黑豆與黃酒共制女貞子炮制工藝優(yōu)化

蔣云秀，東寶花，敖明月，胡 麟，胡昌江，陳志敏，余凌英

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137）

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，臨床常用于治療肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明、內(nèi)熱消渴、骨蒸潮熱等，而黑豆可用于預(yù)防心血管疾病、治療糖尿病、抗炎癥、改善骨質(zhì)疏松等［1］。女貞子生品性涼，臨床應(yīng)用時(shí)有輕微腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)［2］，需加以炮制［3］，如黃酒制可緩和其寒性，黑豆汁制可協(xié)同增強(qiáng)其補(bǔ)肝腎、抗氧化等作用［4］，傳統(tǒng)炮制方法為黑豆與其共蒸，但因時(shí)間較長、工藝參數(shù)無量化標(biāo)準(zhǔn)、大生產(chǎn)篩選繁瑣，限制了其傳承發(fā)展［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，通過“性狀-成分-藥效” 多維評(píng)價(jià)優(yōu)化黑豆與黃酒共制女貞子炮制工藝，以期為該藥材規(guī)范化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Thermo 2018 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo 公司）； BP110S 型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）； DHS-10A 型快速水分測定儀［邦西儀器科技（上海） 有限公司］； DHG-9240 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海索譜儀器有限公司）； HH-S8 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）； KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 紅景天苷（批號(hào)CHB20101）、特女貞苷（批號(hào)CHB201213）、女貞苷G13 （批號(hào)CHB210106）、2，2 聯(lián)苯基-1-苦基肼基 （DPPH，批號(hào)CHB210105）、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批號(hào)AA0400） 對照品均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均大于98%。黃酒購自紹興市抱龍山有限公司； 黑豆購自農(nóng)貿(mào)市場（大粒綠心黑豆）。女貞子（批號(hào)D2110016、D2010050、D220526） 購自四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡昌江教授鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。過硫酸鉀（2021110101）。乙腈、磷酸均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備

2.1.1 傳統(tǒng)方法 取100 g 女貞子，加入20 g黃酒，拌勻，悶潤，加入等量黑豆粒，隔水蒸制一段時(shí)間，取出，干燥，重復(fù)9 次，即得。

2.1.2 優(yōu)化方法 取100 g 女貞子，加入適量黃酒和黑豆汁隔水蒸制一段時(shí)間，取出，干燥，重復(fù)1 次，即得。

2.1.3 黃酒黑豆汁制備方法 取100 g 黑豆，加水煎煮2 次，第1 次4 h，第2 次3 h，過濾，合并濾液，得250 mL 黑豆汁，晾涼后加入20 mL 黃酒，即得。

2.2 外觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)建立 根據(jù)成品性狀結(jié)合2020年版《中國藥典》，以表面色澤、質(zhì)地、氣味為評(píng)價(jià)指標(biāo)［6］，具體見表1。

表1 女貞子外觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Appearance evaluation criteria for Ligustri lucidi Fructus

2.3 醇溶性浸出物含量測定 參考2020 年版《中國藥典》，采用醇溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法，以30%乙醇為溶劑，要求不得少于25%。

2.4 含量測定 采用HPLC 法。

2.4.1 色譜條件 Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫（0 ～10 min，10% 乙腈； 10 ～60 min，10% ～40%乙腈）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃；檢測波長275 nm； 進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 對照品適量，50%甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.078、2.26、1.52 mg/mL 的溶液，即得，在4 ℃下保存。

2.4.3 供試品溶液制備 精密稱取1.0 g 女貞子粉末（過3 號(hào)篩），置于錐形瓶中，精密加入25 mL 稀乙醇，稱定質(zhì)量，密塞，超聲提取40 min，取出，放冷，稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，靜置，取適量上清液，3 000 r/min 離心20 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同體積對照品溶液，50%甲醇稀釋，在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液適量，在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 峰面積RSD 分別為0.38%、0.91%、1.35%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S1），于0、4、8、12、24、48 h 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 峰面積RSD 分別為1.97%、1.27%、0.62%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材（S1） 6 份，按 “2.4.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 峰面積RSD 分別為1.03%、1.70%、0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的藥材粉末0.01 g，置于錐形瓶中，精密加入對照品適量，按“2.4.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13平均加樣回收率分別為101.73%、100.84%、97.89%，RSD 分別為2.89%、2.34%、2.28%。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 供試品溶液制備 同“2.4.3” 項(xiàng)。

