柚皮素磷脂復合物納米混懸劑制備及其體內藥動學研究

李曉蒙，鄭嫵媚，張智強

（1.鄭州澍青醫學高等?？茖W校，河南 鄭州 450064； 2.雄安創新研究院，河北 雄安 071800）

柚皮素屬于二氫黃酮類化合物［1］，具有抗腫瘤、抗動脈硬化、抗炎、抗纖維化、鎮咳、抗心律失常等藥理活性［1-2］，可通過多靶點作用來對胃癌顯示出良好的治療作用［3］，還能通過多途徑來促進乳腺癌細胞凋亡［2］，并且其毒性極低［4］，具備開發成新藥的潛力。該成分在蒸餾水及不同pH 值磷酸鹽緩沖液中的溶解度為34.13 ～79.52 μg/mL，屬于生物藥劑學分類中的Ⅳ藥物［5］，但其體內吸收受外排作用的影響［6］，導致口服生物利用度僅為5.81%［7］。目前，已有柚皮素PLGA 納米粒［8］、固體脂質納米粒［9］、脂質體［10］等報道，但載藥量均較低。

納米混懸劑是在穩定劑作用下制備的一種“純” 藥物納米制劑［11-12］，載藥量高，可提高水溶性，促進藥物溶出，但對其脂溶性改善程度有限［13］，而磷脂復合物可明顯改善藥物脂溶性［14-16］，故將其與納米混懸劑聯用可有效促進藥物體內吸收。本實驗制備柚皮素磷脂復合物納米混懸劑，并考察其體內藥動學，以期為該成分提供一種新型納米制劑。

1 材料

AL204 型電子天平［梅特勒托利多儀器（上海） 有限公司］； MS-H-S 型磁力攪拌器［大龍興創實驗儀器（北京） 股份公司］； Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； Winner 802型激光粒度儀 （濟南微納顆粒儀器股份有限公司）； LM20 型高壓微射流均質機 （ 美國Microfluidizer 公司）； MIRA3 型掃描電鏡 （捷克Tescan 公司）； DHJ-25C 型實驗型凍干機（上海博登生物科技有限公司）； JC-220B 型氮吹儀（聚創華業儀器有限公司）。

柚皮素對照品（批號20200712，純度98.3%，成都德思特生物技術有限公司）； 染料木素對照品（批號K18642，純度98.0%，西安開來生物工程有限公司）。柚皮素原料藥（批號20200328，純度97.0%，陜西秦邦藥業有限公司）。維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，南京康滿林化工實業有限公司）； 大豆磷脂（批號210826，磷脂酰膽堿含量為92%，愛必信上海生物科技有限公司）； 甘露醇（批號20191020，河北源創生物科技有限公司）。

健康SD 大鼠，雌雄兼具，體質量（220±20） g，購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法與結果

2.1 柚皮素含量測定 參考文獻［8］ 報道，采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Angilent SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相甲醇-0.1% 醋酸（60 ∶40）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長288 nm。

2.1.2 線性關系考察 稱取柚皮素對照品25 mg，置于100 mL 量瓶中，加入60 mL 甲醇，超聲提取3 min 溶解，甲醇稀釋至刻度，即得0.25 mg/mL對照品溶液，流動相依次稀釋至10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標 （Y） 進行回歸，得方程為Y＝22.015 5X＋0.024 7 （r＝0.999 8），在0.05 ～10 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取磷脂復合物納米混懸劑1 mL （柚皮素質量濃度約為250 μg/mL），置于50 mL 量瓶中，加甲醇超聲提取3 min，流動相稀釋至刻度，6 000 r/min 離心10 min，即得。

2.1.4 方法學考察 取10、1、0.05 μg/mL 對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次，測得柚皮素峰面積RSD 分別為0.22%、0.46%、0.38%，表明儀器精密度良好。取“2.1.3” 項下供試品溶液適量，于0、3、6、9、18、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素峰面積RSD 為1.44%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。按“2.1.3” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素含量RSD 為1.60%，表明該方法重復性良好。取9份磷脂復合物納米混懸劑，每份0.5 mL，分成低、中、高3 組，分別加入0.25 mg/mL 對照品溶液0.3、0.5、0.8 mL，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率分別為101.44%、100.08%、100.96%，RSD 分別為0.46%、0.81%、0.72%。

