金花茶花對2型糖尿病小鼠的降糖及抗氧化作用

劉芬芬，蒲首丞，趙雯靚，王怡婷，薛 琛，徐麗珊,2,*

（1.浙江師范大學生命科學學院，浙江 金華 321004；2.浙江省特色經濟植物生物技術研究重點實驗室，浙江 金華 321004）

近年來，隨著人們生活方式、飲食習慣的變化，糖尿病的患病率迅速上升，已成為世界上最常見的疾病之一[1]。糖尿病患者表現出“三多一少”的典型癥狀，且常存在肝病、腎病等并發癥，生活質量受到嚴重影響[2]。目前，我國糖尿病面臨高患病率、低知曉率、低控制率、高花費的嚴峻現狀[3]，對糖尿病防治十分緊迫。流行病學研究結果表明，長期攝入富含植物活性成分的食物，如咖啡、茶和漿果等，有利于維持血糖平衡。我國天然產物資源豐富，許多植物因其安全無毒、來源廣、生物活性高而成為研究熱點。因此，評價藥食兩用植物的降血糖功效對糖尿病的預防和治療具有重要意義。

金花茶（Camellia nitidiss ima）屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是國家一級保護植物，于2010年被國家衛健委列為新資源食品，現已在多地引種成功。研究表明金花茶含有豐富的活性成分，以多酚、多糖、皂苷和黃酮類為主[4]，且相較于葉，花中含有更多的黃酮、多酚、皂苷[5]，這些植物活性成分具有顯著的抗氧化[6]、降血脂[7]、降血糖[8]、抗腫瘤[9]、增強免疫力[10]、抗衰老[11]等藥理功效。目前研究多集中于金花茶的葉，而對金花茶花的降血糖及抗氧化功效鮮有研究。

本研究以防城普通金花茶的花為研究對象，分析其各成分含量與生物活性，并利用高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用法進行組分鑒定；同時，建立2型糖尿病小鼠模型，考察金花茶花對2型糖尿病小鼠血糖、血脂、氧化應激等水平的影響。本研究旨為金花茶花的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性ICR小鼠，體質量（20±2）g，購自浙江省醫學科學院，使用許可證號：SYXK（浙）2019-0002。

防城普通金花茶花由浙江仁德堂金花茶有限公司金華金花茶基地提供。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）美國Sigma公司；阿卡波糖 德國Bayer公司；胰島素、血脂、糖代謝、氧化應激、原位末端標記染色（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）細胞凋亡原位檢測試劑盒南京建成生物工程研究所；其他化學試劑均購自于國藥集團。

1.2 儀器與設備

Rotavapor R-300旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；組織勻漿機 美國Pro Scientific公司；Go全波長酶標儀美國Thermo Multiskan公司；NE910科研級正置生物顯微鏡 美國Nexcope公司；5427R高速冷凍離心機德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 金花茶花水提物（aqueous extract ofCamellia nitidissimaflower，CFA）的制備

將新鮮金花茶花于100 ℃殺青5 min后60 ℃干燥至恒質量，粉碎備用。金花茶花粉末以1∶20（g/mL）料液比加入去離子水，于70 ℃水浴加熱浸提1.5 h，抽濾，濾液濃縮、60 ℃真空干燥至恒質量，得到CFA。

1.3.2 CFA中各成分含量及自由基清除活性的測定

多酚、多糖、氨基酸、蛋白質含量測定參照文獻[12]。采用Xu Ping等[13]方法測定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除活性。

1.3.3 HPLC-MS分析

CFA溶于甲醇溶液中，配制成1 mg/mL的溶液，經微孔濾膜過濾于色譜瓶中，參考莫潤宏等[14]的方法，稍作修改進行測定。色譜條件：色譜柱：Ultimate?XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：純乙腈；流動相B：體積分數為2%的甲酸溶液；流速：1.0 mL/min，柱溫：35 ℃；紫外檢測器檢測波長為320 nm。梯度洗脫程序：0～10 min，0%～13% A、100%～87% B；13～25 min，13%～20% A、87%～80% B；25～30 min，20%～23% A、80%～77% B；30～40 min，23%～40% A、77%～60% B。正離子模式下運行電噴霧電離子源，質譜條件：離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣體：氮氣，流速：8.00 mL/min，毛細管電壓：2.5 kV，掃描范圍m/z：100～3000。

