基于網絡藥理學和動物實驗探討牡丹皮提取物對接觸性皮炎的改善作用

葉佳豐，韓婕珺，龔天貴，王 斌，陳 賢，王春麗*

（1.華東理工大學藥學院，上海 200237； 2.美出萊化妝品有限責任公司，浙江 杭州 311121； 3.廣州伽能生物科技有限公司，廣東 廣州 511335）

變應性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是一種遲發型超敏反應，分為致敏期和激發期［1-2］，是皮膚或黏膜接觸外源性物質后發生的過敏性炎癥反應，常在接觸部位甚至它處發生。除了臨床常用的皮質類固醇和抗組胺藥，中藥對接觸性皮炎也有較好的療效，如苦木［3］、地膚子［4］、陰地蕨［5］等。

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，性微寒，味辛、苦，歸心、肝、腎經，功效清熱涼血、活血化瘀，具有抗炎、抗腫瘤、降糖、抗過敏、保護心血管等作用［6］。丹皮酚是牡丹皮中的主要作用成分，也是皮炎、濕疹的有效治療藥物。牡丹皮提取物具有治療接觸性皮炎的潛力，且機制尚不明確。

本研究采用網絡藥理學的方法對牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的作用機制進行探究，對牡丹皮提取物治療接觸性皮炎效果進行了簡單評價，并對其作用機制進行初步的驗證，為牡丹皮提取物開發外用抗炎舒緩的藥品或化妝品提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF 級ICR 小鼠20 只，體質量18～20 g，購自上海必凱科翼生物科技有限公司 ［動物生產許可證號SCXK （滬） 2018-0006］，于室溫20 ～25 ℃、相對濕度40% ～60%、12 h/12 h 明暗交替的動物房內適應性喂養1周。動物實驗經華東理工大學實驗動物倫理委員會批準（倫理號ECUST-2021-03007）。

1.2 藥物 牡丹皮購自北京同仁堂股份有限公司，經華東理工大學藥學院馬磊教授鑒定為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的干燥根皮，其提取物的制備方法參考文獻［7］ 報道。復方醋酸地塞米松乳膏（華潤三九醫藥股份有限公司，批號2102019X）。

1.3 試劑 1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB） （東京化成工業株式會社，批號WT6CA-VO）； BCA 總蛋白定量試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號O20HR198586）； 小鼠白細胞介素6 （IL-6） ELISA 試劑盒（北京冬歌博業生物科技有限公司，批號202210）； β-actin、ERK1/2 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號GB15001、GB11560）； p-ERK1/2 （美國Cell Signaling Technology 公司，貨號4370）；p-Akt （上海碧云天生物技術有限公司，貨號AA329）。

1.4 儀器 正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon 公司，型號Eclipse Ci-L）； 酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號RT-6100）； 臺式高速冷凍離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司，型號D3024R）； 研磨儀、脫色搖床、垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號KZ-III-F、DS-2S100、SVE-2）； 轉印電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號SVT-2）； 超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司，型號JY92-11N）； 化學發光儀（上海勤翔科學儀器有限公司，型號6100）； 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號CFX Connect）； PCR 儀（北京東勝創新生物科技有限公司，型號ETC811）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組和牡丹皮組，每組5 只。采用DNCB 誘導建立接觸性皮炎模型［8］，并適當改進，實驗前1 d 對小鼠腹部及背部去毛，第1 天和第2 天上午9： 00 在下腹部2 cm×2 cm脫毛部位處均勻涂抹含5% DNCB 的乙醇50 μL 致敏； 第6天開始，在小鼠尾基底部以上1 cm 處的背部脫毛部位（2 cm×2 cm） 涂抹含1% DNCB 的乙醇25 μL 激發，每3 d 1 次，共4 次，均在上午9： 00進行。從致敏日起預防給藥，給藥面積2 cm×2 cm，每天1 次，至激發結束，均在下午5： 00 進行。牡丹皮組給予0.5%牡丹皮提取物0.2 mL，陽性藥組給予醋酸地塞米松乳膏0.2 g，各組均勻涂抹至沒有液體殘留，并采用無刺激膠布固定以防止小鼠舔舐。