2.2 磷脂復合物及其納米混懸劑制備

2.2.1 磷脂復合物 參考文獻［14］ 報道，取柚皮素原料藥適量，置于40 ℃真空干燥箱中1 d 以除盡水分，取0.5 g 加到100 mL 四氫呋喃中，加入1.5 g 大豆磷脂，45 ℃水浴800 r/min 攪拌3 h，得澄清透明溶液，在45 ℃下減壓旋蒸除去四氫呋喃，即得。由于柚皮素不溶于二氯甲烷，而磷脂復合物易溶于后者，故加入該溶劑復溶，0.45 μm 微孔濾膜過濾除去未參加復合的原料藥，參考文獻［14］ 報道測得復合率為99.3%。

2.2.2 磷脂復合物納米混懸劑 參考文獻［15，17］ 報道，取磷脂復合物50 mg，置于10 mL 乙醇中溶解，作為有機相； 制備含一定濃度穩定劑的水相50 mL，室溫下800 r/min 攪拌溶解，將有機相緩慢滴到水相中，在250 W 下超聲提取5 min，在45 ℃下減壓旋蒸20 min，立即在一定均質壓力下循環均質數次，置于-10 ℃冰箱中固化10 min，取出，補加蒸餾水至50 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取磷脂復合物納米混懸劑適量，蒸餾水稀釋50 倍，取適量在粒度分析儀上進行測定，平行3 次，取平均值。

2.4 制備工藝優化 采用單因素試驗。

2.4.1 穩定劑種類 固定磷脂復合物用量50 mg，穩定劑與磷脂復合物用量比例3 ∶1，均質壓力100 MPa，均質次數8 次，考察穩定劑種類對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結果見表1。由此可知，單用泊洛沙姆188、PVP K30 或TPGS 時磷脂復合物納米混懸劑粒徑較大，而聯用PVP K30 ＋TPGS（1 ∶1） 時粒徑、PDI 最小，Zeta 電位絕對值大于30 mV，故選擇其作為穩定劑。

表1 穩定劑種類對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.1 Effects of stabilizer type on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.2 穩定劑與磷脂復合物用量比例 固定磷脂復合物用量50 mg，穩定劑PVP K30＋TPGS （1 ∶1），均質壓力100 MPa，均質次數8 次，考察穩定劑與磷脂復合物用量比例對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結果見表2。由此可知，穩定劑用量過小時粒徑、PDI 較大，Zeta 電位絕對值較??； 隨著穩定劑比例增加，粒徑、PDI 均先降后升，Zeta 電位絕對值逐漸升高； 當兩者比例為3 ∶1 時，粒徑、PDI 較小，Zeta 電位絕對值較大，故選擇其作為穩定劑與磷脂復合物用量比例。

表2 穩定劑與磷脂復合物用量比例對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.2 Effects of stabilizer-phospholipids complex consumption ratio on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.3 均質壓力 固定磷脂復合物用量50 mg，穩定劑為PVP K30＋TPGS （1 ∶1），穩定劑與磷脂復合物用量比例3 ∶1，均質次數8 次，考察均質壓力對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結果見表3。由此可知，均質壓力對Zeta 電位絕對值影響不大，為80 MPa 時粒徑大于400 nm，PDI 大于0.3； 隨著均質壓力增加，粒徑、PDI 先降后升，表明其過大時會導致粒徑變大，分布不均勻，為100 MPa時兩者較小，故選擇其作為均質壓力。

表3 均質壓力對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.4 均質次數 固定磷脂復合物用量50 mg，穩定劑PVP K30＋TPGS （1 ∶1），穩定劑與磷脂復合物用量比例3 ∶1，均質壓力100 MPa，考察均質次數對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結果見表4。由此可知，均質次數較少時粒徑、PDI 均較大，但過多時兩者有減小趨勢； 均質10 次時粒徑、PDI較小，Zeta 電位絕對值大于30 mV，故選擇其作為均質次數。

表4 均質次數對粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.4 Effects of homogenization frequency on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.5 驗證試驗及形態觀察

2.5.1 驗證試驗 根據“2.4” 項下結果，得到最優處方為磷脂復合物用量50 mg，穩定劑PVP K30＋TPGS （1 ∶1），穩定劑與磷脂復合物用量比例3 ∶1，均質壓力100 MPa，均質次數10 次。按上述優化處方平行制備3 批樣品，測得平均粒徑（圖1）、PDI、Zeta 電位（圖2） 分別為（260.53±25.86） nm、0.160±0.024、（-31.08±1.37） mV。

