 將各個樣品進行分類學層面的比較和研究。A 組硬壁菌門(Firmicutes)及未分級菌(乳酸菌)的OTU 少于B 組, 擬桿菌(Bacteroidetes)(多形狀桿菌、羅斯菌)的OTU 多于B 組, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組屬水平腸道菌群OTU 比較

2.4 兩組屬水平腸道菌群比較 除A 組含有的菌群外, B 組還獨有厭氧弧菌屬、厭氧螺菌屬等19 種, 遠超A 組體內(nèi)的菌群種類和豐度。兩組體內(nèi)多形桿狀菌、隱秘桿菌屬等5 種菌群豐度相同, 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 其他菌群豐度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組屬水平腸道菌群比較(n, %)

2.5 聚類分析 通過研究不同樣本OTU(97%相似性)組成反映樣本之間的差別與距離, 主成分分析(PCA)通過方差分析, 將各組樣本差別表示在二維坐標圖上, 坐標軸為可以最大地表示方數(shù)差的兩個特征值,如樣品成分越是接近, 反映到PCA 曲線上的時間越近［12］。不同條件中的樣品可以顯示出離散與集中的分布關系［13］。對兩個樣品的主要組分進行PCA 研究, 根據(jù)樣品聚集現(xiàn)象, 兩組盡管高度接近, 但仍可發(fā)現(xiàn)兩組聚集。根據(jù)《國民營養(yǎng)計劃(2017-2030 年)》等相關政策文件, 為最大程度地保障人體生命健康, 在生命開始最早的100 d 就應當開展保健活動, 通過營養(yǎng)充分供給, 穩(wěn)步增強孕婦、嬰幼兒的營養(yǎng)供給水平?！吧缙?000 d”是指280 d胎期, 在嬰兒出生后2周歲(720 d)。這1000 d 是新生兒神經(jīng)系統(tǒng)等人體組織的關鍵發(fā)育期,也是腸道菌群形成的關鍵時期。這一時期的腸道菌群極易受到營養(yǎng)狀況、病情變化等因素影響［14,15］。為更好地應對上述問題, 需要加強身體健康狀況監(jiān)測, 一旦發(fā)現(xiàn)問題要及時進行應急處理, 使得腸道菌群活性、豐度達到預期, 更好地服務于嬰幼兒生長發(fā)育［16］。

