馬鞭草苯乙醇苷類成分研究

李 潔，董丹陽(yáng)，彭財(cái)英，楊 琴，劉建群，舒積成

（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004）

馬鞭草是一種多年生的草本植物，別名風(fēng)頸草、鐵馬鞭、馬鞭稍、野荊芥等，始載于《名醫(yī)別錄》，原產(chǎn)于熱帶美洲，在全球分布較廣，中國(guó)南方地區(qū)有種植。2020 年版《中國(guó)藥典》 載有馬鞭草，其味苦，性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有散瘀活血、補(bǔ)肝益腎、利水消腫、退黃、截瘧等功效，常用于治療癥瘕積聚、痛經(jīng)經(jīng)閉、癰腫、喉痹、水腫、黃疸、肝炎、瘧疾等病癥。馬鞭草主要含有環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷、黃酮、三萜、甾醇等化合物［1-3］，現(xiàn)代藥理研究表明，苯乙醇苷類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、保肝等作用［4-6］； 馬鞭草提取物可以抑制肝炎病毒［7-8］，臨床上亦有治療病毒性肝炎的案例［9-10］。課題組前期研究顯示，馬鞭草乙酸乙酯化學(xué)部位對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟具有保護(hù)作用。據(jù)此，本研究對(duì)馬鞭草乙酸乙酯部位中苯乙醇苷成分進(jìn)行分離，從中得到9 個(gè)苯乙醇苷，可為其深入研究提供依據(jù)。

1 材料

EASY-Nlc1000 LTQ-Orbitrap Elite 型串聯(lián)質(zhì)譜（美國(guó)賽默飛世爾公司）； AVANCE III HD 600 MHz型、AVANCE Ⅲ500 MHz 型核磁共振波譜儀（四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，瑞士布魯克公司）； 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）； LC-100 型制備液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）； C18半制備型色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，北京慧德易科技有限責(zé)任公司）； N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （日本EYELA 公司）； SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（杭州庚雨儀器有限公司）； Sephadex LH-20 （美國(guó)法瑪西亞公司）； ZF-20D 型暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）； GF254薄層硅膠板、柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司）； BS224S型萬分之一電子天平［賽多利斯（北京） 生物科技有限公司］。試劑為分析純或色譜純（西隴科學(xué)股份有限公司）； 水為雙蒸水。

馬鞭草購(gòu)于安徽毫州，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定為馬鞭草VerbenaofficinalisL.的干燥地上部分。

2 提取與分離

取馬鞭草25 kg，用8 倍量80%乙醇回流提3次，第1 次3 h，后2 次2 h，合并提取液，得浸膏2 658.7 g。取2 650 g，用適量雙蒸水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，回收溶劑，得石油醚部位686.81 g、乙酸乙酯部位400.82 g、正丁醇部位696.91 g。

