基于自噬途徑探討銀杏葉提取物對老年性聾大鼠的保護作用

王青玲，張夢嫻，周潁東，康浩然，郭向東*，王慶林

（1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000； 3.河南醫學高等?？茖W校，河南 鄭州 451191）

老年性聾是老年人最常見的一種感覺障礙，其發病機制十分復雜，迄今為止尚無有效措施減輕耳蝸細胞的損傷，改善聽覺功能的預后［1-2］。老年性聾的病理改變主要是耳蝸內毛細胞 （inner hair cell，IHC）、外毛細胞（outer hair cell，OHC）、血管紋 （stria vascularis，SV）、螺旋韌帶 （spiral ligament，SL）、螺旋神經節細胞 （spiral ganglion cells，SGC） 等變性［3］，但其發病機制尚未闡明。既往研究表明，自噬對耳蝸的發育和功能成熟起重要作用，上調可減輕耳蝸細胞損傷，防止聽力下降，而下調可能是導致耳蝸細胞衰老失活的重要原因之一［4］。

銀杏葉提取物已被廣泛應用于臨床，多項專家共識指出它對突發性聾、耳源性眩暈、神經血管性疾病等具有較好的臨床療效，對于延緩老年性聾也有一定的作用［5-6］，實驗研究也證實其可通過調節耳蝸細胞自噬與凋亡來減輕噪聲性耳聾。因此，本實驗通過建立老年性聾大鼠模型，觀察銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸組織形態學和聽功能的影響，以及對耳蝸組織中自噬相關蛋白的調節作用，深入探究其延緩耳蝸細胞衰老的機制，以期為臨床治療老年性聾提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 聽閾正常的雄性SPF 級SD 大鼠45 只，8 周齡，體質量（220±10） g，由鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場提供［實驗動物生產許可證號SCXK（豫） 2019-0002，合格證號4109812011000 11477］，飼養于河南中醫藥大學實驗動物中心［實驗動物使用許可證號SYXK （豫） 2017-0001］，SPF級飼養環境，室內溫度（24±3）℃，自由飲食和攝水，實驗前適應性飼養1 周。研究方案經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準 （倫理號DWLL202203009），實驗過程遵循實驗室規則，對實驗動物遵循3R 原則給予人道關懷和保護。

1.2 試劑與藥物 BCA 試劑盒、2.5% 戊二醛、DAPI 溶液 （北京索萊寶科技有限公司，批號PC0021、P1126、C0060）； 10%水合氯醛（廣州艾肯曼生物科技有限公司，批號DM0001）； Beclin1、LC3、P62 抗體 （ 美國 GeneTex 公司，批號GTX55535、GTX127375、GTX128171）； Myosin-Ⅶa 抗體（美國Protrus BioSciences 公司，批號25-6790）； Alexa Flour 488 抗體（美國Jackson 公司，批號111-545-003）； 內參抗體GAPDH、SDS-PAGE快速凝膠試劑盒［攸碧艾（上海） 貿易有限公司，批號UBI6010、UBI3002］。銀杏葉提取物（金納多，臺灣濟生醫藥生技股份有限公司，批號HC20090014）。

1.3 儀器 聽覺誘發電位儀（美國智聽公司）；JY-BMB 型石蠟包埋機、JY-QPC 冷凍切片機（湖北錦源醫療科技有限公司）； RM2135 型輪轉切片機（德國徠卡公司）； KD-P 型攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）； PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）； DGG-9123A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）； 3K15 型低溫高速離心機（美國Sigma公司）； VE-186 型轉膜儀、EPS300 型電泳儀、VE-180 型電泳槽、VE-186 型轉膜儀（上海天能科技有限公司）； JEM-1400 型透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 45 只大鼠隨機分為對照組、模型組和銀杏葉提取物低、中、高劑量組（10、20、30 mg/kg），每組9 只，對照組大鼠每天皮下注射500 mg/kg 生理鹽水，模型組和銀杏葉提取物各劑量組大鼠每天皮下注射500 mg/kgD-gal，連續8 周。8 周后，銀杏葉提取物低、中、高劑量組大鼠腹腔注射10、20、30 mg/kg 銀杏葉提取物，對照組和模型組大鼠腹腔注射等體積0.9%生理鹽水，每天1 次，連續8 周。

2.2 聽性腦干誘發電位（ABR） 閾值檢測 大鼠麻醉后連接電極，以Tone 為刺激音，從80 dBSPL開始以10 dBSPL 遞減，接近閾值時以5 dBSPL 遞減，分別記錄4、8、16、24、32 kHz 頻率對短純音刺激的反應，直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激強度確定反應閾值。

2.3 HE 染色觀察耳蝸組織病理學 耳蝸組織經固定、脫鈣、梯度脫水、包埋、連續切片、烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、伊紅復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片后，在光學顯微鏡下用Image View 進行拍照，并對底回耳蝸毛細胞、血管紋、螺旋神經節細胞等形態和數量變化進行記錄。