2.2 取材 末次給藥24 h 后，脫頸處死小鼠，取給藥部位皮膚2 cm×2 cm，平均分成1 cm×1 cm 的4 份，左上部分用于HE 染色，左下部分用于ELISA 檢測，右上部分用于Western blot 實驗，右下部分用于RT-qPCR 檢測。

2.3 脾臟、胸腺指數檢測 小鼠脫頸處死后，測定體質量，解剖取脾臟及胸腺并測定其質量，脾臟、胸腺指數以脾臟、胸腺質量與體質量的比值表示。

2.4 HE 染色觀察皮膚組織病理形態 取各組小鼠皮膚組織，用4%多聚甲醛固定，經乙醇脫水、石蠟包埋切片后用蘇木精-伊紅染色后脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察皮膚組織結構形態及炎細胞浸潤情況。

2.5 ELISA 法檢測皮膚組織IL-6 水平 取各組小鼠皮膚組織，用預冷的PBS （pH 7.4） 沖洗，去除殘留血液，并用加有蛋白酶抑制劑的PBS 勻漿，反復凍融后于4 ℃、5 000×g下離心10 min，取上清，利用BCA 法測定總蛋白含量，按照試劑盒說明書操作，于450 nm 波長處測定各孔光密度（OD） 值，計算IL-6 水平。

2.6 網絡藥理學研究

2.6.1 牡丹皮成分的獲取及篩選 通過TCMSP 數據庫（https： //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以牡丹皮為搜索對象收集相關成分并進行篩選，標準為分子量（MW） ≤500、脂水分配系數（AlogP） 1 ～3［9］，得到符合要求的透皮吸收成分。由于類藥性低并不代表沒有藥效，如丹皮酚的類藥性值為0.04，依然有較好的藥理活性，因此不考慮類藥性的篩選。

2.6.2 潛在作用靶點的收集 通過TCMSP 收集各活性成分的靶點信息，并將 Swisstarget Prediction 數據庫（http： //www.swisstargetprediction.ch/） Probability≥0.1、TargetNet 數 據 庫 （ http： //targetnet.scbdd.com/）Probability ≥0.9、PharmMapper 數據庫 （ http： //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/） Probability≥0.5 的高分預測靶點納入活性成分靶點中，將蛋白名用UniProt 蛋白質數據庫 （https： //www.uniprot.org/） 轉換為相應的 gene symbol，并通過DisGeNET 數據庫（https： //www.disgenet.org/）、GeneCards 數 據 庫 （ https： //www.genecards.org/）、TTD 數據庫 （http： //db.idrblab.net/ttd/） 以“contact dermatitis” “allergic contact dermatitis” 為關鍵詞收集接觸性皮炎靶點信息，取各數據庫靶點信息的并集作為最終的疾病靶點集。活性成分靶點與疾病靶點的交集即為牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的潛在作用靶點。

2.6.3 活性成分-潛在作用靶點網絡圖的構建 整理活性成分信息及潛在作用靶點信息，得到對應的Network 及Type 文件，導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建活性成分-潛在作用靶點網絡圖。

2.6.4 蛋白-蛋白相互作用 （PPI） 網絡圖的構建 在STRING 平臺（https： //cn.string-db.org/） 導入潛在作用靶點信息，限定物種“Homosapiens”，選擇最高置信度0.900，隱藏游離節點，獲得潛在作用靶點蛋白的互作關系，導出為TSV 格式文件，并導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建PPI 網絡圖。再利用cytoHubba 插件工具計算節點的拓撲參數。

