二氫楊梅素抑制黃嘌呤氧化酶生物活性綜合評價與作用機制研究

姚元勇，張 萌，陳仕學

（銅仁學院材料與化學工程學院，銅仁市中藥民族藥現代化研究與開發利用重點實驗室，貴州 銅仁 554300）

高尿酸血癥作為常見的代謝性疾病之一，是引發多種潛在疾病的重要因素，如痛風、高血壓、慢性腎病等［1-3］。目前，高尿酸血癥的發生機制已相對明確，主要歸因于人體內的黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD） 的生物催化作用。XOD 是一種專一性不高的黃素蛋白酶，廣泛存在于生物體內，可有效催化黃嘌呤 （Xan） 或次黃嘌呤（Hxan），生成尿酸，且伴隨著超氧陰離子（O2.-） 的生成［4］。因此，在針對治療高尿酸血癥醫藥研發方面，抑制XOD 生物活性與O2.-的清除成為研究者們的關注焦點之一［5-7］。

二氫楊梅素是一種雙手性、富電子體系的多酚類化合物，主要存在于顯齒蛇葡萄科藤本植物葉中，含量高達25%以上［8］。近年來，有關天然黃酮類化合物抑制XOD 生物活性的研究報道屢見不鮮，如2011 年，陳君課題組［9］報道了金銀花中的黃酮類成分槲皮素和木犀草素對體外XOD具有較強的抑制作用。隨后，張晶等［10］報道了多種黃酮類化合物單體，在體外XOD 生物活性抑制評價過程中，發現木犀草素、槲皮素、芹菜素和山柰酚均對XOD 具有較強的抑制作用，其中木犀草素IC50值為42.02 μmol/L，遠小于別嘌呤醇（126.57 μmol/L）。

然而，有關天然手性小分子黃酮醇類化合物抑制XOD的研究工作報道相對較少，且作用機制尚不明確。因此，本實驗以天然手性小分子黃酮醇類化合物--二氫楊梅素為研究對象，通過XOD 體外模型構建評價二氫楊梅素的抑制作用，再結合課題組前期有關二氫楊梅素的基礎研究［11-14］，分析二氫楊梅素抑制XOD 生物活性的作用機制。

1 材料

1.1 儀器 UV-759S 型紫外可見分光光度計（上海棱光技術儀器有限公司）； YQ-020A 型超聲清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）； FA124 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 試劑 黃嘌呤氧化酶（9.6 U/mg）、尿酸、黃嘌呤（分析純，上海源葉生物科技有限公司）； EDTA、磷酸、別嘌呤醇（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。焦磷酸鈉緩沖溶液 （0.1 mol/L） 為自制。水為二次蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液配制 0.1 mol/L 焦磷酸鈉緩沖溶液： 準確稱量焦磷酸鈉5.318 g、EDTA 0.017 5 g，置于200 mL 量瓶中，超聲溶解于純凈水，定容至刻度，磷酸調pH 至7.5 或8.5，現用現配。

0.125 mg/mL 尿酸母液： 精密稱取0.002 5 g 固體尿酸標準品，溶于20 mL 二次蒸餾水中。

不同梯度濃度尿酸標準溶液： 分別量取尿酸母液溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水稀釋至10 mL，配制成質量濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL 的尿酸溶液。

2.2 尿酸工作曲線繪制 采用紫外-可見分光光度計對不同梯度濃度的尿酸標準溶液進行光譜掃描，在290 nm 波長處對其吸光度進行測定。

曲線工作方程：Y＝0.049 7X＋0.005 7，R2＝0.999 3。

2.3 黃嘌呤氧化酶生物活性體外測試模型構建 參考謝濤、史坤等［15-16］報道，在0.1 mol/L 焦磷酸鈉緩沖溶液（0.4 mL，pH 7.5 或8.5） 中加入1.0 mmol/L Xan 溶液（1.0 mL），同時加入0.01 mg/mL XOD 溶液（1.6 mL），混勻，分別將反應體系置于37 ℃的水浴中恒溫15 min，利用紫外可見分光光度計對測試樣品進行全波長掃描，記錄290 nm 波長處吸光度，參比液為2 mL 緩沖液＋1 mL 1.0 mmol/L Xan 溶液。

