人參皂苷Re 與5 種環糊精主客體包合過程研究

王 偉，趙鴻雙，吳天元，李 錚，陸勃帆，李 慧，吳 巍

（長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117）

人參皂苷Re 是原人參三醇型單體皂苷之一［1］，在抗心律失常、抗休克、抗血小板凝集方面具有很好的藥理活性［2-3］，但該成分水溶性較差，導致其生物利用度低，從而限制臨床發展及新藥開發［4］。包合技術是提高難溶性藥物溶解度和生物利用度的方法，在藥學領域應用廣泛［5-7］，藥物被環糊精包合后溶解性和生物利用度均能明顯改善，廣泛應用于口服、注射原料藥［8-10］。

課題組前期曾選擇貝塔環糊精作為載體，制備人參皂苷Re 超分子包合物，發現原料藥生物利用度顯著提高。本實驗研究阿爾法環糊精、貝塔環糊精、伽馬環糊精、羥丙基貝塔環糊精、羥丙基伽馬環糊精對人參皂苷Re 的包合作用，探討其包合機制［11-12］，并結合相溶解度法進行驗證［13-15］，以期為人參皂苷Re 臨床應用提供基礎，并為相關超分子藥物定量構效關系的探討提供參考依據［16-17］。

1 材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀 （美國Agilent公司）； SHZ-82 恒溫水浴振蕩鍋（金壇市盛威實驗儀器廠）。人參皂苷Re 對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%）。阿爾法環糊精（相對分子質量972.84）、貝塔環糊精（相對分子質量1 134.98）、伽馬環糊精 （相對分子質量1 297.12）、羥丙基貝塔環糊精 （相對分子質量1 541.54）、羥丙基伽馬環糊精 （相對分子質量1 741） 均購自上海麥克林生化科技有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純（美國Fisher 公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法

2.1 分子構建及結構優化 各環糊精結構分別獲得于劍橋晶體數據庫［www.ccdc.cam.ac.uk/structures/，阿爾法環糊精（1100537）、貝塔環糊精（181781） 和伽馬環糊精 （1978774）］ 和ChemSpider 數據庫 ［www.chemspider.com，羥丙基貝塔環糊精（128446-35-5） 和羥丙基伽馬環糊精（128449-34-4）］。采用Chemdraw 20.0 軟件繪制人參皂苷Re 結構，將其保存為“.mol” 格式，Chemdraw 3D 保存最優構象。

2.2 量化計算法（Gaussian） 研究主客體形成的熱力學參數 PM3 方法考慮了非鍵合原子之間的相互作用力，在研究超分子（比如環糊精分子）時可得到比較穩定的計算結果，并且B3LYP/6-31G （d） 方法在藥物小分子的計算方面有較高的精確度。因此，本研究采用Gaussian06 軟件包中的ONIOM （B3LYP /6-31G*： PM3） 分層算法對取代環糊精體系的包合反應進行模擬，即主體分子的5種環糊精采用PM3 算法，包合過程則采用B3LYP/6-31G*算法。

2.3 分子動力學模擬（MD） 主客體包合過程MD 以能量最小化處理后的結構為初始結構，利用Materials Studio 2020 （美國Accelrys 公司） 模塊Amorphous Cell 中的Construction 建立人參皂苷Re、環糊精分子晶胞，cell 為周期性邊界條件，盒子尺寸19.5 cm×19.5 cm×19.5 cm，設置比例為1 ∶1，密度為1 g/cm3，為了區別主體分子環糊精和客體分子人參皂苷Re，前者以線狀模型表示，后者以球狀模型表示。建立晶胞后，采用Forcite 對其進行能量最小化處理，再以其包含的Dynamics 模塊進行恒溫恒容（NVT） 模擬，當體系能量穩定后進行恒溫恒壓（NPT） 模擬，條件為Compass 力場，溫度298、310 K，時間步長1 fs，其中NVT為50 ps，NPT 為1 000 ps，壓力為1.0×10-4GP。