取乙酸乙酯部位400 g，經(jīng)200 ～300 目硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～5 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識(shí)，合并相同流分，得到Fr.1 ～Fr.25。Fr.22 （28.49 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（50 ∶1、30 ∶1、20 ∶1、10 ∶1） 梯度洗脫，合并相同流分，得到Fr.22-1 ～Fr.22-25，F(xiàn)r.22-24（3.32 g） 經(jīng)Sephadex LH-20 分離，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶1） 洗脫，TLC 檢識(shí)，合并相同流分，得到Fr.22-24-1 ～Fr.22-24-7，F(xiàn)r.22-24-4 （0.76 g）經(jīng)半制備HPLC 純化，以45%、38%甲醇洗脫（檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物2～3 （10.2 mg，tR＝39.92 min）、1 （9.7 mg，tR＝64.13 min）。Fr.25 （12.06 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（8 ∶1、5 ∶1、3 ∶1、2 ∶1） 梯度洗脫，得到Fr.25-1 ～Fr.25-18，F(xiàn)r.25-9 （6.79 g）經(jīng)Sephadex LH-20 分離，以甲醇純化，得到Fr.25-9-1 ～Fr.25-9-10，F(xiàn)r.25-9-8 （5.88 g） 經(jīng)半制備HPLC 純化，以35%甲醇洗脫（檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物4 （689.2 mg，tR＝22.39 min）、5 （58.7 mg，tR＝40.72 min）；Fr.25-9-7 （0.39 g） 經(jīng)半制備HPLC 純化，以33%甲醇洗脫（檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物6 （7.2 mg，tR＝27.64 min）、9（9.1 mg，tR＝36.28 min）； Fr.25-9-10 （0.14 g）經(jīng)半制備HPLC 純化，以42% 甲醇洗脫（檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物8（6.8 mg，tR＝14.34 min）、7 （13.5 mg，tR＝19.71 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 淡黃色無定型粉末 （甲醇），UV（CH3OH）λmax227、238、298、324 nm，顯示與苯乙醇苷類似吸收［11］。HR-ESI-MS 顯示該化合物的準(zhǔn)離子峰為m/z1 287.470 2 ［M ＋H］＋（計(jì)算值1 287.479 6），結(jié)合13C-NMR 數(shù)據(jù)（表1），推測(cè)分子式為C62H78O29。1H-NMR （表1） 顯示有1 對(duì)反式偶合雙鍵質(zhì)子［δH7.62 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-15），6.36 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-16）］、6個(gè)芳香質(zhì)子（歸屬于2 組ABX 偶合系統(tǒng)） ［δH7.13 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），7.00 （1H，dd，J＝1.9，8.2 Hz，H-14），6.78 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-13），6.69 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.67 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.61 （1H，dd，J＝2.0，8.2 Hz，H-6）］、2 個(gè)糖的端基質(zhì)子［δH5.18 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-24），4.33（1H，d，J＝7.9 Hz，H-18）］。在HMBC 譜中（圖1），葡萄糖端基質(zhì)子（δH4.33） 與苷元C-8（δC72.4） 有偶合相關(guān)，葡萄糖C-6 質(zhì)子 （δH4.37，4.50） 與肉桂酰C-9 （δC169.9，169.2） 有相關(guān)，葡萄糖C-3 （δC84.5，84.0） 與鼠李糖端基質(zhì)子（δH5.18） 有遠(yuǎn)程相關(guān)，2 個(gè)甲氧基 （δH3.85，3.75） 分別與肉桂酰 C-3 （δC151.6，151.6） 和苷元C-3 （δC147.5，147.5） 有偶合相關(guān)，上述信息顯示，化合物1 的氫譜和片段連接方式與廣防風(fēng)苷A 相似（同時(shí)在本次分離中得到，為化合物3）。然而，在13C-NMR 中顯示近乎2 套廣防風(fēng)苷A 的碳信號(hào)，前期亦有苯乙醇苷二聚體的報(bào)道［12-13］，提示化合物1 可能為廣防風(fēng)苷A 的二倍體，質(zhì)譜顯示其分子量為1 286，將近2 倍于廣防風(fēng)苷A，進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)。對(duì)比化合物1、3 碳信號(hào)，最顯著的差異是肉桂酰片段C-3、C-4 位的化學(xué)位移，結(jié)合分子式和文獻(xiàn)［14］，提示化合物1 是由2 個(gè)廣防風(fēng)苷A 通過個(gè)肉桂酰基片段的C-4 位相連而形成苯乙醇苷二倍體。綜上所述，化合物1 為一個(gè)新的苯乙醇苷二倍體，命名為verbofficoside A。

圖1 化合物1 結(jié)構(gòu)式及關(guān)鍵HMBC 關(guān)聯(lián)（H→C）Fig.1 Structural formula and key HMBC correlation of compound 1 （H→C）

表1 化合物1、3 的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compounds 1 and 3

化合物2： 淡黃色無定形粉末（甲醇），ESIMSm/z： 653.2 ［M ＋H］＋，分子式C31H40O15。1HNMR （600 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.67 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-7′），7.21 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2′），7.09 （1H，dd，J＝8.2，1.9 Hz，H-6′），6.83 （2H，dd，J＝8.2，5.4 Hz，H-5′），6.75（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2），6.70 （1H，dd，J＝8.2，2.1 Hz，H-6），6.39 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-8′），5.21 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-rham-1），4.39 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-glc-1），3.32 ～3.96（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），3.90（3H，s，-OCH3），3.82 （3H，s，-OCH3），2.87（2H，t，J＝7.2 Hz，H-7），1.11 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （150 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元132.9 （C-1），117.1 （C-2），147.5（C-3），147.4 （C-4），112.9 （C-5），121.2 （C-6），36.5 （C-7），72.3 （C-8），56.4 （-OCH3）；酯127.7 （C-1′），111.8 （C-2′），149.4 （C-3′），150.8 （ C-4′），116.5 （ C-5′），124.4 （ C-6′），147.9 （ C-7′），115.1 （ C-8′），168.3 （ C-9′），56.5 （-OCH3）； 葡萄糖104.2 （C-1），76.2 （C-2），81.5 （C-3），70.6 （C-4），76.0 （C-5），62.4 （C-6）； 鼠李糖103.0 （C-1），72.1 （C-2），72.1 （C-3），73.8 （C-4），70.4 （C-5），18.4（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為肉蓯蓉苷D。