1.3.4 動物造模與分組干預

動物實驗符合浙江師范大學實驗動物福利倫理審查要求，受理編號：ZSDW2022011。小鼠適應性飼養1 周后，根據體質量隨機分為空白組（N組）（n＝10）和造模組（n＝100），N組以基礎飼料飼養。造模組小鼠以高糖高脂飼料連續誘導21 d，禁食不禁水12 h，腹腔注射125 mg/kgmbSTZ的檸檬酸緩沖溶液誘導糖尿病。注射后第3天、第7天尾靜脈取血，血糖儀測定空腹血糖值（fasting blood glucose，FBG），若兩次FBG均≥11.1 mmol/L，則視為造模成功[15]。造模成功的小鼠根據FBG隨機分為5 組：模型組（M組），陽性組（P組），CFA低、中、高劑量組（LCFA組、MCFA組、HCFA組），每組10 只，分別按25 mL/kgmb去離子水、20 mg/kgmb阿卡波糖、200 mg/kgmbCFA、400 mg/kgmbCFA和800 mg/kgmbCFA灌胃干預5 周；N組以25 mL/kgmb去離子水灌胃干預5 周。

1.3.5 一般指標觀察

灌胃干預期間，每周稱量并記錄各組小鼠進食情況、飲水情況、排尿情況及空腹體質量。

1.3.6 血糖指標測定

灌胃期間第7、14、21、28、35天禁食12 h后剪尾靜脈取血測量FBG，并于次日進食2 h后測量餐后血糖（postprandial blood glucose，PBG）。

1.3.7 血清胰島素及血脂指標的測定

末次灌胃后對各實驗組小鼠眼眶取血，制備血清，根據試劑盒操作流程測定血清空腹胰島素（fasting insulin，FINS）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量。根據FINS和FBG計算穩態型胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）（HOMA-IR＝FBG×FINS/22.5）。

1.3.8 胰臟、肝臟氧化應激途徑相關指標的測定

取血后小鼠立即脊椎脫臼處死，置于冰袋上迅速取出胰臟、肝臟，低溫磨碎后加入質量分數0.9%生理鹽水制得勻漿，根據試劑盒操作流程，完成總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定，結果以蛋白質量計。

1.3.9 胰臟、肝臟病理切片制作及觀察

取部分胰臟、肝臟于體積分數4%的多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察組織結構，根據試劑盒操作流程完成TUNEL細胞凋亡原位檢測，并計算細胞凋亡率。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 CFA主要成分含量及生物活性

與人參[16]、青錢柳[17]、金花茶葉[12]相比，金花茶花具有較高的多酚、多糖含量和清除DPPH自由基、抑制α-葡萄糖苷酶能力（表1）。表明金花茶花富含活性成分，且具有很好的體外抗氧化和降血糖作用。

表1 CFA主要成分含量及生物活性Table 1 Major component contents and biological activity of CFA

2.2 HPLC-MS分析

利用HPLC-MS技術對CFA進行成分分析，根據HPLCMS和MS圖譜，參考相關文獻，對其主要成分進行結構鑒定，其HPLC圖譜見圖1，質譜數據見表2。共檢測到7 種主要成分，成分1質譜數據為分子離子峰m/z值595.1659，與張維冰等[18]鑒定木犀草素-7-O-蕓香糖苷HPLC-MS結果相同，推定為木犀草素-7-O-蕓香糖苷；成分2分子離子峰m/z值291.0867，結合文獻[19]，推斷該化合物為表兒茶素；成分3質譜數據為分子離子峰m/z值565.1558，可推斷其相對分子質量為564，結合文獻[20]，成分3為芹菜素-6-C-戊糖-8-C-己糖苷；成分4分子離子峰m/z值611.1606，成分5分子離子峰m/z值465.1031，成分6m/z為465.1031，波譜數據與文獻[21]的報道基本一致，故鑒定化合物4為槲皮素3-O-蕓香糖苷；化合物5為槲皮素-3-O-葡萄糖苷；化合物6為槲皮素-7-O-葡萄糖苷；成分7分子離子峰m/z值435.1285，推斷其相對分子質量為434，推斷該化合物為柚皮素-7-O-葡萄糖苷[22]。