2.6.5 GO、KEGG 富集分析 利用生物學信息注釋數據庫DAVID 數據庫（https： //david.ncifcrf.gov/） 進行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析，以揭示牡丹皮提取物外用治療接觸性皮炎的生物進程、細胞組分、分子功能及相關通路情況。

2.6.6 Reactome 信號通路富集分析 在Reactome Pathway數據庫 （Reactome Pathway Database，https： //reactome.org/） 中導入潛在作用靶點信息，限定物種為 “Homo sapiens”，進行通路富集分析。

2.6.7 分子對接驗證 在Protein Data Bank 數據庫（https： //www.rcsb.org/） 中，篩選解析度＜3? 的靶點蛋白，得到對應的PDB 格式文件。并從PubChem 數據庫（https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載活性成分3D 結構SDF 文件，通過Open Babel 2.4.1 轉換為PDB 格式［10］。使用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接，Autodock Tool 1.5.6 對關鍵靶點進行包括去水、加氫、去配體等預處理，測定小分子扭轉鍵，導出蛋白及配體的pdbqt 文件。隨后將配體與處理后的蛋白對接，并用PyMOL 2.3.4 處理對接結果，通過結合能判斷活性成分與靶點蛋白結合效果［11］。

2.7 Western blot 法檢測皮膚組織p-ERK1/2、p-Akt 蛋白表達 取各組小鼠皮膚組織，勻漿裂解得到總蛋白，使用BCA 法進行蛋白定量，經電泳分離、轉膜后5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，加一抗4 ℃搖床孵育過夜，加二抗孵育30 min，加入ECL 發光液進行化學發光檢測。采用Image J分析圖像條帶灰度值。

2.8 RT-qPCR 法檢測皮膚組織PI3KmRNA 表達 取各組小鼠皮膚組織，用RNA 提取液提取總RNA，逆轉錄合成cDNA 后進行PCR 擴增，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，循環40 次。采用2-ΔΔCT法進行數據處理。GAPDH正向引物序列 5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，反向引物序列 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′；PI3K正向引物序列5′-CACGGCGATTACACTCTTACACTA-3′，反向引物序列5′-CACTGGGTAGAGCAACTTCACATC-3′。

2.9 統計學分析 通過IBM SPSS Statistics 26 和Graph Pad 8.4.3 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 牡丹皮提取物對小鼠皮膚組織病理的影響 如圖1 所示，模型組小鼠皮膚出現明顯的結痂、潮紅，伴有皮膚粗糙破損； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚結痂消失，少見皮膚潮紅，皮膚狀態優于模型組。HE 染色結果顯示，與空白組比較，模型組表皮重度增厚（黑色箭頭），角質層增厚，可見膿性灶（紫色箭頭）； 表皮局部缺失，真皮裸露（紅色箭頭）； 真皮膠原纖維排列紊亂，真皮及皮下可見大量的淋巴細胞、粒細胞呈彌散性浸潤（藍色箭頭）。與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織皮膚結構完整，淋巴細胞浸潤較少（藍色箭頭）。

圖1 各組小鼠皮膚形態及HE 病理染色

3.2 牡丹皮提取物對小鼠脾臟、胸腺指數的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數升高 （P＜0.01），顯示超敏反應發生； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠脾臟指數降低（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組比較，模型組小鼠胸腺指數降低（P＜0.01）； 與模型組比較，牡丹皮組小鼠胸腺指數升高（P＜0.01），而陽性藥組小鼠胸腺指數降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較（mg/10 g，±s，n＝5）

表1 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較（mg/10 g，±s，n＝5）

組別脾臟指數胸腺指數空白組39.35±3.5236.68±0.38模型組49.18±1.52＃＃22.30±1.78＃＃陽性藥組15.36±1.95**19.50±0.66*牡丹皮組42.70±0.83*29.51±1.48**

3.3 牡丹皮提取物對小鼠皮膚組織IL-6 水平的影響 如圖2 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織IL-6 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織IL-6 水平降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠皮膚組織IL-6 水平比較（±s，n＝5）

