加味百合地黃湯通過調控SDF-1/CXCR4 軸對圍絕經期抑郁癥大鼠下丘腦炎性損傷的改善作用

劉 洋，李翎熙，周 密，吳敏學，王宇紅，趙洪慶

（湖南中醫藥大學科技創新中心/中藥粉體與創新藥物國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208）

圍絕經期抑郁癥（perimenopausal depressive disorder，PDD） 是中老年女性常見的情感障礙性精神疾病，嚴重者會出現自閉、妄想、自殘、軀體化障礙等癥狀行為，嚴重影響患者生活質量。PDD 病理機制目前仍聚焦于神經內分泌的改變，即內分泌軸功能改變引發腦內神經遞質變化及神經傳導障礙［1］。炎癥激活是機體神經內分泌失衡后常見的繼發反應，但其在PDD 病理進程中的作用尚缺乏深入研究。小膠質細胞（microglia，MG） 主要調控機體神經免疫，是抑郁癥病理改變的重要結構基礎［2-3］。基質細胞衍生因子-1 （stromal cell-derived factor-1，SDF-1） 對MG 具有特殊趨化作用，其與趨化因子受體-4 （chemokine receptor-4，CXCR4） 結合后生理狀態下能促進神經元發育與受損神經元修復，但當其過度表達后可參與MG-神經元相互作用引起神經炎癥微環境，導致抑郁癥狀產生［4］。

加味百合地黃湯以《金匱要略》 百合地黃湯為基礎加味而成，具有補益氣血、調和陰陽、活血安神的功效，主治婦女圍絕經期抑郁、焦慮、失眠病證，與原方相比，其活血清心之力更甚，兼具補益之功，與中醫抗PDD 病機更為契合。該方能改善PDD 模型大鼠的抑郁樣行為，調節雌激素水平，抑制下丘腦-垂體-卵巢（HPO） 軸功能紊亂，增加腦內雌激素受體表達，但具體機制尚不明確。本研究將圍繞神經炎癥探討加味百合地黃湯治療PDD 的作用機理，為其后續應用提供理論支撐。

1 材料

1.1 動物 60 只SPF 級健康雌性SD 大鼠，體質量200 ～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （湘） 2019-0004］，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心［實驗動物使用許可證號SYXK （湘）2019-0009］。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理號LLBH-202206280001）。

1.2 藥物 加味百合地黃湯由百合30 g、生地黃9 g、麥冬9 g、蘇葉6 g、夜交藤15 g、郁金9 g、五味子6 g、白芍6 g 組成，飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，經湖南中醫藥大學王宇紅研究員鑒定為正品，質量均符合2020年版《中國藥典》 規定，混勻后分別加入10、6 倍量水，提取2 次，合并2 次提取液，濃縮至生藥量1.62 g/mL。陽性藥為氟哌噻噸美利曲辛片（丹麥H.Lundbeck A/S 公司，國藥準字H20171104，批號2691302）。

1.3 試劑 白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-4、IL-10、胰島素樣生長因子-1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1） 酶聯免疫吸附試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號2209R21、2209R23、2209R35、2209R32、2209R46）； RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，批號E096-01、E047-01）； 離子鈣接頭蛋白1 （ionized calcium binding adapter 1，Iba-1）、SDF-1、CXCR4 一抗（美國Proteintech 公司，批號10904-1-AP、17402-1-AP、11073-2-AP）。

1.4 儀器 G3 型旋轉蒸發儀 （德國Heidolph 公司）；Tracking Master V3.0 系統（香港博睿唯思科技公司）； MK3型酶標儀（美國Thermo 公司）； Axio Scan.Z1 全自動數字玻片掃描系統（德國Zeiss 公司）； ChemiDoc XRS＋型凝膠成像分析系統、實時熒光定量PCR 儀 （美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 分組與造模 將60 只大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥（氟哌噻噸美利曲辛片） 組和加味百合地黃湯高、中、低劑量組，每組10 只。參考文獻［5］ 報道，采用雙側卵巢摘除（ovariectomized，OVX） 聯合慢性不可預見性應激（chronic unpredictable stress，CUS） 的方法建立PDD模型，其中OVX 為模擬人圍絕經期狀態的常用模型，以連續5 d 陰道涂片未見動情周期表示模型建立成功； CUS 為模擬抑郁狀態的經典模型，以動物出現快感缺失、活動受限、行為絕望等行為表征表示模型建立成功。實驗期間，大鼠均單籠飼養。