2.4 黃嘌呤氧化酶體外活性抑制測試 參照“2.3” 項下方法，將不同濃度的待測溶液（0.4 mL） 和1.0 mmol/L Xan 溶液（1.0 mL） 依次加入反應器皿中，再加入0.01 mg/mL XOD 溶液（1.6 mL），混勻，水浴恒溫37 ℃，作用15 min，采用紫外可見分光光度計作全波長掃描，記錄290 nm 波長處吸光度，計算抑制率，參比液為0.4 mL 各濃度待測液＋1.6 mL 緩沖液＋1 mL 1.0 mmol/L Xan 溶液。

ΔA0，290為未加入抑制劑，290 nm 波長處的吸光度；ΔA1，290為加入抑制劑，290 nm 波長處的吸光度。

2.5 二氫楊梅素自氧化速率測試 量取0.5 mL 0.2 mg/mL二氫楊梅素溶液，轉移至弱堿性（pH 7.5） 緩沖液（1.5 mL） 中，混勻，室溫反應不同時間。隨后，采用紫外可見分光光度計進行掃描，記錄不同時間點325 nm 波長處吸光度，計算反應速率v。

ΔA1，325為二氫楊梅素自氧化作用不同時間點在325 nm波長處吸光度，ΔA0，325為二氫楊梅素在325 nm 波長處吸光度，t為反應作用時間。

2.6 數據分析 采用OriginPro 8.5 軟件對數據進行線性或非線性回歸法擬合。

3 結果

3.1 二氫楊梅素體外抑制黃嘌呤氧化酶生物活性評價 課題組前期研究發現，二氫楊梅素在堿性溶液中處于不穩定狀態，易發生自氧化作用，導致自身分子結構骨架被破壞，從而可能喪失原有結構的生物活性特征［12］。因此，本實驗進一步考察了不同堿性環境的黃嘌呤氧化酶體外測試模型對天然手性小分子二氫楊梅素生物活性的影響，采用pH 7.5 或8.5 的堿性環境體外黃嘌呤氧化酶測試模型，分別對不同濃度的二氫楊梅素和對照藥別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶生物活性進行評價，并加以對比分析。結果表明，不同濃度的二氫楊梅素和對照藥劑別嘌呤醇在pH 7.5 或8.5的堿性環境體外酶測試模型中，均可明顯地觀察到二氫楊梅素和別嘌呤醇對黃嘌呤氧化酶生物活性具有一定的抑制作用，且與藥劑濃度在一定的范圍內成正比關系，見圖1。值的注意的是，不同濃度的別嘌呤醇在pH 7.5 或8.5 的堿性環境體外酶測試模型中呈現相近的抑制作用，說明堿性環境因素對別嘌呤醇的生物活性影響較小，可以忽略不計。然而，二氫楊梅素結果呈現出較大的差異性，不同濃度的二氫楊梅素藥劑在pH 7.5 的堿性環境體外酶測試模型中生物活性抑制率最高可達48.47%，而且均高于在pH 8.5 的堿性環境中的所對應濃度藥劑的抑制率。由此可知，堿性因素對二氫楊梅素抑制黃嘌呤氧化酶生物活性的影響較大，可直接導致其抑制率降低。