2.5.2 DPPH 法 參考文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道，精密稱取DPPH 2.75 mg，置于100 mL 量瓶中，無水乙醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為0.027 5 mg/mL 的溶液。取“2.4.3” 項(xiàng)下供試品溶液1 mL，與3 mL DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm 波長處測定吸光度A，以樣品溶劑調(diào)零校準(zhǔn)，計(jì)算DPPH 清除率，公式為清除率＝ ［1- （A1-A2） /A3］ ×100%，其中A1為1 mL 供試品溶液與3 mL DPPH溶液混合室溫避光孵育30 min 后吸光度，A2為1 mL供試品溶液與3 mL 無水乙醇混合室溫避光孵育30 min 后吸光度，A3為1 mL 稀乙醇與3 mL DPPH 溶液混合室溫避光孵育30 min 后吸光度。

2.5.3 ABTS 法 參考文獻(xiàn) ［8］ 報(bào)道，ABTS溶液由ABTS （3.84 mg/mL） 與過硫酸鉀（1.34 mg/mL） 等體積混合而成，避光放置12 h，使用時(shí)用無水乙醇稀釋至吸光度為0.70 ± 0.02。取“2.4.1” 項(xiàng)下供試品溶液0.2 mL，與3.8 mL ABTS 溶液混勻，避光反應(yīng)5 min，在734 nm 波長處測定吸光度A，以樣品溶劑調(diào)零校準(zhǔn)，計(jì)算ABTS 清除率，公式為清除率＝ （1-As/Ab） ×100%，其中Ab為3.8 mL ABTS 溶液＋0.2 mL 樣品溶液吸光度，As為3.8 mL ABTS 溶液＋0.2 mL 樣品溶液吸光度。

2.6 權(quán)重確定 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道，采用層次分析法（AHP）。

浸出物是質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，而特女貞苷、紅景天苷、女貞苷G13 為女貞子中含量較高、具有變化趨勢的成分。同時(shí)，特女貞苷、紅景天苷作為2020 年版《中國藥典》 女貞子質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，在炮制過程中可發(fā)生轉(zhuǎn)化； 女貞苷G13 含量較高，并具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用［10-11］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇醇溶性浸出物、特女貞苷、紅景天苷、女貞苷G13 含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

將3 個(gè)影響因素分為3 個(gè)層次，4 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)分為4 個(gè)層次，確定重要程度依次為成分＞藥效＞性狀、紅景天苷含量＞女貞苷G13 含量＞特女貞苷含量＞醇溶性浸出物含量，采用1～9 標(biāo)度法對其進(jìn)行兩兩比較以評(píng)判重要性［12-13］，構(gòu)建成對比較優(yōu)先判斷矩陣，見表3～5。

表3 各層次評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 Scoring standards for various levels

表4 性狀、成分、藥效成對比較優(yōu)先判斷矩陣及權(quán)重系數(shù)Tab.4 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of characters，components and efficacy

表5 評(píng)價(jià)指標(biāo)成對比較優(yōu)先判斷矩陣及權(quán)重系數(shù)Tab.5 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of evaluation indices

根據(jù)評(píng)分結(jié)果，測得性狀、成分、藥效一致性比例因子（CR） ＝0.008 9＜0.1，而紅景天苷、女貞苷G13、特女貞苷、醇溶性浸出物含量CR ＝0.011 6＜0.1，均符合一致性檢驗(yàn)，表明權(quán)重系數(shù)合理有效。

2.7 黑豆與黃酒共制女貞子工藝優(yōu)化

2.7.1 單因素試驗(yàn)

2.7.1.1 輔料 傳統(tǒng)炮制方法是女貞子與黑豆共蒸，但兩者難以區(qū)分，篩選起來耗時(shí)費(fèi)力，而且九制女貞子耗時(shí)較長，不適宜大生產(chǎn)，故本實(shí)驗(yàn)選擇黑豆汁。