化合物3： 淡黃色無定形粉末（甲醇），ESIMSm/z： 653.2 ［M ＋H］＋，分子式C31H40O15。1HNMR （600 MHz，CH3OH-d4） 顯示出1 對(duì)反式偶合雙鍵質(zhì)子［δH7.64 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-15），6.36 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-16）］，6 個(gè)芳香質(zhì)子（歸屬于2 組ABX 偶合系統(tǒng)） ［δH7.16（1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），7.02 （1H，dd，J＝1.9，8.3 Hz，H-14），6.81 （1H，d，J＝8.3 Hz，H-13），6.69 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.67（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.61 （1H，dd，J＝2.0，8.2 Hz，H-6）］，2 個(gè)糖的端基質(zhì)子 ［δH4.34 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-18），5.19 （1H，d，J＝1.5 Hz，H-24）］，2 個(gè)苯乙醇苷元位的特征信號(hào)質(zhì)子［δH2.82 （2H，t，J＝7.2 Hz，H-7）］；13C-NMR （150 MHz，CH3OH-d4） 顯示31 個(gè)碳信號(hào)，芳香碳有15 個(gè)，其中δC169.1 為羧基碳信號(hào)，δC104.4 和δC102.7 分別為2 個(gè)糖上的端基碳信號(hào)，δC56.6 為甲氧基的碳信號(hào)。1H-NMR 和13CNMR 數(shù)據(jù)見表1，與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為廣防風(fēng)苷A。

化合物4： 棕黃色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：625.2 ［M＋H］＋，分子式C29H36O15。1H-NMR （600 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.59 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-7′），7.06 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2′），6.95（1H，dd，J＝8.2，1.9 Hz，H-6′），6.78 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5′），6.70 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），6.68 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.56（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.27 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-8′），5.19 （1H，d，J＝1.5 Hz，H-rham-1），4.92 （1H，t，J＝9.5 Hz，H-glc-4），4.37 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-glc-1），2.30 ～3.92（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），2.79（2H，t，J＝7.0 Hz，H-7），1.09 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （150 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元131.4 （C-1），116.3 （C-2），146.1（C-3），144.6 （C-4），117.1 （C-5），121.3 （C-6），36.5 （C-7），72.3 （C-8）； 酯127.6 （C-1′），115.2 （ C-2′），146.8 （ C-3′），149.8 （ C-4′），116.5 （ C-5′），123.2 （ C-6′），114.7 （ C-7′），148.0 （C-8′），168.3 （C-9′）； 葡萄糖104.2 （C-1），76.0 （C-2），81.6 （C-3），70.6 （C-4），76.2 （C-5），62.3 （C-6）； 鼠李糖103.0 （C-1），72.0 （C-2），72.2 （C-3），73.8 （C-4），70.4（C-5），18.4 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為毛蕊花糖苷。

化合物5： 棕色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：625.2 ［M＋H］＋，分子式C29H36O15。1H-NMR （600 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.57 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-7′），7.04 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.89（1H，dd，J＝2.0，8.2 Hz，H-6′），6.78 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5′），6.68 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），6.64 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.54（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.30 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-8′），5.18 （1H，brs，H-rham-1），4.34 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），3.34 ～4.51（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），2.79（2H，t，J＝7.0 Hz，H-7），1.25 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （150 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元131.4 （C-1），116.3 （C-2），146.1（C-3），144.6 （C-4），117.1 （C-5），121.3 （C-6），36.7 （C-7），73.4 （C-8）； 酯127.7 （C-1′），115.1 （ C-2′），147.3 （ C-3′），149.6 （ C-4′），116.6 （ C-5′），123.2 （ C-6′），114.8 （ C-7′），146.8 （C-8′），169.1 （C-9′）； 葡萄糖104.4 （C-1），75.7 （C-2），83.9 （C-3），70.4 （C-4），75.4 （C-5），64.6 （C-6）； 鼠李糖102.7 （C-1），72.3 （C-2），72.2 （C-3），74.0 （C-4），70.0（C-5），17.9 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為異毛蕊花糖苷。

化合物6： 淺棕色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：639.2 ［M＋H］＋，分子式C30H38O15。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.65 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-7′），7.08 （1H，brs，H-2′），7.02 （1H，dd，J＝8.5 Hz，H-6′），6.81 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），6.72 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.69（2H，m，H-2，6），6.36 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-8′），5.19 （1H，brs，H-rham-1），4.37 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），3.29 ～4.03 （12H，m，rham-2 ～ 5，H-8，glc-2 ～ 6），3.83 （ 3H，s，-OCH3），2.80 （2H，m，H-7），1.09 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-rham-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為肉蓯蓉苷C。