圖1 柚皮素磷脂復合物納米混懸劑粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

圖2 柚皮素磷脂復合物納米混懸劑Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

2.5.2 形態觀察 取磷脂復合物納米混懸劑適量，蒸餾水稀釋50 倍，渦旋2 s 混勻，滴到銅膠帶上，置于30 ℃真空干燥箱中干燥30 min，噴濺1 min，在掃描電鏡下放大50 000 倍進行觀察，結果見圖3。由此可知，該制劑基本形態為類球形或橢圓形，并且其粒徑與激光粒度儀所測值存在一定差異，這是因為掃描電鏡觀察前需對樣品進行干燥。

圖3 柚皮素磷脂復合物納米混懸劑掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopic image of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

2.6 凍干粉制備 取磷脂復合物納米混懸劑適量，加入5%甘露醇，振蕩溶解，分裝至西林瓶中，置于-50 ℃超低溫冰箱中預凍1 d，轉移到-30 ℃冷凍干燥機中抽真空，冷凍干燥1 d，即得，蒸餾水復溶后，測得其平均粒徑、PDI、Zeta 電位分別為（281.16±28.96） nm、0.184±0.027、（-28.17±1.05） mV。另外，磷脂復合物納米混懸劑凍干粉中柚皮素含量為（0.45±0.02）%。

2.7 凍干粉穩定性考察 取磷脂復合物納米混懸劑及其凍干粉適量，密封后置于恒溫恒濕箱（溫度30 ℃，相對濕度65%） 中，發現磷脂復合物納米混懸劑在第3 天即可肉眼觀察到底部沉淀，而凍干粉于0、10、15、30、45、60、75、90 d 取樣，蒸餾水復溶后測定粒徑、PDI，結果見圖4。由此可知，凍干粉放置90 d 后復溶時粒徑仍小于300 nm，PDI 仍小于0.3，表明制成凍干粉后可增強磷脂復合物納米混懸劑穩定性。

2.8 X 射線粉末衍射（XRPD） 分析 取柚皮素原料藥、空白輔料（輔料比例同磷脂復合物納米混懸劑凍干粉）、物理混合物（柚皮素原料藥＋空白輔料，比例同磷脂復合物納米混懸劑凍干粉）、柚皮素磷脂復合物、柚皮素磷脂復合物納米混懸劑凍干粉適量，填充至樣品槽中，壓平整后進行分析，結果見圖5。由此可知，原料藥在7.2°、8.8°、12.2°等處晶型峰較強； 在物理混合物中上述晶型峰仍可觀察到； 在磷脂復合物及其納米混懸劑凍干粉中原料藥上述晶型峰消失，表明該成分以無定型狀態存在。

2.9 溶解度、油水分配系數測定

2.9.1 溶解度 按“2.5.1” 項下最優處方制備磷脂復合物納米混懸劑，以柚皮素原料藥與磷脂的物理混合物代替磷脂復合物來制備納米混懸劑，按“2.6” 項下方法制成凍干粉。取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復合物、柚皮素納米混懸劑、柚皮素磷脂復合物納米混懸劑凍干粉適量，置于20 mL 蒸餾水及pH 2.0、4.5、6.8、7.4 磷酸鹽緩沖液中，在250 W 下超聲處理15 min，在25 ℃下磁力攪拌2 d，混懸液過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算溶解度，結果見圖6。由此可知，磷脂復合物納米混懸劑在蒸餾水、不同pH 值磷酸鹽緩沖液中的溶解度高于其他3 種樣品。

圖6 各樣品溶解度（n＝3）Fig.6 Solubilities of various samples （n＝3）

2.9.2 油水分配系數 取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復合物、柚皮素納米混懸劑、柚皮素磷脂復合物納米混懸劑凍干粉適量，加到正辛醇飽和蒸餾水及pH 2.0、4.5、6.8、7.4 磷酸鹽緩沖液中，在250 W 下超聲提取15 min，在25 ℃下磁力攪拌2 d，取上層混懸液，過0.45 μm 水性濾膜，測定濃度C1； 取水相5 mL，加到飽和后同體積正辛醇中，在25 ℃下磁力攪拌2 d，5 000 r/min 離心，取下層水相，測定濃度C0，計算油水分配系數P，公式為P＝ （C1-C0） /C0，并計算lgP，結果見圖7。由此可知，將原料藥制成磷脂復合物后lgP升高，表明其脂溶性得到改善； 納米混懸劑lgP降低，可能是由于它對原料藥水溶性的提高程度大于對脂溶性的所致； 磷脂復合物納米混懸劑lgP高于納米混懸劑，可能與磷脂復合物可提高原料藥脂溶性有關。