3.4 牡丹皮提取物的活性成分 從TCMSP 數據庫中篩選得到牡丹皮活性成分18 種。如表2 所示，這些化合物具有較小的分子量及較好的透皮性質，可作為后續研究的有效成分。

表2 牡丹皮有效成分信息

3.5 牡丹皮提取物的潛在作用靶點 通過多個數據庫收集各活性成分的靶點信息，去除重復項共得到628 個靶點。從DisGeNET 數據庫、GeneCards 數據庫、TTD 數據庫收集疾病靶點，去除重復項，得到靶點信息共2 317 條。使用Venny 2.1.0 平臺（https： //bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/） 取活性成分靶點和疾病靶點的交集，得到潛在作用靶點共317 個，見圖3。

圖3 活性成分靶點-接觸性皮炎靶點Venn 圖

3.6 牡丹皮提取物活性成分-潛在作用靶點網絡圖 如圖4所示，活性成分與潛在作用靶點網絡圖包含336 個節點（1個藥、18 種成分、317 個靶點）、1 380 條邊。槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422） 可結合靶點較多，分別為199、132 個。

圖4 活性成分-潛在作用靶點網絡圖

3.7 PPI 網絡分析 PPI 網絡圖（圖5） 反映了靶點之間的聯系，共含270 個節點（47 個游離節點）、1 423 條邊，各靶點的拓撲參數可反映1 個靶點對PPI 網絡的影響［12］。該網絡圖中顏色表示度值（Degree），字體大小表示緊密度（Closeness），節點大小表示介度 （Betweenness），取Degree、Closeness、Betweenness 前15 位的靶點作為關鍵靶點［13］。表3 顯示，牡丹皮外用治療接觸性皮炎主要作用于原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、有絲分裂原激活的蛋白激酶1 （MAPK1）、磷脂酰肌醇3-激酶調節亞單元α（PIK3R1） 等關鍵靶點。

表3 關鍵靶點拓撲參數

圖5 潛在作用靶點PPI 網絡圖

3.8 GO、KEGG 富集分析 如圖6 所示，GO 富集分析得到顯著性P＜0.05 的生物進程（biological process，BP） 條目892 條，細胞組分（cellular component，CC） 條目88 條，分子功能（molecular function，MF） 條目112 條。牡丹皮外用治療接觸性皮炎的生物進程主要涉及對藥物的反應（response to drug）、對脂多糖的反應 （ response to lipopolysaccharide）、炎癥反應（inflammatory response） 等，細胞組分主要涉及在細胞外空間（extracellular space）、膜筏（membrane raft）、胞液（cytosol） 等，分子功能主要涉及在酶結合（enzyme binding）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity） 等。

圖6 潛在作用靶點GO、KEGG 富集分析圖

KEGG 信號通路富集分析得到顯著性P＜0.05 的條目共177 條。潛在作用靶點顯著富集于PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK 信號通路 （MAPK signaling pathway） 等［1-2，14］，表明牡丹皮提取物可能通過PI3K-Akt、MAPK 信號通路發揮治療接觸性皮炎的作用。

3.9 Reactome 信號通路富集分析 Reactome 信號通路富集共得到P＜0.05 條目1 427 條，如圖7 所示，潛在作用靶點顯著富集于信號轉導 （signal transduction）、免疫系統（immune system）、免疫系統中的細胞因子信號（cytokine signaling in immune system） 等，表明PI3K-Akt 信號通路的傳導可能在牡丹皮提取物治療接觸性皮炎中發揮重要作用。