2.4 免疫熒光染色觀察耳蝸內外毛細胞數 分離耳蝸基底膜，鋪片，10%山羊血清封閉通透，4 ℃冰箱放置過夜，一抗（rabbit anti-Myosin-Ⅶa） 孵育過夜，二抗（Alexa Flour 488 donkey anti-rabbit）避光孵育2 h，DAPI 室溫孵育15 min，抗猝滅甘油（Fluoromount-GTM） 封片，采用Image View 進行拍照，在熒光顯微鏡下分別對各組大鼠耳蝸底回100 μm 內外毛細胞存活數進行計數。

2.5 透射電子顯微鏡觀察耳蝸毛細胞超微結構耳蝸置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定24 h，脫鈣1 周，取下基底膜，1%鋨酸4 ℃固定2 h，梯度乙醇浸沒，丙酮脫水，將組織包埋在環氧樹脂中，進行超薄切片，切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染色20 min，水洗，烘干，使用透射電子顯微鏡拍照。

2.6 Western blot 法檢測耳蝸組織Beclin1、LC3、P62 蛋白表達 液氮冷凍耳蝸組織，取下其蝸軸與基底膜，稱取20 μg 組織用勻漿機破碎，加入250 μL 裂解液，冰上裂解10 min，離心30 min，取上清，按照BCA 試劑盒說明書進行蛋白定量后加熱變性。制備凝膠，蛋白樣本經電泳、轉膜、封閉后，加入Beclin1 （1 ∶1 500）、LC3 （1 ∶1 500）、P62 （1 ∶1 500） 和GAPDH （1 ∶1 000） 一抗工作液，在4 ℃冰箱中孵育過夜，次日洗膜后加入HRP 標記的二抗（1 ∶1 000），在搖床上孵育2 h，洗膜后滴加ECL 超敏發光液，通過Image Lab 成像系統顯影，采用Image J 軟件對蛋白條帶的灰度值進行測量，以GAPDH 為內參計算目的蛋白相對表達。

2.7 統計學分析 通過SPSS 25.0、GraphPad Prism 8 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗； 方差不齊時，采用Dunnett多重比較檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠ABR 閾值的影響 治療前，與對照組比較，其余4 組ABR 閾值在4、8、16、24、32 kHz 時均提高（P＜0.01），并且組間無差異（P＞0.05），見圖1A。治療后，與模型組比較，銀杏葉提取物各劑量組ABR 閾值在4、8、16、24、32 kHz 時均降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量組低頻4、8 kHz 時對聽力的改善程度最佳，見圖1B。

圖1 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠ABR 閾值的影響（±s，n＝9）Fig.1 Effects of G.biloba extract on ABR threshold of presbycusis in rats （±s，n＝9）

3.2 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸病理形態的影響 對照組毛細胞、血管紋、螺旋神經節細胞等形態均正常，輪廓清晰，胞漿飽滿，胞核排列整齊、均勻一致； 與對照組比較，模型組毛細胞及纖維斷裂、折疊、丟失，血管紋厚度萎縮 （P＜0.01），螺旋韌帶密度降低，螺旋神經節細胞出現大量丟失（P＜0.01），螺旋神經節細胞出現大量空泡樣變，細胞核變形、溶解、甚至消失； 與模型組比較，銀杏葉提取物低劑量組耳蝸細胞形態變化不明顯，中、高劑量組毛細胞形態改善，血管紋厚度增加（P＜0.01），螺旋韌帶形態逐漸趨于正常，螺旋神經節細胞數量增多（P＜0.01），并且胞漿飽滿，細胞核逐漸變大，空泡樣變性逐漸減輕，見圖2、表1。

表1 各組大鼠耳蝸血管紋厚度和螺旋神經節細胞數量比較（±s，n＝9）Tab.1 Comparison of thicknesses of cochlear stria and number of spiral ganglion cells in rats of each group （±s，n＝9）

表1 各組大鼠耳蝸血管紋厚度和螺旋神經節細胞數量比較（±s，n＝9）Tab.1 Comparison of thicknesses of cochlear stria and number of spiral ganglion cells in rats of each group （±s，n＝9）

注： 與對照組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別血管紋厚度/μm 螺旋神經節細胞數量/個對照組52.56±5.8746.15±2.25模型組20.85±4.79△△21.86±1.96△△銀杏葉提取物低劑量組21.17±3.2622.65±2.92銀杏葉提取物中劑量組40.75±6.83＃＃31.53±1.68＃＃銀杏葉提取物高劑量組42.85±4.62＃＃37.27±0.53＃＃

圖2 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸病理形態的影響（×200）Fig.2 Effects of G.biloba extract on pathological morphology of cochlea in presbycusis rat models （×200）

3.3 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸毛細胞形態及存活數的影響 本實驗中Myosin-Ⅶa 抗體在毛細胞胞漿中表達呈綠色熒光，DAPI 為細胞核染色呈藍色熒光，Merge 為毛細胞胞漿、胞核組合呈藍綠色熒光。圖3 顯示，對照組一排內毛細胞和三排外毛細胞的胞核及胞漿排列整齊，輪廓清晰，結構規整； 模型組大量外毛細胞和部分內毛細胞丟失、壞死，毛細胞存活數降低（P＜0.01），殘存的內、外毛細胞形態變性、結構紊亂，細胞間出現融合； 與模型組比較，銀杏葉提取物各劑量組內、外毛細胞形態均有所改善，存活數均提高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸毛細胞形態和存活數的影響（×200，±s，n＝9）Fig.3 Effects of G.biloba extract on morphology and survival number of cochlear hair cells in presbycusis rat models （×200，±s，n＝9）