化合物7： 淡黃色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：489.2 ［M＋H］＋，分子式C21H28O13。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.54 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-7′），7.02 （1H，brs，H-2′），6.91 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6′），6.74 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5′），6.23 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-8′），5.09（1H，brs，H-rham-1），4.52 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），1.05 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OH-d4）δ： 酯127.9（C-1′），115.5 （ C-2′），148.2/148.1 （ C-3′），149.9 （ C-4′），116.8 （ C-5′），123.5 （ C-6′），146.9 （ C-7′），115.1/114.9 （ C-8′），168.7/168.6 （C-9′）； 葡萄糖98.3/94.2 （C-1），74.9/70.9 （C-2），81.9/79.4 （C-3），70.6 （C-4），77.5/76.2 （C-5），62.7/62.6 （C-6）； 鼠李糖103.2 （C-1），71.4 （C-2），72.3 （C-3），74.0（C-4），70.6 （C-5），18.6 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為肉蓯蓉苷F。

化合物8： 白色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：463.2 ［M＋H］＋，分子式C20H30O12。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 6.80 ～6.67 （2H，m，H-2，5），6.60 （1H，brd，J＝8.0 Hz，H-6），5.19（1H，brs，H-rham-1），4.45 （1H，d，J＝9.0 Hz，H-glc-1），3.21 ～3.96 （12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2～6），2.80 （2H，m，H-7），1.28 （3H，brs，H-rham-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OH-d4）δ： 苷元131.7 （C-1），117.4 （C-2），146.2 （C-3），144.8 （C-4），116.6 （C-5），121.5 （C-6），36.7 （C-7），72.5 （C-8）； 葡萄糖104.3 （C-1），77.9 （C-2），84.7 （C-3），70.4 （C-4），75.8（C-5），62.9 （C-6）； 鼠李糖102.9 （C-1），72.4（C-2），72.3 （C-3），74.2 （C-4），70.3 （C-5），18.1 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為去咖啡酰基毛蕊花苷。

化合物9： 無色油狀（甲醇），ESI-MSm/z：593.2 ［M＋H］＋，分子式C29H36O13。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.49 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-7′），7.16 （4H，m，H-2 ～6），7.07 （1H，m，H-4），6.96 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.85（1H，dd，J＝2.0，8.0 Hz，H-5′），6.68 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6′），6.17 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-8′），5.10 （1H，brs，H-rham-1），4.28（1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），3.18 ～4.02（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），2.84（2H，t，J＝7.0 Hz，H-7），0.98 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元140.3 （C-1），129.6 （C-2），130.3（C-3），127.5 （C-4），130.3 （C-5），129.6 （C-6），37.5 （C-7），72.6 （C-8）； 酯127.9 （C-1′），115.0 （ C-2′），150.0 （ C-3′），147.1 （ C-4′），116.8 （ C-5′），123.5 （ C-6′），115.6 （ C-7′），148.3 （C-8′），168.6 （C-9′）； 葡萄糖104.5 （C-1），76.4 （C-2），81.9 （C-3），70.7 （C-4），76.3 （C-5），62.7 （C-6）； 鼠李糖103.3 （C-1），72.3 （C-2），72.6 （C-3），74.1 （C-4），70.9（C-5），18.7 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為jionoside C。

4 討論

本研究從馬鞭草乙酸乙酯部位中分離鑒定出9個(gè)苯乙醇苷類化合物，包括1 個(gè)新的苯乙醇苷二倍體，化合物3、6 ～9 均為首次從該植物中分離得到，進(jìn)一步豐富了馬鞭草中苯乙醇類化學(xué)成分庫(kù)。苯乙醇苷具有保肝活性［5］，課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明馬鞭草乙酸乙酯化學(xué)部位對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟具有保護(hù)作用，故該類成分可能為馬鞭草抗肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。課題組后續(xù)也將對(duì)含量較高的苯乙醇苷類化合物開展保肝活性實(shí)驗(yàn)，以期進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論。

常規(guī)苯乙醇苷（如廣防風(fēng)苷A） 及其二倍體（廣防風(fēng)苷A 二倍體） 的反相色譜行為差異較大，后者保留時(shí)間明顯長(zhǎng)于前者（色譜條件一致，廣防風(fēng)苷A 為39.9 min，而廣防風(fēng)苷A 二倍體為64.1 min）。另外，通過肉桂酰基片段C-4 相連而形成的廣防風(fēng)苷A 二倍體在NMR 中有明顯特征，1H-NMR 譜僅顯示單個(gè)廣防風(fēng)苷A 相似數(shù)據(jù)，而13C-NMR 譜卻顯示了2 套廣防風(fēng)苷A 碳信號(hào)，可能是13C-NMR 譜較1H-NMR 譜分辨更高的緣故，上述現(xiàn)象為后續(xù)目標(biāo)分離和鑒定類似苯乙醇苷二倍體衍生物提供了參考。