圖7 Reactome 信號通路富集分析結果

3.10 分子對接驗證 關鍵成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate）、5- ｛ ［5- （4-methoxyphenyl） -2-furyl］ methylene｝ barbituric acid、兒茶素［（＋） -catechin］ 與關鍵靶點SRC （1A07）、MAPK1 （3SA0）、PIK3R1 （1H9O）、HSP90AA1 （1BYQ）、TP53 （3Q01） 分子對接驗證的結果見圖8，可知結合能均小于-5.0 kcal/mol［15］，表明槲皮素、山柰酚等成分與靶點各靶點都具有較好的結合活性。

圖8 分子對接結果熱圖及對接模式圖

3.11 牡丹皮提取物對小鼠皮膚組織p-ERK、p-Akt 表達的影響 如圖9 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織p-ERK1/2、p-Akt 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織p-ERK1/2、p-Akt蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 各組小鼠皮膚組織p-ERK、p-Akt 蛋白表達比較（±s，n＝5）

3.12 牡丹皮提取物對小鼠皮膚組織PI3KmRNA 表達的影響 如圖10 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織PI3KmRNA 表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織PI3KmRNA 表達升高（P＜0.01）。

圖10 各組小鼠皮膚組織PI3K mRNA 表達降低（±s，n＝5）

4 討論

接觸性皮炎發病機制復雜，這是一種由多種細胞因子介導的免疫細胞應答反應，包括白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等［16-17］。本研究動物實驗結果顯示，牡丹皮提取物可以降低小鼠皮膚組織的炎細胞浸潤及IL-6 水平，維持皮膚組織結構； 牡丹皮提取物給藥可以降低模型小鼠的脾臟指數，減輕過敏反應，表明牡丹皮提取物可以有效緩解小鼠接觸性皮炎的癥狀。此外，IL-6 可以影響MAPK 信號通路，調節細胞應激和凋亡［18］。本研究網絡藥理學分析顯示，牡丹皮提取物中的18 種活性成分通過調節多種生物進程，發揮多種分子功能發揮改善接觸性皮炎的作用，包括免疫應答和對脂多糖的反應［2，19］等； 其次牡丹皮提取物還可以調節包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路在內的多個通路，這些通路與免疫炎癥調節有重要關系［20-22］。

MAPK、PI3K-Akt 信號通路在調節細胞生長代謝、增殖分化中發揮著重要的作用［23-24］。MAPK1 編碼的MAP 激酶1（ERK2） 通過MAPK/ERK 信號通路依賴的機制被細胞外信號激活，調控細胞的增殖凋亡等生理活動。PI3K/Akt 信號通路可介導炎癥反應，與多種炎性介質密切相關［25］，其中Akt 是PI3K 通路的中心介質，其C 端調節區的Ser473 位點對Akt 的完全激活起著重要作用［26］。研究表明，激活ERK1/2 可以減少心肌細胞凋亡［27］，減輕大鼠腦缺血誘導的炎癥反應［28］。同時有研究指出，激活PI3K-Akt 信號通路可以減輕前列腺素誘導的氧化應激及炎癥水平，抑制自噬，減輕細胞損傷及凋亡［29］。本研究結果顯示，牡丹皮提取物可以提高接觸性皮炎小鼠皮膚組織p-ERK、p-Akt 蛋白表達及PI3KmRNA 表達，激活了MAPK/ERK、PI3K-Akt 信號通路，發揮炎癥抑制的作用。

綜上所述，本研究表明，牡丹皮提取物可以降低接觸性皮炎小鼠皮膚組織IL-6 水平，改善皮膚狀態，調節小鼠脾臟、胸腺指數； 其次通過網絡藥理學和分子對接探討了牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的機制，并進行了簡單的實驗驗證。驗證結果也表明，牡丹皮提取物可通過提高p-ERK1/2 表達激活MAPK/ERK 通路，提高p-Akt 蛋白表達及PI3KmRNA 表達，激活PI3K-Akt 信號傳導發揮炎癥抑制的作用。MAPK/ERK、PI3K-Akt 信號通路可能是牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的關鍵信號通路。詳細的通路傳導機制有待進一步的驗證。