圖1 金花茶花的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of C.nitidissima flower

表2 金花茶花的質譜數據Table 2 Mass spectral data of C.nitidissima flower

2.3 CFA對糖尿病小鼠一般體征的影響

灌胃期間，各組小鼠進食量、飲水量、體質量變化情況見圖2。M組小鼠進食量和飲水量均呈現上升的趨勢，體質量逐周下降，說明M組小鼠出現“多食”“多飲”和“消瘦”的病癥，符合2型糖尿病小鼠的特征。CFA干預組小鼠體質量先降后升，整體呈上升趨勢；進食量和飲水量均呈現先上升后下降的趨勢，各體征變化均呈劑量依賴性。灌胃5 周后，P組、MCFA組和HCFA組小鼠體質量均顯著高于M組（P＜0.05），其中HCFA組與P組小鼠消瘦癥狀的改善效果基本一致；MCFA組和HCFA組小鼠進食量與N組無顯著性差異；LCFA組、MCFA組和HCFA組小鼠飲水量與P組無顯著性差異。表明CFA可有效緩解小鼠糖尿病癥狀。

圖2 小鼠進食量、飲水量及體質量的變化Fig.2 Changes in food intake,water intake and body mass of mice

2.4 CFA對糖尿病小鼠FBG和PBG的影響

CFA灌胃期間小鼠FBG變化如圖3A所示。灌胃干預前，M組小鼠血糖值分布集中，均顯著高于N組（P＜0.05），說明2型糖尿病小鼠模型建立成功。干預5 周后，與M組相比，CFA干預組小鼠FBG均顯著下降（P＜0.05），且一定程度上呈劑量依賴性。表明CFA可有效降低糖尿病小鼠FBG。各組小鼠PBG的結果如圖3B所示，灌胃干預前，與N組相比，M小鼠的PBG均顯著升高（P＜0.05），說明糖尿病小鼠PBG調節功能出現異常。干預5 周后，LCFA組、MCFA組和HCFA組小鼠的PBG均顯著低于M組（P＜0.05），可見CFA有效下調了糖尿病小鼠的PBG水平。綜上，CFA對糖尿病小鼠血糖水平具有一定的調節作用。

圖3 糖尿病小鼠FBG（A）和PBG（B）的變化Fig.3 Changes in FBG (A) and PBG (B) of diabetic mice

2.5 CFA對糖尿病小鼠FINS水平與HOMA-IR的影響

胰島素分泌不足和產生胰島素抵抗是2型糖尿病主要病因，因此小鼠FINS含量和HOMA-IR是降血糖功效的重要評價指標。灌胃干預5 周后，各實驗組小鼠FINS含量及HOMA-IR如圖4所示。M組小鼠的FINS含量與N組相比顯著下降（P＜0.05），HOMA-IR較N組顯著升高（P＜0.05），說明M組小鼠的胰島素分泌水平下降且伴隨機體胰島素抵抗現象。P組和HCFA組小鼠的FINS含量均顯著高于M組（P＜0.05），且HCFA組與N組無顯著性差異，而LCFA組和MCFA組小鼠的胰島素分泌改善效果不佳，提示高劑量的CFA有利于增加2型糖尿病小鼠胰島素分泌；此外，CFA干預組小鼠的HOMA-IR均顯著低于M組（P＜0.05），且HOMA-IR呈CFA劑量依賴性降低，可見CFA可有效減輕糖尿病小鼠的胰島素抵抗。

圖4 糖尿病小鼠FINS和HOMA-IR的變化Fig.4 Changes in FINS and HOMA-IR of diabetic mice

2.6 CFA對糖尿病小鼠脂質代謝的影響

各組小鼠的血脂指標結果如圖5所示。M組小鼠血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C含量均較N組存在顯著性差異（P＜0.05），說明糖尿病小鼠脂代謝異常。MCFA、HCFA組小鼠的TG、TC和LDL-C含量均顯著低于M組（P＜0.05），HDL-C含量與N組無顯著差異（P＞0.05）。說明CFA可有效改善糖尿病小鼠脂代謝異常癥狀。