2.7.1.2 蒸制時(shí)間 隨著蒸制時(shí)間延長，紅景天苷含量升高，女貞苷G13、特女貞苷含量先升后降，在60 min 時(shí)最高，結(jié)合蒸制次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)選擇60 min。

2.7.1.3 蒸制次數(shù) 隨著蒸制次數(shù)增加，紅景天苷含量升高，女貞苷G13、特女貞苷含量呈動(dòng)態(tài)變化，在第5 次時(shí)最高，故本實(shí)驗(yàn)選擇5 次。

2.7.1.4 烘制溫度 隨著烘制溫度增加，紅景天苷含量升高，特女貞苷、女貞苷G13 含量降低，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇80 ℃。

2.7.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蒸制時(shí)間（A）、蒸制次數(shù)（B）、烘制溫度（C） 為影響因素，設(shè)計(jì)三因素五水平試驗(yàn)，因素水平見表6。

表6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法因素水平Tab.6 Factors and levels for central composite designresponse surface method

然后，以外觀性狀，紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13、醇溶性浸出物含量，DPPH、ABTS 自由基清除率的總評(píng) “歸一值” （OD 值） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)［14-15］，公式為OD＝0.539 0×［0.465 8×Y1/Y1max＋0.277 1×Y2/Y2max＋0.161 1×Y3/Y3max＋0.096 0×Y4/Y4max］ ＋0.297 3× ［0.5×Y5/Y5max＋0.5×Y6/Y6max］ ＋0.163 8×Y7/Y7max，其中Y1～Y7分別為紅景天苷、女貞苷G13、特女貞苷、醇溶性浸出物含量，DPPH、ABTS 自由基清除率，外觀性狀，Y1max～Y7max為其最大值，結(jié)果見表7。

表7 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.7 Design and results for central composite design-response surface method

采用Design Expert 8.0 軟件對表7 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得方程為OD ＝0.80 ＋6.50A＋1.88B＋0.02C-1.39AB-8.29AC＋4.59BC＋9.97C2，方差分析見表8。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該模型可用于預(yù)測分析； 烘制溫度具有顯著影響（P＜0.05）。響應(yīng)面分析見圖2。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

最終確定，最優(yōu)工藝為黑豆熬汁約250 g 后加入20 g 黃酒，拌入100 g 女貞子中，隔水共蒸70 min，取出，在90 ℃下烘干，拌入黑豆汁與黃酒再蒸，重復(fù)7 次。

2.7.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取3 批藥材（批號(hào)D2110016、D2010050、D220526），按“2.7.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表9。由此可知，該工藝穩(wěn)定可行（RSD＜3%）。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.9 Results for verification tests （n＝3）

3 討論與結(jié)論

2020 年版《中國藥典》 僅收載了女貞子和酒女貞子，而黑豆與黃酒共制女貞子在古籍中記載較多，不僅能減少其不良反應(yīng)，還可增強(qiáng)其滋補(bǔ)肝腎作用，但耗時(shí)較長，不適宜現(xiàn)代化生產(chǎn)，故本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法探索更規(guī)范化、數(shù)據(jù)化的炮制工藝。現(xiàn)代研究表明，女貞子中紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性［16-19］，故本實(shí)驗(yàn)以性狀、成分和藥效為指標(biāo)，結(jié)合層次分析法確定其權(quán)重，避免主觀化對結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)工藝下上述指標(biāo)與傳統(tǒng)炮制方法相似，在某些方面甚至更優(yōu)，可實(shí)現(xiàn)特色炮制品的數(shù)據(jù)化生產(chǎn)［20-21］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)不僅為女貞子現(xiàn)代化生產(chǎn)提供了依據(jù)，還通過建立“性狀-成分-藥效” 多維關(guān)聯(lián)的炮制工藝優(yōu)化方法來為其他中藥炮制品提供了借鑒。今后，將進(jìn)一步探索女貞子特色炮制品的藥效物質(zhì)變化情況，深入挖掘其作用機(jī)制，以期更有利于相關(guān)臨床應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)。