從本次研究過程中獲得數(shù)據(jù)來看, 借助高通量的16S rDNA 測序技術, 對腸道菌群進行系統(tǒng)分析, 開展多樣性研究, 能夠準確發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)不足兒童和營養(yǎng)正常兒童體內(nèi)腸道菌群狀況, 為后續(xù)研究活動有序開展提供數(shù)據(jù)支持［17］。本研究中, 在門水平上, A 組含有較多的擬球菌, B 組含有較多硬壁菌門；在屬水平上,兩組24 個菌株比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 其中A 組特有菌8 種, B 組特有菌21 種。人體小腸中生存著數(shù)量龐大的細菌群體, 協(xié)助人類消化、吸收、分解各類營養(yǎng)物質(zhì)。將正常小鼠的腸道細菌組遷移到無菌敷料小鼠受體中, 在相同食物供應條件下, 可以增加后者體脂的濃度, 說明改善宿主的小腸微生物細菌群組成和豐富程度, 可以改善飲食中養(yǎng)分的使用率, 進而實現(xiàn)增加營養(yǎng)物質(zhì)的目的。據(jù)資料顯示, 與消瘦人群相比, 肥胖人群的腸菌群硬壁菌較多, 擬桿菌更多。孟加拉國的一個營養(yǎng)不足兒童腸道菌群調(diào)查表明, 硬壁菌在正常兒童腸內(nèi)的濃度約為營養(yǎng)不足兒童的9.6 倍, 這一結果與本研究中正常兒童腸道硬壁菌濃度約為營養(yǎng)不足兒童的1.4 倍一致, 并考慮可能與硬壁菌促進熱卡和各種營養(yǎng)元素消化吸收的作用密切相關。因此, 對營養(yǎng)不良兒童的治療, 可以通過提高硬壁菌的比例達到提高熱卡吸收, 提高體重的目的［18］。多形桿狀菌是人類消化道內(nèi)種類最大的細菌類群之一, 主要功能是使較大分子的糖類先經(jīng)過一系列生化過程, 再溶解為一些較易消化的小分子糖類, 還能夠?qū)劝彼猁}的分解代謝。谷氨酸也是蛋白質(zhì)和肽類的主要組成氨基酸,谷氨酸含量很豐富, 既可以提高肌肉蛋白質(zhì)的生成和降低脂肪酸氧化, 也可以增加肌肉積累, 從而提高身體增長速度［19］。超重人員中谷氨酸的含量顯然超過一般體重人員, 且其含量還和多形擬桿菌數(shù)量成反比, 將多形擬桿菌定植到動物腸道中, 小鼠血清中谷氨酸含量減少, 可以加快脂肪酸氧化過程和肌肉溶解的進程,進而減少脂肪積累, 起到減輕體重的作用。本研究中,A 組大腸菌群中的多形桿狀菌濃度為48.87%, B 組為37.74%, 前者明顯高于后者, 可見營養(yǎng)不良兒童由于多形桿狀菌的硬性, 其體脂濃度下降明顯。有必要對營養(yǎng)不良兒童體內(nèi)谷氨酸和多形桿狀細菌之間的相互關系進行論證。2 型糖尿病患者腸道內(nèi)的羅斯菌豐度明顯低于身體健康的兒童, 大致可以判定羅斯菌對血糖有著一定的調(diào)節(jié)能力。相關研究人員將羅斯菌作為飼料, 用于飼養(yǎng)超重實驗鼠, 將其同正常飼養(yǎng)的超重實驗鼠進行橫向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn), 使用羅斯菌飼養(yǎng)的實驗鼠體體重下降明顯, 血糖恢復正常狀態(tài)。研究過程中, 腸道內(nèi)羅斯菌的增多會影響碳水化合物的合成, 使得體脂控制效果不佳。

本次研究發(fā)現(xiàn), A 組腸道內(nèi)的韋榮球菌豐度明顯低于B 組, 這類菌群在人體內(nèi)深度參與碳水合成物的分解、發(fā)酵等過程, 并促進維生素B 產(chǎn)生。維生素B對膽堿酯酶的活力有著較強的抑制能力, 在維生素B缺乏時, 膽堿酯酶活力增加, 引起神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿大量破壞, 使自主神經(jīng)傳遞受限, 導致胃腸道平滑肌舒張運動降低, 各類消化系統(tǒng)吸引酶生成下降, 胃口下降、消化不良等現(xiàn)象, 增加對營養(yǎng)素不足的影響。本研究中,A 組小腸微生物菌群中韋榮球菌膽固醇含量低于B 組,表明營養(yǎng)不足兒童小腸菌組中韋榮球菌屬膽固醇含量比健康兒童少［20］。該菌主要參與小腸內(nèi)碳水化合物分解和發(fā)酵過程, 也可以作為維生素B 的生物合成；維生素B 則對膽堿酯酶活力有抑制作用, 缺少維生素B則增加膽堿酯酶活力, 進而引起自主神經(jīng)遞質(zhì)中乙酰膽堿的分解, 使自主神經(jīng)信息傳遞受限, 導致胃腸不隨意肌運動能力降低, 以及各種營養(yǎng)酶的產(chǎn)生量下降, 食欲減退、消化不良等現(xiàn)象, 從而增加營養(yǎng)不足的危害。