圖7 各樣品油水分配系數（n＝3）Fig.7 Oil-water partition coefficients for various samples （n＝3）

2.10 解離率測定

2.10.1 均質前磷脂復合物 取磷脂復合物50 mg（柚皮素含量為W0），置于10 mL 乙醇中溶解，作為有機相； 取蒸餾水50 mL，室溫下磁力攪拌（800 r/min），作為水相，將有機相緩慢滴到水相中，在250 W 下超聲提取5 min，在45 ℃下減壓旋蒸20 min，蒸餾水定容至50 mL，12 500 r/min 離心30 min，棄去上清液，殘渣中加入約20 mL 二氯甲烷振蕩10 min，轉移至25 mL 量瓶中，二氯甲烷定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，減壓旋蒸除去有機溶劑，即得，甲醇復溶，測定柚皮素含量W1，計算磷脂復合物在水中的解離率，公式為解離率＝ （1-W1/W0） ×100%。

2.10.2 均質后磷脂復合物 取新制備的磷脂復合物納米混懸劑0.1 mL，加入乙醇10 mL，超聲提取10 s 溶解，減壓旋蒸除去溶劑得殘渣（不加熱），測定柚皮素含量W0，按“2.10.1” 項下方法測定殘渣中未解離磷脂復合物的量W1，計算解離率。

2.10.3 凍干后磷脂復合物 取新制備的磷脂復合物納米混懸劑凍干粉約50 mg，加入1 mL 蒸餾水復溶，精密量取0.1 mL，按“2.10.2” 項下方法測定W1，計算解離率。

2.10.4 結果分析 均質前磷脂復合物解離率為17.86%，均質后增加至28.61%，進一步制成凍干粉后為29.07%，表明凍干未對其解離率產生明顯影響。

2.11 體外釋藥研究 取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復合物、柚皮素納米混懸劑凍干粉、柚皮素磷脂復合物納米混懸劑凍干粉適量（柚皮素含量10 mg），加入6 mL 蒸餾水，轉移至透析袋中（截留分子量8～12 kDa），扎緊，設置轉速為75 r/min，介質為1 000 mL 蒸餾水，待介質恒溫至37 ℃時放入樣品，取樣點選擇0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24、36 h，取樣、補加蒸餾水體積均為4 mL，0.45 μm 水膜過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算累積溶出度，結果見圖8。由此可知，原料藥36 h 內累積釋放度為44.52%，磷脂復合物增加至63.34%，而磷脂復合物納米混懸劑4 h 內累積釋放度即達90%以上。

圖8 各樣品體外釋藥曲線（n＝3）Fig.8 In vitro drug release curves for various samples （n＝3）

2.12 體內藥動學研究

2.12.1 灌胃液制備 取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復合物、柚皮素納米混懸劑凍干粉、柚皮素磷脂復合物納米混懸劑凍干粉適量，0.5% CMC-Na 溶液制成混懸液，即得（柚皮素含量5 mg/mL，臨用現配）。

2.12.2 分組、給藥與采血 24 只大鼠隨機分為4組，每組6 只，分別給予 “2.12.1” 項下藥液（30 mg/kg），于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h 置于盛有乙醚的容器中，麻醉5 s 后眼眶采血各約250 μL，置于肝素浸潤離心管中，棉球覆蓋于采血處止血，3 000 r/min 離心3 min，取上層血漿，低溫保存。

2.12.3 血漿樣品處理 參考文獻［18］ 報道，取100 μL 血漿樣品，加入NH4H2PO4緩沖液（0.06 mol/L，pH 5.0）、甲醇各100 μL，渦旋1 min，加入1 mL 乙酸乙酯，渦旋3 min 后6 500 r/min 離心5 min，吸取上層有機相至離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入100 μL 甲醇復溶。