2.2 給藥與取材 在CUS 造模7 d 后開始灌胃給藥，陽性藥物給予目前臨床治療PDD 的首選藥物氟哌噻噸美利曲辛片溶液（1.89 mg/kg），加味百合地黃湯高、中、低劑量組分別給予相應藥液（16.2、8.1、4.05 g/kg），正常組與模型組給予等量蒸餾水，灌胃容積為10 mL/kg，共21 d。給藥結束后進行行為學檢測，之后麻醉大鼠，腹主動脈取血，腦立體定位儀固定，采用微量注射器從枕骨大孔抽取腦脊液，留取腦組織或分離下丘腦組織備用。

2.3 行為學檢測

2.3.1 糖水偏好實驗 參考文獻［6］ 報道，實驗分為適應與測試2 個階段。適應期間第1 天給予每只大鼠2 瓶2%蔗糖水，第2 天給予蔗糖水、蒸餾水各1 瓶，并在12 h 時切換兩者位置，然后禁水不禁食12 h； 測試時同時給予大鼠1 瓶蔗糖水與1 瓶蒸餾水，記錄2 h 內糖水與蒸餾水的攝入量，為避免位置偏好，于測試1 h 時調換兩者位置，計算糖水偏好率，公式為糖水偏好率＝ ［糖水攝入量/（糖水攝入量＋蒸餾水攝入量）］ ×100%。

2.3.2 曠場實驗 參考文獻［7］ 報道，在測試空間提前適應12 h 以上，采用80 cm×80 cm×40 cm 大鼠專用曠場箱，Tracking Master V3.0 系統將其底部均勻劃分為25 個方格，將大鼠從中央放入，自由活動30 s 后記錄其4 min 內自主活動距離。

2.4 酶聯免疫吸附實驗檢測炎癥因子水平 大鼠腦脊液收集完成后4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液，按照酶聯免疫吸附試劑盒說明書檢測促炎因子IL-1β、IL-6 與抗炎因子IL-4、IL-10、IGF-1 水平。

2.5 HE 染色觀察腦組織病理變化 取充分固定后的大鼠腦組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備5 μm 切片，烤干后脫蠟，水洗，蘇木素、伊紅先后染色，常規脫水透明后封片，于顯微鏡下觀察，采用數字玻片掃描儀對切片進行掃描，觀察下丘腦區域病理變化。

2.6 免疫熒光染色檢測腦組織Iba-1 表達 取大鼠腦組織切片（10 μm），用PBST 溶液浸泡30 min，再用含5%正常山羊血清的PBST 液在室溫下封閉1 h，加入稀釋后的一抗，在4 ℃下孵育過夜，次日取出切片，用PBST 溶液洗滌3 次，加入二抗室溫避光孵育1.5 h，再次洗滌，滴加抗熒光淬滅劑，封片，掃描，選取下丘腦區3 個視野，通過Image J 軟件計算平均熒光強度。

2.7 Western blot 法檢測腦組織SDF-1、CXCR4 蛋白表達 取大鼠下丘腦組織，加入組織裂解液，于冰上勻漿，靜置30 min 后離心取上清液，檢測蛋白濃度，制膠，蛋白上樣量為30 μg，經電泳、轉膜后脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，洗膜后加入稀釋后的一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜后加入稀釋后的二抗于室溫下孵育2 h，洗膜，滴加顯影液，化學發光法顯影，通過Image J 軟件分析目的蛋白與內參的灰度值，并計算前者相對表達。

2.8 RT-qPCR 法檢測腦組織各基因mRNA 表達 采用RNA 提取試劑盒提取腦組織樣本總RNA，并將其逆轉錄成cDNA，進行PCR 反應，條件為95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環。測定目的基因和內參基因β-actin的PCR 產物CT值，采用2-ΔΔCT法分析前者mRNA 相對表達。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.9 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，齊時采用LSD-t檢驗，不齊時采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 加味百合地黃湯對PDD 大鼠抑郁樣行為的影響 與正常組比較，模型組大鼠糖水偏好率、自主活動距離減少（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和加味百合地黃湯高劑量組大鼠糖水偏好率、自主活動距離增加（P＜0.01），中劑量組糖水偏好率增加（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠糖水偏好率和自主活動距離比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠糖水偏好率和自主活動距離比較（±s，n＝10）

注： 與正常組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別糖水偏好率/%自主活動距離/cm正常組75.54±9.861 595.1±606.7模型組44.40±15.47**917.6±344.0**陽性藥組66.83±12.16＃＃1 380.4±440.3＃＃加味百合地黃湯高劑量組78.00±12.69＃＃1 453.1±577.0＃＃加味百合地黃湯中劑量組65.36±18.00＃1 265.4±612.3加味百合地黃湯低劑量組63.39±19.531 210.9±427.8