3 討論

本研究中A 組腸菌群的韋榮球菌豐度低于B 組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 考慮可能與樣本數(shù)量低有關, 但仍有深入探討的價值。高通量16S rDNA 的主要優(yōu)點在于為研究生物組織多樣性和研究生命系統(tǒng)發(fā)育分類信息學資源, 主成分PCA 研究結果顯示A 組與B 組盡管距離較接近, 但仍可發(fā)現(xiàn)兩組聚集, 表明兩組間在物質(zhì)結構方面仍存在著相當?shù)牟町? 具有進一步深入研究探索的重要意義。但對16S rDNA 的基因組研究, 對推斷生物的結構仍具有一定局限性。因為對腸道菌群的功能串擾及對數(shù)據(jù)的冗余處理, 僅通過測定產(chǎn)甲烷菌的膽固醇含量就很難合理、精確地推測其生理機制, 因此目前尚無法確定與營養(yǎng)不足患兒的相關致病微生物。本研究方法不足就是對缺乏兒童疾病機理的研究, 為進一步認識營養(yǎng)不足兒童腸道產(chǎn)甲烷菌與疾病之間的相互關聯(lián)和發(fā)生機理, 本研究進一步對兒童腸道細菌中的基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組成等方面進行相應的研究和探索。系統(tǒng)化分析兒童腸道內(nèi)甲烷菌與食物消化、人體代謝、免疫作用發(fā)揮等方面的作用, 更加明確關鍵性菌群在營養(yǎng)不良患兒治療中的作用和意義。結合過往經(jīng)驗, 對營養(yǎng)不良患兒整個治療過程中可以采取菌群治療方案, 通過采取有效舉措,平衡菌群關系, 在體內(nèi)形成良好的微生物環(huán)境。

本次研究選擇2022 年1～6 月在本院兒童營養(yǎng)門診的20 例營養(yǎng)不良患兒作為A 組, 選擇20 例身體正常的兒童作為B 組, 采集分析糞便樣本, 提取細菌中的RDNA, 通過兩組PCR 的模式和方法, 增加V4～V5區(qū)域?qū)崿F(xiàn)高通量的測序設計, 且進行生物信息學的分析研究, 構建相應的稀釋曲線, 使用MOTHUR 軟件實現(xiàn)APLHA 的多樣化的計算分析, 通過R 語言實現(xiàn)HEATMAP 分析研究, 實現(xiàn)典型關聯(lián)分析CCA, 之后分別在樣本的門和屬兩個列表中實現(xiàn)數(shù)據(jù)的整合和歸納,進行統(tǒng)計分析。兩組年齡、性別、分娩方式等一般資料比較, 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組腸道菌群的豐度和均勻度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組腸道菌群共檢測到14 種, 但A 組硬壁菌門和未分級菌的OTU 明顯低于B 組, 且擬桿菌中的OTU 數(shù)量超過B 組, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組腸道菌群共檢測出154 種微生物, 具體分析后發(fā)現(xiàn), 乳酸菌、羅斯菌等24 個菌群的OTU 差異明顯, 其中A 組桿狀菌和羅斯菌的OTU 超過B 組, 乳酸菌OTU 低于B 組。兩組樣本成分進行PCA 分析, 根據(jù)具體樣本聚合情況, 兩組雖然較為接近, 但也具有差異。出現(xiàn)營養(yǎng)不良的兒童腸道菌群中硬壁菌的數(shù)量較低, 其中多形桿狀菌和羅斯菌的含量較高, 為保證菌群的穩(wěn)定和平衡, 需要利用不同菌屬的實際特點進行菌落的調(diào)整, 保證兒童具有良好的吸收和體格發(fā)育。

