桑葚中性多糖結(jié)構(gòu)及其對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

劉富饒，郭子萌，任 婷，李 波，吳 巍，李 慧，焦麗麗*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117； 2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

氧化應(yīng)激是機(jī)體受到不良刺激時(shí)，產(chǎn)生的過量自由基超出細(xì)胞抗氧化防御能力，造成機(jī)體氧化與抗氧化作用失衡的現(xiàn)象。持續(xù)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和DNA 損傷，引發(fā)衰老和肝損傷［1］。D-半乳糖誘導(dǎo)可加速活性氧（ROS） 的產(chǎn)生并使細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老［2］，為研究衰老的經(jīng)典模型。

張培麗等［3］發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC-12 細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。桑葚多糖可以改善細(xì)胞脂質(zhì)積累、內(nèi)源性抗氧化性防御能力從而起到抗氧化減緩衰老的作用［4］。已有研究證明了桑葚多糖的抗氧化活性，但其抗衰老的構(gòu)效關(guān)系并未闡明。桑葚中性多糖的分離及其對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型的抗氧化作用的研究也未見報(bào)道。基于此，本研究進(jìn)一步分離出桑葚中性多糖，初步檢測(cè)其一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過建立D-半乳糖致小鼠衰老模型，探討桑葚多糖對(duì)小鼠肝組織及血清抗氧化指標(biāo)的影響，以期為進(jìn)一步開發(fā)具有抗氧化能力的桑葚多糖產(chǎn)品和桑葚多糖構(gòu)效關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 DZKW 型電熱恒溫水浴鍋（天津天泰儀器有限公司）； Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；Ultimate 3000 型液相色譜系統(tǒng)、Nicolet5700 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司）； Inertsil ODS-3 型色譜柱（北京迪科馬科技有限公司）； Centrifuge 5810R 型離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）； SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （遼） 2020-0001，飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，溫度（21±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%。

1.3 試劑與藥物 桑葚購自吉林省中藥材商店，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王淑敏教授鑒定為正品。D（＋） -無水葡萄糖 （ 批號(hào) Y19F11J108781）、L-阿拉伯糖 （ 批號(hào)Z27O11H128825）、D-半乳糖（批號(hào)Z22J9H64187） 對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號(hào)20210518）、超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)20210518）、丙二醛（MDA，批號(hào)20210517）、過氧化氫酶可見光試劑盒（CAT，批號(hào)20210517） 均購自南京建成生物工程研究所； BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)20210713） 購自北京索萊寶科技有限公司。無水乙醇為分析純。

2 方法

2.1 提取與純化 參考文獻(xiàn)［5］ 報(bào)道，取干燥后的桑葚500 g，加入5 L 蒸餾水，沸水提取3 次，提取時(shí)間分別為3、2、2 h，合并提取液，120 目篩過濾，80 ℃水浴濃縮，加入無水乙醇使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%，室溫靜置24 h，收集沉淀，蒸餾水復(fù)溶后冷凍干燥，得到粗多糖。采用Sevag 法進(jìn)行脫蛋白，并采用截留分子量3 500 Da 的透析袋進(jìn)行透析，濃縮透析內(nèi)液，凍干得到桑葚多糖。

參考文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道，將桑葚多糖溶解于蒸餾水中，5 000 r/min 離心5 min，取上清液經(jīng)DEAE 纖維素進(jìn)一步分離，用蒸餾水洗脫，苯酚硫酸跟蹤檢測(cè)，Sepharose CL-6B色譜柱（2.6 cm×100 cm） 進(jìn)一步純化，用生理鹽水洗脫，體積流量0.5 mL/min，每管20 min，苯酚硫酸跟蹤檢測(cè)，收集多糖級(jí)分，糖液透析濃縮后冷凍干燥，得到桑葚中性多糖。

2.2 理化性質(zhì)測(cè)定 以D-葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-硫酸法測(cè)定純度，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定桑葚中性多糖中蛋白質(zhì)含量。

2.3 分子量測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定桑葚中性多糖的分子量分布［7］。UltiMate 3000 系統(tǒng)，配備示差折光檢測(cè)器和TSK-G3000 PWXL 色譜柱（7.8 mm×30.0 cm）； 流動(dòng)相超純水； 體積流量0.5 mL/min； 柱溫40 ℃； 進(jìn)樣量20 μL。以分子量5 250、9 750、13 050、36 800、64 650、135 350、300 600 Da 葡聚糖對(duì)照品的保留時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得分子量。

2.4 單糖組成測(cè)定 將多糖樣品（5 mg/mL，100 μL） 用三氟乙酸（2 mol/L，400 μL） 在水解瓶中120 ℃水解4 h，反復(fù)加入甲醇去除過量的三氟乙酸，真空干燥，經(jīng)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 衍生化后過0.22 μm 微孔水系濾膜。參考文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道，色譜條件為Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流動(dòng)相PBS （pH 7.0） -乙腈（82 ∶18）； 體積流量1.0 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.5 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定 將干燥后的桑葚中性多糖與溴化鉀粉末按照1 ∶200 比例均勻研磨，取適量壓成透明均勻薄片，收集4 000～500 cm-1范圍內(nèi)紅外光譜。

2.6 分組與給藥 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道，60 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組、桑葚中性多糖給藥組（10、100、200 mg/kg），空白組小鼠灌胃給予生理鹽水（0.1 mL/10 g），陽性組小鼠腹腔注射維生素C，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射D-半乳糖（1.35 g/kg） 進(jìn)行造模，同時(shí)給藥，連續(xù)7 周。