2.4 人參皂苷Re 相溶解度測定 精密稱取各環糊精適量，分別制成濃度為5 ～100 mmol/L 的阿爾法環糊精、伽馬環糊精、羥丙基貝塔環糊精、羥丙基伽馬環糊精溶液，以及濃度為1～10 mmol/L 的貝塔環糊精溶液，加入過量人參皂苷Re，分別在25、37° C 下水浴振蕩72 h，吸取0.8 mL，過濾，加500 μL 甲醇，混勻后再過濾，采用HPLC 法測定人參皂苷Re 含量。分析條件為Ascentis ? Express C18色譜柱（5 cm×3.0 mm，2.7 μm）； 流動相乙腈-水 （15 ∶ 85）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長203 nm； 進樣量5 μL。

3 結果

3.1 主客體分子包合過程模擬 首先，采用B3LYP/6-31G （d） 算法對5 種主體分子結構進行優化，使其無虛頻，獲得主體分析最優構象。再采用PM3 算法計算環糊精、人參皂苷Re 結合能，獲得兩者結合的熱力學參數，結果見表1。

表1 人參皂苷Re 與包合物的熱力學參數Tab.1 Thermodynamic parameters for ginsenoside Re and inclusion compounds

由此可知，各環糊精形成包合物后偶極矩均發生變化，具有不同于主-客體的新型結構形式，越穩定的包合物具有越大的負結合能（△E），而包合物的焓變值（△H） 均為負值，表明主客體形成包合物的過程均為吸熱過程； 熵值（△S） 為正值，表明在包合過程中體系的混亂程度增加； 各包合物吉布斯自由能（△G） 也均為負值，表明人參皂苷Re 與環糊精的包合過程均為自發反應，即包合物形成的驅動力來源于焓熵協同驅動力。另外，人參皂苷Re 與伽馬環糊精結合的△G、△H絕對值最大，表明反應最容易，即人參皂苷Re 與5 種主體分子反應的難易程度依次為IC人參皂苷Re/伽馬環糊精＞IC人參皂苷Re/貝塔環糊精＞IC人參皂苷Re/羥丙基伽馬環糊精＞IC人參皂苷Re/羥丙基貝塔環糊精＞IC人參皂苷Re/阿爾法環糊精。

人參皂苷Re 與5 種環糊精結合的最優構象見圖1。由此可知，人參皂苷Re 與阿爾法環糊精結合的最穩定構象是將前者懸于后者大口端上方，只有部分存在于前者C6 位葡萄糖殘基上的羥基能插入后者孔徑中（圖1A）； 人參皂苷Re 與受體分子貝塔環糊精結合時，前者貫穿于后者中，并且也是前者C6 位的葡萄糖殘基插入后者空腔中 （圖1B）； 伽馬環糊精孔徑比貝塔環糊精更大（0.75 ～0.83 nm），使得人參皂苷Re 可貫穿于空腔內，導致進一步緊密的結合（圖1C）； 羥丙基貝塔環糊精、羥丙基伽馬環糊精由于羥基被取代成羥丙基，客體分子進入空間內的位阻增加，導致人參皂苷Re 與其結合不緊密，僅是浮于環糊精上方，而且兩者中的羥丙基衍生基團雖然提高了溶解度，但也增加了配體分子的空間位阻，使其入環的阻力增加（圖1D、1E）。綜上所述，在與不同環糊精分子的結合過程中，人參皂苷Re 均從其大口端向小口端進入，其中貝塔環糊精和伽馬環糊精能將該成分包裹于空腔中，而其他3 種環糊精只能與其形成部分包合物； 伽馬環糊精能將該成分包裹于空腔中，表明疏水作用力也是兩者包合的主要作用力，可能也是其相溶解度較大的主要原因。

圖1 人參皂苷Re 與環糊精結合的最穩定構象Fig.1 The most stable conformations of ginsenoside Re combined with cyclodextrins

3.2 主客體包合驅動力研究 將優化后的配體分子人參皂苷Re 分別與不同受體分子環糊精置于晶胞內，設置晶胞尺寸為3.13 nm，每個晶胞內分別置入7 個受體分子、7 個配體分子。以伽馬環糊精與人參皂苷Re 的結合為例，晶胞見圖2A，包合過程中能量變化及分布見圖2B。

圖2 伽馬環糊精與人參皂苷Re 建立的晶胞（A） 及恒溫恒壓模擬的能量分布（B）Fig.2 Unit cell established by gamma-cyclodextrin and ginsenoside Re （A） and energy distribution under constant temperature and constant pressure simulation （B）