3.4 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸毛細胞超微結構的影響 對照組大鼠耳蝸毛細胞的超微結構正常，自噬小體數量較多，胞漿內線粒體、高爾基體、內質網等細胞器結構均完整，密度均一； 與對照組比較，模型組毛細胞超微結構嚴重破壞，自噬小體數量減少（P＜0.01），胞漿內線粒體密度降低，出現空泡樣變，并且高爾基體、內質網等細胞器溶解、消失； 與模型組比較，銀杏葉提取物低劑量組變化不明顯，中、高劑量組毛細胞超微結構逐漸改善，自噬小體數量逐漸增多（P＜0.05，P＜0.01），胞漿內線粒體等細胞器結構改善，見圖4。

圖4 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸毛細胞超微結構的影響（±s，n＝9）Fig.4 Effects of G.biloba extract on ultrastructure of cochlear hair cells in presbycusis rat models （±s，n＝9）

3.5 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3、P62 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均降低（P＜0.01），P62 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，銀杏葉提取物各劑量組大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高（P＜0.05，P＜0.01），P62蛋白表達降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 銀杏葉提取物對老年性聾大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3、P62 蛋白表達的影響（±s，n＝9）Fig.5 Effects of G.biloba extract on protein expressions of Beclin1，LC3 and P62 in cochlea of presbycusis rat models（±s，n＝9）

4 討論

老年性聾是由耳蝸和聽覺中樞的年齡相關性退化引起的，其病理因素與耳蝸細胞的變性密切相關［7］。隨著機體老化，毛細胞及血管紋變性，可能引起螺旋神經節細胞損傷，進而導致聽力減退［8］。到目前為止，老年性聾的發病機制尚不完全清楚，耳蝸細胞自噬功能異?？赡苁抢夏晷悦@主要發病機制之一［9-11］。衰老耳蝸中，自噬功能障礙，導致耳蝸細胞受損，聽功能減退［12］。因此，尋求有效提高自噬功能的藥物，可能對減輕耳蝸細胞變性，延緩聽力損失有重要意義。

銀杏葉提取物對多種內耳疾病有較好的臨床療效［13-14］。袁海虹等［15］發現，銀杏葉提取物可通過提高自噬功能，上調視網膜缺血-再灌注損傷后細胞存活率。近期，郭濤等［16］發現，銀杏葉提取物可上調自噬功能來緩解腦卒中。鑒于此，本課題組推測銀杏葉提取物可能是通過調控自噬水平來延緩聽覺細胞衰老的。本研究采用ABR 來檢測老年性聾聽閾的變化發現，與對照組比較，模型組大鼠不同頻率ABR 閾值均提高； 經不同劑量銀杏葉提取物給藥后，ABR 閾值均降低，表明銀杏葉提取物可改善老年性聾大鼠的聽閾。本研究病理結果與既往研究相吻合［17］。對照組大鼠毛細胞、血管紋、螺旋神經節細胞等形態正常； 與對照組比較，模型組大鼠毛細胞、血管紋、螺旋神經節細胞等損傷；經銀杏葉提取物干預后，以上細胞的形態改善。免疫熒光染色結果發現，與對照組比較，模型組內、外毛細胞存活數降低； 經不同劑量銀杏葉提取物干預后，內、外毛細胞存活數均提高。

Beclin1、LC3、P62 均是自噬過程中的關鍵標志物，常用于評估自噬的活性程度［18］。Yuan等［19］研究表明，與青年大鼠比較，老年大鼠聽皮層的自噬流受阻，LC3 和Beclin1 蛋白表達降低，導致老化大鼠聽力損失。He 等［20］研究發現，新霉素導致耳蝸毛細胞中Beclin1 和LC3 表達降低，P62 大量聚集，誘導毛細胞損傷。為了進一步探討銀杏葉提取物是否通過調控耳蝸細胞自噬對老年性聾發揮保護作用，本研究觀察了耳蝸毛細胞自噬小體并檢測了Beclin1、LC3、P62 蛋白表達情況。結果發現，與對照組比較，模型組大鼠耳蝸毛細胞中自噬小體數量減少，耳蝸組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，P62 蛋白表達升高； 而經不同劑量銀杏葉提取物干預后，自噬小體數量逐漸增加，Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62 蛋白表達降低。

綜上所述，自噬是探索老年性聾發病機制的新視角，老年性聾大鼠耳蝸組織的自噬水平降低，而銀杏葉提取物可修復受損的耳蝸細胞形態，延緩聽覺細胞的衰老，改善老年性聾大鼠的聽功能，其機制可能與調控耳蝸組織中Beclin1、LC3Ⅱ和p62 蛋白表達，上調自噬有關。