2.7 血清與組織樣品制備 末次給藥后，小鼠禁食12 h，摘眼球取血后脫頸椎處死，取肝臟、脾臟、腦組織。

2.7.1 血清 小鼠眼球取血后靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，吸取上清，-80 ℃保存，即得。

2.7.2 10%肝組織勻漿 小鼠肝組織-生理鹽水（1 ∶9）在冰浴條件下混合勻漿，勻漿液3 500 r/min 離心15 min，吸取上清，-80 ℃保存，即得。

2.8 SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px 活性及MDA 水平檢測(cè) 嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作，分別檢測(cè)各組小鼠血清和肝組織SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px 活性及MDA 水平，考察不同劑量桑葚中性多糖在血清和肝組織中對(duì)抗氧化作用相關(guān)指標(biāo)的影響。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，各組間樣品均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 理化性質(zhì)分析 經(jīng)水提、醇沉獲得桑葚粗多糖，收率為7.23%，經(jīng)超濾及色譜法進(jìn)一步分離后獲得中性多糖，其收率為19.15%，苯酚硫酸法檢測(cè)其純度為76.18%，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)其含痕量的蛋白（含量＜1%）。

3.2 分子量測(cè)定 以葡聚糖對(duì)照品保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝-0.355X＋9.811 （r＝0.995 0）。依據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得到中性多糖分子量為1.068×104Da。

3.3 單糖組成測(cè)定 經(jīng)完全酸水解及PMP 衍生檢測(cè)中性多糖的單糖組成，見圖1，可知主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為12.83 ∶1 ∶2.85。另外，中性多糖是以葡萄糖為主的中性雜多糖，其中葡萄糖含量高達(dá)76.9%。

圖1 桑葚中性多糖的單糖組成PMP-HPLC 色譜圖

3.4 紅外光譜分析（FT-IR） 由圖2 可知，3 404.69 cm-1處較寬吸收峰為中性多糖中-OH 伸縮振動(dòng)吸收峰；2 922.70 cm-1處為甲基或次甲基的C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰；1 632.35 cm-1處為羥基彎曲振動(dòng)吸收峰； 在1 740 cm-1附近沒有特征吸收峰，說明中性多糖不含糖醛酸［10］； 1 200 ～1 000 cm-1內(nèi)存在的吸收峰為多糖指紋圖譜，證明其為吡喃糖； 804.03、851.23 cm-1處吸收峰則表明中性多糖中同時(shí)含有α-糖苷鍵和β-糖苷鍵［11］。

圖2 桑葚中性多糖紅外光譜圖

3.5 桑葚中性多糖對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠氧化應(yīng)激的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清和肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組與100、200 mg/kg桑葚中性多糖組小鼠血清及肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖3 ～4。與模型組比較，200 mg/kg 桑葚中性多糖組小鼠血清中SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 酶活性分別升高49.2%、45.1%、94.5%、63.2%； 肝組織中SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 酶活性分別升高76.1%、54.9%、66.7%、25.8%，MDA 水平降低28.6%，而50 mg/kg 桑葚中性多糖組作用不明顯。由此可知，桑葚中性多糖能修復(fù)D-半乳糖誘導(dǎo)的抗氧化酶活性降低，并抑制MDA 的產(chǎn)生，進(jìn)而修復(fù)氧化損傷。

圖3 桑葚中性多糖對(duì)衰老小鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s，n＝10）

圖4 桑葚中性多糖對(duì)衰老小鼠肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s，n＝10）

4 討論

氧化損傷是指產(chǎn)生的過量自由基和活性氧堆積，超出細(xì)胞抗氧化防御能力，造成機(jī)體氧化與抗氧化作用失衡的現(xiàn)象，氧化損傷可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，誘發(fā)DNA 損傷、炎癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾等。抗氧化劑可以清除活性氧并抑制氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［12］。人工合成的酚類抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）、叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ） 在油脂儲(chǔ)存中被廣泛應(yīng)用，但其對(duì)人體存在一定的副作用［13］。與之相比，天然的抗氧化劑具有無毒、副作用的優(yōu)勢(shì)，越來越受到重視。抗氧化作用是多糖重要活性之一，多種植物多糖被證實(shí)具有抗氧化作用。

多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，其結(jié)構(gòu)特征如單糖組成、分子量分布、以及糖基排列順序等均能影響其生物活性。Huang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，多糖的抗氧化活性與其單糖的組成和比例關(guān)系密切。以往的研究發(fā)現(xiàn)酸性多糖具有良好抗氧化活性，其中糖醛酸或蛋白質(zhì)含量較高的多糖容易貢獻(xiàn)氫原子，從而發(fā)揮較好的抗氧化活性［15］。張佳琦［16］使用熱水提取桑葚多糖，并分利用不同濃度乙醇醇沉獲得酸性多糖MFPs-30-80，具有良好的抗氧化活性。但是，Ahmadi 等［17］和Li 等［18］研究也表明，多糖中的阿拉伯糖和半乳糖是抗氧化活性最重要的單位，含有阿拉伯半乳糖聚糖結(jié)構(gòu)域的多糖的抗氧化活力較為顯著［19］。而本研究利用沸水提取，80%乙醇醇沉和離子交換柱層析法從桑葚中獲得中性雜多糖，其主要由葡萄糖構(gòu)成，但同時(shí)含有約23%阿拉伯糖和半乳糖。利用D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，桑葚中性多糖能夠明顯修復(fù)由D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷。