香砂六君子湯對脾虛型IBS-D 大鼠腸道菌群及其代謝產物SCFAs 的調節作用

張遠哲，黎豫川，楊元鳳，陳禮大，羅玉玲

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025； 2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550025）

腸易激綜合征（imitable bowel syndrome，IBS） 是一種腸道功能紊亂性疾病［1］，主要分為便秘型（IBS-C）、腹瀉型（IBS-D）、混合型（IBS-M）、非典型腸易激綜合征［2］，其中IBS-D 的發病率約占IBS 患者的40%以上，治療后易反復，給患者的心理及經濟帶來負擔。研究表明，IBS-D發生與飲食、心理因素、遺傳及腸道菌群紊亂等因素密切相關［3］，患者普遍存在腸道菌群紊亂現象，表現為部分有益菌減少、致病菌增多［4］。短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs） 是腸道微生物作用與機體免疫功能的一種介質，腸道菌群能夠利用SCFAs 作用于腸嗜鉻細胞，調控5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT） 的合成和釋放，從而影響腸動力及敏感性［5］。目前治療IBS-D 主要以抗感染、促進腸道菌群平衡為主，短期效果佳，但長期易產生較多副作用，停藥后易復發［6］。香砂六君子湯由六君子湯演變而來，具有益氣健脾化濕之效，是臨床治療脾虛濕阻的常用方，能有效調節脾虛型IBS-D 大鼠腸動力，但其具體機制尚不清楚［7］，故本研究通過建立脾虛型IBS-D 大鼠模型，探討香砂六君子湯對IBS-D 大鼠腸道菌群及其代謝產物SCFAs 的影響，為相關治療提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 36 只雄性SPF 級SD 大鼠，體質量（200±20） g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （川） 2021-0037，飼養于貴州中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK （黔） 2021-0005。本實驗獲得貴州中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（批準號20210042），操作嚴格按照3R 準則。大鼠置于安靜環境中適應性飼養1 周，給予充足、清潔的飲水。

1.2 藥物 香砂六君子湯由人參3 g、茯苓6 g、生白術6 g、生甘草2 g、陳皮2.5 g、生半夏3 g、砂仁2.5 g、木香2 g、生姜6 g 組成，混合煎煮2 次，第1 次加8 倍量水，武火煮開后文火煎煮30 min； 第2 次加6 倍量水，武火煮開后文火煎煮20 min，合并2 次濾液，100 ℃水浴濃縮至1 g/mL，4 ℃保存。依據人與大鼠體表面積系數法，得出大鼠給藥劑量為每天2.9 g/kg。復合乳酸菌購自江蘇美通制藥有限公司（國藥準字H19980184）。

1.3 試劑與儀器 甲醛購自四川西隴科學有限公司（批號1340040101602）； 蘇木素染液購自武漢賽維爾生物科技有限公司（批號G1004）； 伊紅染液購自合肥博美生物科技有限責任公司（批號YE2080）； Rat 5-HT ELISA 試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司 （批號ZC-35959）； TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 購自美國Illumina 公司（批號NP1011001）； 高靈敏度DNA 分析試劑盒購自美國安捷倫公司（批號50674626）。數碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實業集團有限公司（型號BA210Digital）； Hiseq 測序儀購自美國Illumina 公司（型號2500）； 紫外分光光度計（型號Evolution 200）、質譜儀（型號ISQ 7000 質譜儀）、氣相色譜儀（型號Trace 1300） 均購自美國賽默飛世爾科技公司。

2 方法

2.1 模型建立及給藥 大鼠隨機分為對照組，模型組，香砂六君子湯低、中、高劑量組，復合乳酸菌組。除對照組外，其余各組大鼠灌胃給予100%番瀉葉水煎劑（生藥量1 g/mL） 10 mL/kg，采取彈力繃帶束縛其兩前肢和肩背部，限制其上半身活動，時長2 h，束縛期間聯合給予夾尾刺激，每次約3～5 min，每天2 次，連續14 d，可見大鼠出現腹瀉、體質量減輕、神態萎靡、食少納呆、困倦等癥狀，而且根據AWR 評分標準對模型進行驗證。香砂六君子湯低、中、高劑量組灌胃給予0.2 mL 質量濃度分別為0.145、0.29、0.58 g/mL 的香砂六君子湯水煎液，復合乳酸菌組每天灌胃給予0.2 mL 0.026 g/mL 復合乳酸菌混懸液，對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1 次，連續14 d。

2.2 糞便性狀評分及糞便含水量檢測 觀察大鼠毛色、精神狀態、進食狀態、糞便性狀及形態，采用布里斯托大便分類法對大便性狀進行評分。收集24 h 內大鼠糞便，計數并稱定質量，得到糞便濕重，烘干后再次稱定質量，獲得糞便干重，計算糞便含水量，公式為含水量＝ ［（糞便濕重-糞便干重） /糞便濕重］ ×100%。

2.3 腹壁撤退反射實驗（AWR） 檢測內臟敏感性 在造模和給藥結束后，采用球囊擴張直腸。大鼠固定后，將有氣囊的導尿管前端用石蠟潤滑后插入肛門，后端連接注射器，待大鼠適應后經導尿管注射溫鹽水進行擴張，記錄出現弓背和腹部抬起的最小容量閾值。

2.4 炭末推進實驗檢測腸運輸速率 治療后，各組大鼠灌胃給予2 mL 炭末混懸液，40 min 后處死，并對腸系膜進行分離，測量幽門至炭末前沿的距離，即炭末在小腸中推進距離，計算炭末推進率，公式為炭末推進率＝ （炭末在小腸中的推進距離/小腸總長度） ×100%。

2.5 HE 染色檢測結腸病理變化 收集大鼠結腸組織，用10%中性甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋，切片，脫蠟，HE 染色，封片，用顯微鏡觀察組織形態結構變化并拍照，根據大鼠結腸組織損傷評分標準（表1） 進行評分。

表1 大鼠結腸組織損傷評分標準

2.6 ELISA 法檢測大鼠血清5-HT 水平 嚴格按照試劑盒說明書操作，在450 nm 波長處檢測光密度（OD） 值，計算大鼠血清5-HT 水平。

2.7 16S rRNA V3-V4 腸道菌群測序 收集大鼠糞便，DNA 提取試劑盒提取總DNA，Nanodrop 定量DNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量，加入引物進行PCR 擴增，引物序列為正向 ACTCCTACGGGAGGCAGCA，反向GGACTACHVGGGTWTCTAAT。將PCR 擴增回收產物進行熒光定量，TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，高靈敏度DNA 試劑盒進行質量檢測，在Illumina HiSeq 平臺進行測序。

2.8 GC-MS 法對大鼠腸道糞便中SCFAs 濃度分析 取適量大鼠糞便于1.5 mL 離心管中，加500 μL 水和100 mg 玻璃珠，勻漿1 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液200 μL，加入100 μL 15%磷酸、20 μL 375 μg/mL 4-甲基戊酸溶液和280 μL 乙醚勻漿1 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，即得供試品溶液。質譜條件為Agilent HP-INNOWAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 進樣量1 μL，分流比10 ∶1； 進樣口溫度250 ℃； 離子源溫度300 ℃； 傳輸線溫度50 ℃； 程序升溫 （初始90 ℃，10℃/min升至120 ℃，5 ℃/min 升至150 ℃，25 ℃/min 升至250 ℃，維持2 min）； 載氣氣體氦氣，體積流量1.0 mL/min； 電子轟擊電離 （EI） 源； SIM 掃描； 電子能量70 eV。

2.9 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠一般狀態、糞便性狀及糞便含水率的影響 對照組大鼠精神良好、毛色光滑，糞便呈顆粒狀； 模型組大鼠出現精神萎靡、扎堆、腹瀉、毛色雜亂晦暗。與對照組比較，模型組大鼠布里斯托大便分類法評分、糞便含水量升高（P＜0.01）； 與模型組比較，香砂六君子湯高劑量組和復合乳酸菌組大鼠布里斯托大便分類法評分、糞便含水量降低（P＜0.01），見圖1。

圖1 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠糞便性狀、糞便含水率的影響（±s，n＝6）

3.2 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠結腸動力、內臟敏感性的影響 與對照組比較，模型組大鼠疼痛閾值降低 （P＜0.01）； 與模型組比較，香砂六君子湯各劑量組和復合乳酸菌組大鼠疼痛閾值升高（P＜0.05，P＜0.01），表明香砂六君子湯干預后大鼠的內臟敏感性降低，見圖2A。與對照組比較，模型組大鼠腸道推進率升高（P＜0.01）； 與模型組比較，香砂六君子湯中、高劑量組和復合乳酸菌組大鼠腸道推進率降低（P＜0.01），見圖2B。

圖2 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠結腸動力、內臟敏感性的影響（±s，n＝6）

3.3 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠結腸組織病理改變的影響 與對照組比較，模型組大鼠結腸組織中可見黏膜上皮分離、脫落、壞死，以及少量炎性細胞浸潤和纖維組織增生； 與模型組比較，香砂六君子湯組和復合乳酸菌組大鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結構較完整，黏膜上皮細胞完整，未見炎性細胞浸潤和纖維組織增生，見圖3A。與對照組比較，模型組大鼠結腸組織損傷評分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，香砂六君子湯中、高劑量組和復合乳酸菌組大鼠結腸組織損傷評分降低（P＜0.01），見圖3B。

圖3 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠結腸組織病理改變的影響（HE，×400，±s，n＝6）

3.4 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠血清中5-HT 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清5-HT 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，香砂六君子湯各劑量組和復合乳酸菌組大鼠血清5-HT 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 香砂六君子湯對大鼠血清5-HT 水平的影響（±s，n＝6）

3.5 16S rRNA V3-V4 腸道菌群測序

3.5.1 各組大鼠糞便菌群門、屬水平分析 大鼠糞便菌群組成在門水平上以厚壁菌門 （Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes） 和變形菌門（Proteobacteria） 為主，與模型組比較，香砂六君子湯組厚壁菌門相對豐度升高，擬桿菌門豐度降低，見圖5A。大鼠糞便菌群組成在屬水平上以乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃菌屬（Prevotella） 和瘤胃球菌屬（Ruminococcus） 為主，與對照組比較，模型組普雷沃菌屬相對豐度降低； 與模型組比較，香砂六君子湯組和復合乳酸菌組乳桿菌屬和普雷沃菌屬相對豐度升高，見圖5B。

圖5 各組大鼠糞便腸道菌群門、屬水平分類圖（n＝3）

3.5.2 菌群多樣性分析 如圖6 所示，與對照組比較，模型組Chao1、Observed-Species、shannon 指數均呈升高趨勢，而Goods-coverage 指數降低； 與模型組比較，香砂六君子湯組和復合乳酸菌組Chao1、Observed-Species、shannon 指數降低，Goods-coverage 指數升高。通過PCoA 在加權UniFrac距離矩陣上評估Beta 多樣性，結果見圖7，可知模型組樣本菌落組成差異較大，香砂六君子湯、復合乳酸菌等藥物干預后菌落組成差異較小。

圖6 Alpha 多樣性指數的分組箱線圖（n＝3）

圖7 PCoA 分析的樣本二維排序圖（n＝3）

3.5.3 物種韋恩圖分析 由圖8 可知，各組間具有共有和單獨的OTU 數量，4 個分組共有OTU 數目為140 個，對照組共有2 223 個OTU，模型組共有2 733 個OTU，香砂六君子湯組共有2 137 個OTU，復合乳酸菌組共有1 747 個OTU，模型組獨有的OTU 數目最多，為2 027 個； 對照組獨有1 687 個； 香砂六君子湯組和復合乳酸菌組分別獨有1 470、1 134 個。

圖8 大鼠腸道微生物ASV/OTU 維恩圖（n＝3）

3.5.4 物種聚類的屬水平物種組成 由圖9 可知，與對照組比較，模型組大鼠糞便組織中黏液螺菌屬（Mucispirillum）、安德克氏菌屬（Adlercreutzia）、普雷沃菌屬等相對豐度降低，考拉桿菌屬 （Phascolarctobacterium）、密螺旋體屬（Treponema） 相對豐度升高； 與模型組比較，香砂六君子湯組和復合乳酸菌組乳桿菌屬、瘤胃球菌屬、普雷沃菌屬相對豐度升高。

3.5.5 差異菌群篩選 由圖10 可知，對照組優勢菌株是g_Bacteroides、f_Bacteroidaceae、g_Turicibacter、o_Turicibacterales、c_Actinobacteria、g_Paraprevotellaceae、Turicibacteraceae、Actinomycetales、Porphyromonadaceae，模型組優勢菌株是f_S24_ 7，香砂六君子湯組優勢菌株是P_Firmicutes，復合乳酸菌組優勢菌株是f_Streptococcaceae、p_Verrucomicrobia、g_Akkermansia、p_Verrucomicrobiae、f_Micrococcaceae、Parabacteroides、Verrucom-icrobiales、Verrucomicrobiaceae、g_Streptococcus、g_Rothia。