由圖2B 可知，伽馬環糊精與人參皂苷Re 結合時的勢能大于非鍵能曲線，后者包括氫鍵作用力、疏水作用力、靜電作用等，即兩者結合時勢能大于氫鍵作用、疏水作用之和。再分別計算配體分子人參皂苷Re 與受體分子在25、37 ℃下勢能、非鍵能、結合的總能量［18-20］，發現人參皂苷Re 在環糊精結合時的主要作用力均為勢能，屬于分子間作用力，即為包合過程的驅動力［21-23］。

3.3 相溶解度圖繪制及參數計算 為了驗證分子動力學計算結果，測定客體分子人參皂苷Re 在環糊精中的相溶解度，在203 nm 波長處測定吸光度。以人參皂苷Re 質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝8 090.4X-1 190.1 （r＝0.999 5），在0.10～20 mg/mL 范圍內線性關系良好。取不同質量濃度人參皂苷Re 溶液適量，進樣分析，測得日內、日間峰面積RSD 均小于1%，表明該方法精密度良好。同一溶液在室溫下于0、6、12、24、48 取樣測定，測得峰面積RSD＜1%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。再以環糊精濃度為橫坐標，人參皂苷Re 濃度為縱坐標繪制相溶解度曲線，見圖3。

圖3 人參皂苷Re 與環糊精的相溶解度曲線Fig.3 Phase solubility curves for ginsenoside Re and cyclodextrins

由此可知，隨著環糊精濃度增加，人參皂苷Re 濃度升高，主體分子與人參皂苷Re 之間的包合比例為1 ∶1，均屬于AL型［12-15］。根據公式Ks＝Slope/S0（1-Slope） 計算環糊精與人參皂苷Re 的包合常數，其中S0表示水中不含環糊精時的人參皂苷Re 溶解度（在25、37 ℃下分別為0.426、0.517 mmol/L），再根據Ks計算吉布斯自由能ΔG，公式為ΔG＝-RTlnKs（R＝8.314 J/mol，T＝t＋273，t分別為25、37 ℃），見表2。

表2 人參皂苷Re 相溶解度參數Tab.2 Phase solubility parameters for ginsenoside Re

結果顯示，在不同溫度下各環糊精對人參皂苷Re 的相溶解度趨勢一致，均依次為伽馬環糊精＞貝塔環糊精＞羥丙基伽馬環糊精＞羥丙基貝塔環糊精＞阿爾法環糊精，即伽馬環糊精對該成分的包合效果最好； 貝塔環糊精對人參皂苷Re 的相溶解度低于伽馬環糊精，但高于羥丙基貝塔環糊精； 雖然羥丙基貝塔環糊精和羥丙基伽馬環糊精在結構上均有親水的結構羥丙基，但對該成分的包合作用并沒有增加。對比圖1 可知，由于受到羥丙基空間位阻的影響，阻止了人參皂苷Re 在空腔內的嵌合，故羥丙基貝塔環糊精對該成分的包合能力變差，進一步印證了理論計算結果與實驗測定結果的一致性。

另外，阿爾法環糊精、貝塔環糊精在37 ℃下相溶解度分別是在25 ℃下的1.02、1.09 倍，而羥丙基貝塔環糊精、羥丙基伽馬環糊精分別增加至1.57、1.68 倍，表明升高包合反應溫度有利于包合過程，與理論計算結果一致。

4 討論與結論

5 種主體分子環糊精均可與人參皂苷Re 自發形成包合過程，并且溫度升高有利于包合反應形成，其中伽馬環糊精、貝塔環糊精的包合能力更強，是理想的包合材料，而溶解度更好的羥丙基伽馬環糊精、羥丙基貝塔環糊精由于空間位阻的影響導致包合能力降低。本實驗采用ONIOM 分層算法優化主客體分子的包合過程，既保持了量子力學中從頭計算方法在性質預測和反應計算中的可靠性，又具備了分子力學在大分子體系中計算快速的特性，所得結果與實際檢測情況一致，表明可通過Gaussian 計算方法來對包合過程反應趨勢和包合能力進行預測。

綜上所述，本實驗采用理論計算結合實驗研究來對人參皂苷Re 與5 種常見環糊精的包合過程進行考察，獲得清晰的主-客體包合模式，并分別在理論和實驗層面闡述伽馬環糊精改善人參皂苷Re水溶性、穩定性的優勢，可為超分子藥物定量構效關系的探討提供理論依據和實驗參考。