圖1 堿性因素對二氫楊梅素的抑制作用的影響

3.2 二氫楊梅素堿性溶液中自氧化速率分析 結合課題組前期對二氫楊梅素在堿性溶液中自氧化作用機制研究發現，二氫楊梅素在不同堿性水溶液中的自氧化程度區別較大。因此，將0.5 mL 二氫楊梅素溶液（0.2 mg/mL） 分別轉移至堿性（pH 7.5 或8.5） 緩沖液（1.5 mL） 中，室溫作用0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 min，并采用紫外光譜儀記錄325 nm 波長處吸光度（二氫楊梅素自氧化特征峰，如圖2a所示），從而考察其自氧化速率。結果表明，二氫楊梅素在pH 8.5 的堿性水溶液中各時間點自氧化速率總體上呈下降趨勢，但均高于在pH 7.5 的堿性水溶液中，見圖2b。由此說明，二氫楊梅素在pH 8.5 的堿性環境中自氧化程度較高，其分子結構變化速率相對較快，喪失自身原有分子結構的生物活性也相對較快，從而進一步佐證了相同濃度的二氫楊梅素藥劑。另外，在pH 7.5 的堿性環境體外酶測試模型中作用相同時間時，表現出的生物活性抑制率較高。

圖2 二氫楊梅素在堿性環境中的自氧化速率

3.3 黃嘌呤氧化酶抑制作用機制分析 據報道，黃嘌呤氧化酶是由一個包含2 個鐵硫中心的N 端結構域、一個黃素腺嘌呤二核苷酸輔基FAD 結構域和一個C 端的鉬蝶呤蛋白結構域組成［17］。次黃嘌呤或黃嘌呤在C 端的鉬蝶呤蛋白結構域中，發生氧化還原反應，生成相對應的黃嘌呤或尿酸，同時釋放出自由電子（e-）。自由電子經N 端結構域中鐵硫［2Fe-2S］ 中心傳遞至FAD 結構域，此時，溶液中的游離氧分子（O2） 作為電子受體，在FAD 結構域中發生單電子還原反應，形成超氧陰離子自由基（O2.-） 或過氧化氫（H2O2），見圖3。

圖3 黃嘌呤氧化酶生物催化次黃嘌呤或黃嘌呤過程

本實驗進一步結合了課題組前期關于二氫楊梅素與超氧陰離子自由基的研究［14］，證實了二氫楊梅素在清除超氧陰離子自由基能力方面表現良好，其原因在于其分子結構中C 環中手性C-H 的存在，對超氧陰離子自由基清除具有重大貢獻。也就是說，二氫楊梅素與超氧陰離子自由基發生有效碰撞，C 環中手性3-C 上的氫原子與自由基發生串聯式氧化還原反應，促進二氫楊梅素分子結構向楊梅素分子結構進行轉化，該結論在課題組多項研究中被證實［11-12，14］，見圖4。

圖4 二氫楊梅素在超氧陰離子自由基參與下轉化為楊梅素過程

二氫楊梅素在黃嘌呤氧化酶體外測試模型中表現出的良好抑制活性，可能存在楊梅素分子結構的貢獻。為了佐證楊梅素結構對黃嘌呤氧化酶生物活性抑制的貢獻度，本實驗采用二氫楊梅素、楊梅素及楊梅素與二氫楊梅素不同濃度配比混合物（nMY/nDMY），分別進行黃嘌呤氧化酶生物活性抑制體外測試。結果，在pH 7.5 堿性的黃嘌呤氧化酶體外測試模型中，單體二氫楊梅素或楊梅素在濃度為500 μmol/L 時，其抑制率分別為38.33%、89.89%，見圖5。但當nMY/nDMY分別為5/495、10/490、15/485、20/480 和25/475 時，混合物濃度均為500 μmol/L，其對黃嘌呤氧化酶的生物活性抑制作用隨著楊梅素含量的增加，呈遞增趨勢，其抑制率均高于相同濃度二氫楊梅素，低于相同濃度楊梅素。因此，楊梅素分子結構的存在對二氫楊梅素的抑制率提升具有一定的貢獻度。