3.2 加味百合地黃湯對PDD 大鼠腦脊液炎癥因子水平的影響 與正常組比較，模型組腦脊液內促炎因子IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.01），抗炎因子IL-4、IL-10、IGF-1水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組IL-6 水平降低（P＜0.01），IL-4、IL-10、IGF-1 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），加味百合地黃湯高劑量組IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-4、IL-10、IGF-1 水平升高（P＜0.01），中劑量組IL-6 水平降低 （P＜0.05），IL-4、IGF-1 水平升高（P＜0.01），低劑量組IL-6 水平降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腦脊液炎癥因子水平比較（pg/mL，±s，n＝6）

表3 各組大鼠腦脊液炎癥因子水平比較（pg/mL，±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別IL-1βIL-6IL-4IL-10IGF-1正常組247.2±25.4447.5±55.153.1±6.3126.7±13.7517.1±67.2模型組323.7±31.2**557.0±49.2**37.1±4.4**94.4±7.2**309.2±35.7**陽性藥組298.3±27.5483.3±35.9＃＃51.9±4.6＃＃109.5±10.8＃435.1±22.9＃＃加味百合地黃湯高劑量組271.6±20.2＃468.7±43.0＃＃62.2±7.5＃＃118.4±13.8＃＃422.9±35.9＃＃加味百合地黃湯中劑量組289.2±25.1477.4±48.5＃53.0±4.5＃＃103.8±8.5382.5±40.5＃＃加味百合地黃湯低劑量組325.6±36.6490.0±38.9＃42.3±5.598.9±7.1350.4±32.3

3.3 加味百合地黃湯對PDD 大鼠下丘腦組織形態的影響 正常組下丘腦神經元形態正常，結構完整，胞核清晰，未見損傷； 模型組神經元出現核固縮、深染，部分胞體空泡、腫脹，間隙增大，密度降低，可見炎性細胞浸潤； 各給藥組下丘腦整體損傷情況得到一定程度的緩解，神經元密度增大，胞核清晰，但仍可見少量核固縮與炎性浸潤情況，其中以加味百合地黃湯高劑量組效果最強，見圖1。

圖1 各組大鼠下丘腦組織HE 染色

3.4 加味百合地黃湯對PDD 大鼠下丘腦小膠質細胞激活的影響 如圖2～3 所示，與正常組比較，模型組下丘腦小膠質細胞染色數量增加，可見明顯的分支，Iba-1 熒光強度與mRNA 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和加味百合地黃湯高、中劑量組小膠質細胞激活程度減輕，Iba-1 熒光強度與mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組大鼠下丘腦Iba-1 熒光表達（±s，n＝3）

圖3 各組大鼠下丘腦Iba-1 mRNA 表達（±s，n＝3）

3.5 加味百合地黃湯對PDD 大鼠下丘腦SDF-1/CXCR4 軸相關基因表達的影響 與正常組比較，模型組下丘腦SDF-1、CXCR4 mRNA 表達升高 （P＜0.01），PSD-95、BDNF、NGFmRNA表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和加味百合地黃湯高、中劑量組SDF-1、CXCR4 mRNA表達降低 （P＜0.05，P＜0.01），PSD-95、BDNF、NGFmRNA 表達降低 （P＜0.05，P＜0.01），低劑量組BDNFmRNA 表達升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠下丘腦SDF-1/CXCR4 軸相關基因表達比較（±s，n＝3）

表4 各組大鼠下丘腦SDF-1/CXCR4 軸相關基因表達比較（±s，n＝3）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別SDF-1CXCR4PSD-95BDNFNGF正常組1.018±0.0161.055±0.0501.080±0.0681.089±0.0780.995±0.029模型組1.613±0.072**1.528±0.064**0.504±0.048**0.472±0.081**0.476±0.041**陽性藥組0.958±0.045＃＃0.949±0.269＃0.828±0.127＃0.775±0.088＃0.940±0.155＃＃加味百合地黃湯高劑量組0.931±0.280＃0.960±0.109＃＃0.936±0.039＃＃0.813±0.074＃＃0.733±0.115＃加味百合地黃湯中劑量組0.893±0.102＃＃1.007±0.125＃＃0.884±0.147＃0.808±0.134＃0.719±0.121＃加味百合地黃湯低劑量組1.294±0.1481.275±0.1690.606±0.0260.707±0.076＃0.524±0.063

3.6 加味百合地黃湯對PDD 大鼠下丘腦SDF-1/CXCR4 軸蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組下丘腦SDF-1、CXCR4 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和加味百合地黃湯高、中劑量組SDF-1、CXCR4 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 各組大鼠下丘腦SDF-1、CXCR4 蛋白表達（±s，n＝6）