圖10 物種結構差異顯著性分析的LEfSE 圖（n＝3）

3.6 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量的影響 由圖11 可知，與對照組比較，模型組大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量降低（P＜0.05）； 與模型組比較，香砂六君子湯組和復合乳酸菌組大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量升高（P＜0.05）。

圖11 香砂六君子湯對IBS-D 大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量的影響（±s，n＝6）

4 討論

中醫認為，IBS-D 屬于“腹痛” “泄瀉” 范疇，飲食不節、先天不足、后天失養、外感邪機等因素是造成IBS-D的主要病機［8］，基本特征為脾虛濕盛，病位在腸，主病之臟屬脾，濕盛為標，脾虛為本，故益氣健脾是治療本病的基本治法［9］。香砂六君子湯經六君子湯加砂仁和木香衍變所得，由人參、茯苓、白術、甘草、陳皮、砂仁、半夏、木香及生姜組成，具有益氣健脾、燥濕行氣之功效。其中人參為君藥，具有安神益智、補脾益肺的作用； 白術、茯苓為臣藥，具有利水祛濕、健脾安神的功效； 半夏、陳皮、砂仁、木香為佐藥，具有化痰止嘔、理氣健脾、溫脾止瀉、行氣止痛，健脾消食等作用； 甘草為使藥，具有補脾益氣、調和眾藥的作用； 全方組合，主要發揮益氣健脾化濕之效。本研究結果表明，香砂六君子湯干預后大鼠腹瀉狀況、糞便含水量、內臟敏感性、腸道推進率、外周血中5-HT 水平、炎性細胞浸潤和纖維組織增生降低，表明它能減輕脾虛型IBS-D 的臨床癥狀，具有較好的治療作用。腸道菌群失調是導致IBS-D 發生發展的重要因素［10］，IBS-D 發生后腸道菌群中雙歧桿菌、乳桿菌等數量降低，腸道桿菌升高，導致菌群多樣性降低［11-12］，而造成腸道菌群失衡的因素主要包含腸道敏感性和通透性升高、炎癥反應、胃腸動力改變和應激等因素，故維持腸道菌群的平衡是治療IBS-D 的關鍵［13］。16S rRNA 結果顯示，經過對各組菌群在門、屬水平上的結構變化比較，與模型組比較，香砂六君子湯組菌群結構發生了顯著變化，其中厚壁菌門和擬桿菌門分別具有抗炎和促炎作用，其比值的大小反應了腸道炎癥水平［14］。乳桿菌屬作為腸道中常見的一種有益菌，具有促進消化、保護消化道黏膜、維持腸道菌群平衡的作用［15］。普雷沃菌屬是一種具有維持腸道正常生理功能的多形態桿菌，其數目的減少常預示著機體中生理代謝的失衡［16-17］。本研究結果顯示，香砂六君子湯組大鼠糞便中厚壁菌門/擬桿菌門比值升高，乳桿菌屬和普雷沃菌屬含量及相對豐度升高，表明香砂六君子湯能夠通過抗炎并維持消化道菌群平衡來維持腸道健康。

腸道菌群的代謝產物主要包含SCFAs、膽堿代謝物、脂類、維生素、多胺類等［18］，其中SCFAs 作為腸道微生物的重要代謝產物之一，在結腸中的抗性淀粉和纖維被厭氧菌發酵后生成，具有降低結腸pH、抑制病原菌繁殖等作用，主要包含乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸等［19-20］。近年來研究證實，SCFAs 能通過調控神經遞質5-HT 來間接影響腸道菌群穩態。本研究結果表明，香砂六君子湯干預后能增加腸道糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量及SCFAs 水平，從而發揮治療IBS-D 的作用。

綜上所述，香砂六君子湯能夠通過調節腸道菌群平衡，升高大鼠腸道糞便中SCFAs 濃度，從而減輕IBS-D 的癥狀。但本研究未深入闡明香砂六君子湯對腸道菌群調控的詳細機制，后期將進一步加以闡述。