圖5 糖尿病小鼠血脂指標的變化Fig.5 Changes in blood lipid indexes in diabetic mice

2.7 CFA對糖尿病小鼠胰臟、肝臟氧化應激狀態的影響

小鼠胰臟、肝臟的氧化應激指標如圖6所示。與N組相比，M組小鼠胰臟和肝臟的SOD、GSH-Px活性與N組相比顯著下降（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），說明2型糖尿病小鼠抗氧化能力顯著下降，臟器氧化損傷嚴重。與M組相比，除LCFA組小鼠肝臟MDA含量無顯著性差異外，各實驗組小鼠臟器的SOD、GSH-Px活性顯著上升（P＜0.05），MDA含量顯著下降（P＜0.05）。且MCFA組小鼠胰臟的GSH-Px活性及胰臟和肝臟的MDA含量均與P組無明顯差異，HCFA組小鼠胰臟和肝臟的MDA含量顯著低于P組，且接近N組。可見CFA可有效改善糖尿病小鼠臟器氧化應激水平。

圖6 糖尿病小鼠胰臟和肝臟SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量的變化Fig.6 Changes in SOD activity,GSH-Px activity and MDA content in pancreas and liver tissues of diabetic mice

2.8 CFA對糖尿病小鼠胰臟、肝臟病理學的影響

小鼠胰臟組織形態如圖7所示。與N組相比，M組小鼠胰島數目降低，細胞排列松散，結構破壞明顯，部分胞質中可見空泡。CFA干預組小鼠胰島大小、細胞緊密程度均高于M組，呈劑量依賴性，其中MCFA組的胰島形態與P組相當。表明CFA對糖尿病小鼠胰島有很好的保護作用。

圖7 CFA對小鼠胰臟病理形態的影響（×400）Fig.7 Effect of CFA on histopathological status of pancreas in mice (× 400)

采用TUNEL法檢測胰腺β細胞凋亡情況見圖8。N組小鼠胰腺β細胞凋亡率僅1.08%。M組小鼠胰島萎縮嚴重，凋亡細胞主要聚集在胰島中及胰臟邊緣部分，凋亡率高達75.88%。與M組相比，CFA干預組小鼠胰島中棕黃色顆粒顯著減少，凋亡率顯著下降，CFA低、中、高劑量組小鼠胰腺β細胞凋亡率分別為65.03%、31.80%和1.61%。說明CFA對糖尿病小鼠胰腺細胞凋亡的抑制效果具有明顯的劑量依賴性，這與小鼠胰腺組織病理形態觀察結果相符。

圖8 CFA對小鼠胰臟細胞凋亡的影響（×400）Fig.8 Effect of CFA on pancreatic apoptosis in mice (× 400)

N組小鼠肝臟的細胞形態飽滿、健康，肝小葉排列整齊且邊界明顯，中央靜脈無擴張。M組小鼠肝臟有明顯的病變現象，表現為嚴重中央靜脈擴張，肝細胞排列松散，部分細胞出現包漿化或壞死，細胞間隙、纖維化明顯。各CFA干預組小鼠的肝臟病變情況較M組均有不同程度的改善，且有劑量依賴性；其中LCFA組小鼠肝細胞排列松散，細胞間隙、纖維化明顯；MCFA組和HCFA組相較于LCFA組，小鼠的肝臟纖維化得到較大程度改善，肝小葉排列緊密有序，呈明顯放射狀。結果見圖9。

圖9 CFA對小鼠肝臟病理形態的影響（×400）Fig.9 Effect of CFA on histopathological status of liver tissues in mice (× 400)

TUNEL 法檢測各組小鼠肝臟細胞凋亡情況（圖10）。M組小鼠肝臟細胞凋亡嚴重，細胞分布雜亂無序，核仁著色，棕黃色顆粒占比大，凋亡率為36.57%。CFA干預組小鼠肝臟損傷有顯著的改善情況，細胞排列規則，核仁大而清晰，棕黃色顆粒大大減少，低、中、高劑量組的細胞凋亡率分別為32.81%、18.65%和0.8%，均顯著低于M組（P＜0.05）。表明CFA能有效改善糖尿病引起的小鼠肝臟細胞凋亡現象，減輕肝臟器官損傷。