腸道菌群深刻地關系著宿主的營養(yǎng)加工、能量平衡、免疫活動、胃腸道發(fā)育和其他許多關鍵的生命行為。人體腸道菌群的形成在嬰幼兒階段就開始進行訓練, 和健康青少年一樣, 嬰幼兒的消化道內(nèi)微生物菌群形成方式截然不同, 嬰幼兒消化道菌群定植和成長都是系統(tǒng)的動態(tài)變化, 因此消化道菌群對嬰幼兒生長發(fā)育和免疫形成很重要, 嬰幼兒時期消化道菌群失衡除患正常的代謝類疾病外, 也可罹患一些細菌類疾病, 如流感、肺炎等。研究證實, 在嬰幼兒階段, 營養(yǎng)素的正常攝入量對保證腸道產(chǎn)甲烷菌的生長平衡有重要影響, 而礦物質(zhì)(如鈣、鐵、鎂、鋅)的正常營養(yǎng)利用率則對宿主腸道產(chǎn)甲烷菌的形成起重要作用, 腸道產(chǎn)甲烷菌與維生素代謝相互作用, 提高了機體的身心健康度。而營養(yǎng)包是促進中國貧困地區(qū)6～24 月齡嬰幼兒健康成長重要的營養(yǎng)補充品, 含有蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)素, 因此本文將運用高通量測序方法研究營養(yǎng)包對嬰幼兒階段腸道產(chǎn)甲烷菌的作用。

腸道菌群多樣性指腸道中的一些微生物, 如腸道中有乳酸桿菌、雙歧桿菌等, 這些微生物都能夠促進腸道的蠕動, 能夠防止出現(xiàn)便秘的情況。這些益生菌還能增強抵抗能力, 出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)后, 患者可能會出現(xiàn)腹瀉及便秘情況, 對患者身體造成的影響是較大的。因此, 平時一定要做好相關防護措施與調(diào)整, 防止出現(xiàn)腸道疾病?；忌夏c道疾病后應當及時采取對癥治療, 才有助于病情控制。對人體腸道中具有數(shù)以億計大量的共生菌群, 其自身的種類數(shù)量較多, 可以達到上千種, 且自身數(shù)量甚至達到人體細胞總量的10 倍以上,至今為止, 科學發(fā)展至今還有超過80%的微生物沒有檢測到, 對此類腸道微生物其自身和人體存在互利共生的情況和關系, 可以維持和保證人體健康的發(fā)展具有積極作用, 腸道菌群在腸道中一直保證這動態(tài)化的平衡, 可以實現(xiàn)微生物的合成, 幫助人體更好地吸收營養(yǎng)情況, 維持腸道免疫功能得到更好的維持, 可以抵抗有害微生物的具體侵害問題, 對此類平衡也會因為一部分因素導致動態(tài)平衡紊亂, 進而可能出現(xiàn)肥胖與和腸炎等一系列疾病, 為可以更好地強化和加深人類疾病的發(fā)生原因和藥理學認知, 自從人類基因組計劃后,科學化開始了大量的原基因組計劃體系, 讓腸道菌群研究取得更好的發(fā)展。在傳統(tǒng)腸道微生物群落多樣性研究的過程中, 科學家主要使用DGGE 之類的分子生物法實現(xiàn)對腸道菌群的研究分析, 但對此類的方法其自身都存在一定缺陷, 如DGGE 只能簡單地檢測環(huán)境樣品中存在的10 多種優(yōu)勢菌群, 但對弱勢的微生物檢測不夠精確, 且電泳條帶中存在著多種16DNA 的排列序列。為更好地了解到具體菌種的詳細信息還需要進行克隆檢測、實驗室實驗等多種方法, 且隨著科學技術的不斷提高, 對微生物檢測的精準性要求不斷提高,無法實現(xiàn)對微生物豐度的檢測。但生物芯片其自身可以實現(xiàn)通過固定的探針得到微生物的多樣性信息, 通過信號的情況了解到微生物的豐度, 但準確性依然不足, 高通量測序技術最早發(fā)布于2005 年, 具有穩(wěn)定性強、檢測率高等一系列優(yōu)勢, 當下被大量使用在腸道菌群的檢測中, 學術界中大量學者開展了詳細的研究,其中大部分研究結果都是在國際頂尖雜志刊登, 是當下進行微生物多樣性研究最好的科學方法。