4 討論

PDD 臨床癥狀與中醫古籍中“百合病” “臟躁” “卑惵” 等病癥相似，五臟虛損是其發病之本，血脈瘀阻是發病之標，由虛致瘀，因瘀致郁是該病基本發生過程，治療當以補虛扶正、活血安神，系統性調節。加味百合地黃湯以張仲景《金匱要略》 百合地黃湯為基礎，基于PDD 病機根本，加味郁金、白芍、麥冬、夜交藤、茯神、蘇葉等藥物而成。方中百合調和五臟、養心安神，兼具補益功效，為君藥； 生地黃偏于瀉，能清熱生津、滋陰涼血，白芍偏于補，能養血榮筋、柔肝緩急，郁金行氣活血，善破血瘀氣結，使機體氣機通達，兼能清心開竅而安神，麥冬潤肺清心、養陰生津，可助百合調和之功，四者共為臣藥； 夜交藤、茯神味甘性平，均有寧心安神之功，夜交藤還能調和陰陽，蘇葉調和脾胃，三者共為佐藥。大量臨床研究表明，百合地黃湯加減治療原發性抑郁癥和繼發性抑郁癥均有顯著的療效［8］，聯合氟哌噻噸美利曲辛片治療PDD 總有效率及不良反應發生率均優于單一用藥組［9］。現代藥理研究也發現，百合、生地黃、郁金、白芍等單味藥均具有良好的抗抑郁功效［10］，蘇葉揮發油也是潛在的具有開發前景的抗抑郁藥物［11］。白芍、茯神、夜交藤均為治療圍絕經期綜合征的常用中藥，其中白芍為用藥頻次最高的藥物［12］。諸藥合用，共奏“補益氣血、調和陰陽、活血安神” 之功，通過多種有效成分有機合理的組合，多途徑作用于機體，最大限度發揮抗圍絕經期抑郁的功效。

絕經前后通常伴隨著卵巢功能的嚴重衰退，并影響HPO 軸的平衡，使雌激素分泌減少，進而減弱下丘腦負反饋調節作用，導致下丘腦處于持續興奮狀態，容易誘發精神疾病［13］。MG 作為腦內第一道免疫防線，正常狀態下，在保護大腦正常活動及中樞神經系統的組織維持、損傷反應和病原體防御等方面發揮重要作用，并作為吞噬細胞維持組織內平衡［14］； 而病理狀態下，受病理刺激的MG 迅速激活并表現出雙重功能，一方面介導炎性反應，刺激促炎細胞因子和炎癥介質如IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 等的分泌［15］，另一方面也可以釋放抗炎細胞因子如IL-10、IGF-1等拮抗炎癥級聯反應［16］。研究表明，慢性應激可誘導下丘腦MG 過度激活，導致其形態功能改變，該過程可能與下丘腦所調控的下丘腦-垂體-腎上腺軸異常興奮有關［17］。本研究發現，模擬圍絕經期大鼠接受慢性應激后，下丘腦神經元胞體腫脹，間隙增加，炎性細胞浸潤，MG 分支增加，其標志蛋白Iba-1 表達增加，腦脊液中促炎因子水平增加而抗炎因子降低，進一步說明該模型大鼠下丘腦處于明顯的炎癥激活狀態。

SDF-1/CXCR4 軸失調可能是激活MG 的重要環節。正常腦組織中，神經元、膠質細胞和血管內皮細胞可持續低水平表達SDF-1 和CXCR4； 慢性不可預見性應激條件下，SDF-1 表達異常或者其與CXCR4 受體的特異性結合被干擾，使SDF-1/CXCR4 軸介導的信號轉導通路失去活性，神經元/膠質細胞遷移到受損腦組織的作用減弱，影響損傷神經元的自我修復作用［18］。研究顯示，腦區受損部位的SDF-1/CXCR4 通路相關蛋白表達增加，導致炎癥因子聚集，神經元受損［19］。SDF-1 能夠促進腦內MG 的遷移與表達，病理條件下也能促進其活化與增殖，通過與CXCR4 受體結合，可參與MG-星形膠質細胞-神經元相互作用引起的神經炎癥微環境，引發神經炎癥失衡及神經元自我修復障礙［20］。本研究也發現，PDD 模型大鼠SDF-1、CXCR4 表達增加，突觸結構蛋白PSD-95 以及與神經元生長修復相關的BDNF、NGF 表達均降低，而加味百合地黃湯能夠逆轉上述因子表達，并抑制MG 的過度激活，調節促炎/抗炎因子的分泌水平，保護下丘腦組織。

綜上所述，加味百合地黃湯對PDD 大鼠的改善作用與其調節SDF-1/CXCR4 軸抑制MG 過度激活，改善下丘腦神經炎性損傷有關，為該方治療PDD 的臨床應用提供了重要理論依據。