圖10 CFA對小鼠肝臟細胞凋亡的影響（×400）Fig.10 Effect of CFA on hepatic apoptosis in mice (× 400)

3 結論

金花茶是國家一級保護植物，可藥食兩用。本實驗利用HPLC-MS對CFA進行鑒定，得到7 種主要化合物，分別為木犀草素-7-O-蕓香糖苷、表兒茶素、芹菜素-6-C-戊糖-8-C-己糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和柚皮素-7-O-葡萄糖苷，其中，化合物2～6與Zhang Hailong[20]鑒定的金花茶花成分一致。本實驗結果顯示CFA具有較高的多酚、多糖含量和清除DPPH自由基、抑制α-葡萄糖苷酶能力，推測CFA可作為抗氧化劑及α-葡萄糖苷酶抑制劑在體內發揮改善糖尿病的功效。

糖尿病最典型的臨床癥狀是“三多一少”（“多飲”“多食”“多尿”和“消瘦”）與持續性的高血糖癥。血糖水平持高不下可使FINS水平代償性升高，機體對胰島素的敏感性降低；隨病情發展，胰島β細胞進入超負荷耗竭狀態使FINS分泌水平下降，最終產生胰島素抵抗。機體因胰島功能不足，引起脂質代謝酶活性降低，造成脂代謝紊亂形成高血脂癥。同時，機體內血脂含量異常，產生脂毒性，進而加劇胰島素抵抗，形成糖尿病惡性循環。本實驗結果提示CFA可明顯緩解糖尿病小鼠的“多飲、多食、體質量減輕”等癥狀，且能劑量依賴性地降低糖尿病小鼠FBG、PBG、TG、TC及LDL-C濃度，升高FINS和HDL-C，降低機體的HOMA-IR，其中高劑量CFA對糖尿病小鼠血糖、血脂水平的調節接近陽性對照。尤麗等[23]關于藍莓花青素調節糖尿病小鼠糖脂代謝水平的研究也顯示出類似的結果。綜上可以得出，CFA能有效增加糖尿病小鼠胰島素的分泌、緩解機體的胰島素抵抗，進而降低血糖、血脂濃度，改善糖尿病的典型病癥。

氧化應激已成為糖尿病發病的重要因素之一，它在糖尿病及其并發癥的發生發展中起重要作用[24]。氧化應激是由自由基生成和清除系統之間的不平衡引起的，在糖尿病發生過程中常出現抗氧化酶類（SOD、GSH-Px）活性降低、自由基反應增強以及脂質過氧化產物MDA含量增多，這些改變會使機體組織受到氧化損傷，從而導致糖尿病并發癥的產生[25]。本實驗證明，CFA能顯著提高糖尿病小鼠胰臟、肝臟的SOD、GSH-Px活性，從而增強機體的抗氧化能力，同時顯著降低胰臟和肝臟的MDA含量，減弱組織的氧化應激損傷，起到較好的保護作用。HE染色切片和TUNEL染色切片的觀察進一步證實了上述結果。結合CFA優良的體外清除DPPH自由基能力，可見CFA可作為抗氧化劑，在減弱所攝入的食物氧化作用的同時，通過提升糖尿病小鼠胰臟和肝臟的抗氧化水平，減少脂質過氧化帶來的氧化應激損傷，保護臟器正常生理形態結構，使其正常行使生化功能，以此發揮改善糖尿病癥狀的功效。Iftikhar等[26]對刺果蘇木多酚改善糖尿病的研究中也得出了相似的降糖作用機制。

綜上，金花茶花對糖尿病小鼠具有很好的降血糖及抗氧化功效，可通過體外抑制α-葡萄糖苷酶活性、改善體內糖脂代謝紊亂達到調節機體血糖穩態的目的；以及通過優良的體外清除DPPH自由基能力、改善機體氧化應激水平發揮抗氧化作用。這為金花茶花改善糖尿病的研究及金花茶資源的進一步開發利用提供了科學依據。本實驗僅對金花茶花降血糖及抗氧化作用進行探究，后續可對其具體分子機制和改善糖尿病的其他機制開展進一步深入研究。