2.12.4 線性關系考察 取柚皮素對照品適量，甲醇制成2 000、1 000、500、100、50 ng/mL 溶液，分別取100 μL，40 ℃氮氣吹干，加入100 μL 空白血漿，渦旋1 min，即得質量濃度分別為2 000、1 000、500、100、50 ng/mL 的血漿對照品溶液，按“2.12.3” 項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品與內標（染料木素）峰面積比值（Y） 對對照品質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y＝0.001 3X＋0.156 2 （r＝0.994 8），在50～2 000 ng/mL 范圍內線性關系良好。

2.12.5 方法學考察 取柚皮素原料藥給藥1.5 h后的血漿樣品適量，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得對照品與內標峰面積比值RSD 為9.66%，表明樣品在24 h內穩定性良好。取50、500、2 000 ng/mL 血漿對照品溶液適量，同一天內在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得對照品與內標峰面積比值RSD 分別為8.12%、5.04%、6.13%，表明該方法日內精密度良好； 同法連續測定6 d，每天1 次，測得兩者比值 RSD 分別為 5.02%、9.42%、7.88%，表明該方法日間精密度良好。取50、500、2 000 ng/mL 血漿對照品溶液適量，按“2.11.3”項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率分別為94.05%、93.80%、95.17%，RSD 分別為8.14%、5.09%、4.18%。

2.12.6 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖9，再采用3P97 程序統計矩模型計算主要藥動學參數，結果見表5。由此可知，與原料藥比較，磷脂復合物tmax無顯著差異（P＞0.05），但Cmax、AUC0～t升高（P＜0.05），相對生物利用度增加至1.97 倍；納米混懸劑、磷脂復合物納米混懸劑tmax縮短（P＜0.05），Cmax升高（P＜0.01），相對生物利用度分別增加至3.07、4.38 倍，而與納米混懸劑比較，磷脂復合物納米混懸劑Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05）。

圖9 柚皮素血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig.9 Plasma concentration-time curves for naringenin （n＝6）

表5 柚皮素主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetics parameters for naringenin （±s，n＝6）

表5 柚皮素主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetics parameters for naringenin （±s，n＝6）

注： 與柚皮素原料藥比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與柚皮素納米混懸劑比較，＃P＜0.05。

參數單位柚皮素原料藥柚皮素磷脂復合物柚皮素納米混懸劑柚皮素磷脂復合物納米混懸劑tmaxh2.11±0.272.23±0.360.96±0.28*1.03±0.31*Cmaxng·mL-1426.33±63.10623.57±94.34*990.93±148.75**1 492.13±203.68**＃AUC0～tng·mL-1·h1 122.73±194.042 209.81±235.01*3 452.10±351.77**4 923.48±512.84**＃AUC0～∞ng·mL-1·h1 210.27±202.522 296.54±246.23*3 508.56±382.60**5 219.67±560.87**＃

3 討論與結論

何小燕等［16］對柚皮素磷脂復合物制備工藝進行研究，發現柚皮素與磷脂比例約為1 ∶5，即后者用量過大，故本實驗重新考察該處方。前期報道，柚皮素制成磷脂復合物后溶出度較低，可能與該劑型黏性大、分散性差、疏水性強等因素有關［12］。根據Ostwald-Freundlich 方程可知，藥物粒徑對溶解度、溶出速率、溶出度影響很大［19］，而磷脂復合物本身具有較強的疏水性，故需引入納米混懸劑加以改善［20］。

一般認為，藥物吸收最佳logP范圍為-1 ～2［14］，柚皮素磷脂復合物在pH 2.0、4.5 下該數值均為2.5 左右，可能會影響吸收，而其納米混懸劑在1～2 之間，有利于吸收。藥動學研究結果表明，柚皮素磷脂復合物納米混懸劑tmax縮短，可能與該制劑前期釋藥速率較快有關；Cmax升高，一方面由于磷脂復合物納米混懸劑提高了原料藥水溶性和脂溶性，另一方面與藥物累積溶出度明顯改善有關；相對生物利用度增加至4.38 倍，可能與多種因素有關，例如無定形藥物比晶型藥物更易吸收［21］；納米藥物與胃腸道接觸更充分，有利于吸收； 柚皮素水溶性、脂溶性、溶出度得到改善，解決了吸收瓶頸［19-22］； 處方中TPGS、磷脂等輔料具有促吸收作用［6］等。

綜上所述，本實驗為柚皮素磷脂復合物納米混懸劑后續藥效學研究奠定了基礎，也為相關納米制劑開發提供了新思路。