圖5 二氫楊梅素與楊梅素混合藥劑對黃嘌呤氧化酶的生物活性抑制作用

基于以上結果，本實驗對二氫楊梅素在弱堿性環境中抑制黃嘌呤氧化酶生物活性的作用機制進行合理的分析，見圖6。黃嘌呤氧化酶在生物催化次黃嘌呤或黃嘌呤過程中，生成尿酸并釋放出超氧陰離子自由基（O2.-），二氫楊梅素在超氧陰離子自由基的作用下，可實現部分向楊梅素分子結構轉化，形成二氫楊梅素和楊梅素的混合物。二氫楊梅素是非平面雙手性分子結構，而楊梅素屬于平面分子結構，因此該混合物在黃嘌呤氧化酶結合位點選擇時，可能出現一定的差異性，形成協同作用，從而表現出高效的酶抑制作用，其抑制率高于相同濃度的單體二氫楊梅素。

圖6 二氫楊梅素抑制黃嘌呤氧化酶作用機制

3.4 構效關系分析 基于上述天然二氫楊梅素對XOD 活性抑制評價，本實驗進一步探討了以二氫楊梅素分子結構為基礎的天然黃酮類化合物單體對XOD 活性抑制作用，并分析其構效關系。二氫楊梅素分子結構可分為3 個部分，A環上接入2 個酚羥基（分別位于5-和7-），并與C 環上的C＝O 發生π-π 共軛作用。另外，C 環上羰基鄰位碳屬于手性碳原子，為R型，且連接1 個羥基，同時C 環上2-碳原子也屬于R型手性碳原子，并與芳香B 環連接。在B 環上，3 個相鄰的酚羥基分別位于3’-，4’-，5’-，并與苯環發生p-π 共軛作用。鑒于此結構特征，本實驗選取了具有類似特征的黃酮類化合物單體楊梅素、槲皮素和山柰酚，探討其與XOD 活性抑制構效關系。從分子結構上分析，相比二氫楊梅素分子結構而言，天然楊梅素分子結構近似于平面分子，其中，A、B、C 三環存在良好的π-π 共軛效應，且C 環上2，3-碳原子上氫原子因消除形成碳碳雙鍵，見圖7。槲皮素和山柰酚雖然也具有近似于平面的分子結構，但在其B 環上分布的官能團羥基數存在一定的差異性，它們分別為2 個羥基（3’-和3’-） 和1 個羥基（4’-）。在體外XOD 活性抑制評價方面，雖然楊梅素、槲皮素及山柰酚的XOD 活性抑制率在一定范圍內存在濃度依賴性，但它們的IC50值存在顯著差異性。楊梅素的IC50值為20.73 μmol/L，最大抑制率為91.33%； 槲皮素的IC50值為203.61 μmol/L，遠高于楊梅素，說明B 環上3’-OH 對XOD 活性抑制具有顯著貢獻，見表1。另外，手性分子二氫楊梅素和平面分子山柰酚的最大抑制率分別為48.47%、12.76%，但未能計算出IC50值。由此可知，黃酮類分子結構趨近于平面狀態有助于提高體外XOD 活性抑制作用，且其貢獻度可能大于B環上羥基數的貢獻度。

表1 黃酮類化合物XOD 活性抑制率及IC50

4 結論

二氫楊梅素作為天然手性黃酮醇類化合物，在分子結構上，具有獨特的潛在生物活性特征。本實驗以天然二氫楊梅素為研究對象，探究其在不同堿性環境中對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，并進行科學的分析評價。另外，結合課題組前期關于二氫楊梅素與超氧陰離子自由基的研究成果，發現二氫楊梅素在超氧陰離子自由基的作用下可轉化為楊梅素，進一步分析二氫楊梅素對黃嘌呤氧化酶生物活性抑制的作用機制，從而首次揭示了二氫楊梅素與楊梅素對黃嘌呤氧化酶生物活性抑制的具有協同增效作用。該研究可為研究天然手性小分子化合物抑制黃嘌呤氧化酶提供重要參考依據。