歸脾湯對慢性心肌缺血大鼠氧化應激和凋亡作用的研究*

河北中醫藥大學

吳江立 賈玉濤△ 代 成 周偉偉 李愛英(石家莊 050091)

提要 目的：觀察歸脾湯對慢性心肌缺血大鼠氧化應激和凋亡的影響。方法：40只SD大鼠分為4組：正常對照組、模型組、歸脾湯低劑量組、歸脾湯高劑量組。除對照組外，其余各組經高脂飼料喂養和腹腔注射異丙腎上腺素建立慢性心肌缺血大鼠模型。歸脾湯給藥15 d后，蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心臟病理學形態變化，ELISA法檢測心臟組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平，免疫組化檢測活化的半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、BCL-Associated X(Bax)和B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的表達。結果：HE染色結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織排列紊亂，伴炎性細胞浸潤，心肌壞死。與模型組相比，歸脾湯低、高劑量組大鼠心肌組織受損程度減輕。與對照組相比，模型組大鼠心臟中SOD和GSH-Px含量下降(P<0.05)，CAT水平下降不顯著(P>0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。與模型組相比，低、高劑量歸脾湯組大鼠心臟中SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，低劑量歸脾湯組大鼠心臟中CAT水平升高(P<0.05)。免疫組化染色結果顯示與正常組大鼠相比，模型組大鼠心肌組織中Cleaved caspase-3和Bax表達增多(P<0.05)、Bcl-2表達降低(P<0.05)，與模型組相比，低、高劑量歸脾湯組大鼠心臟中Cleaved caspase-3和Bax的表達降低(P<0.05)，Bcl-2表達增高(P<0.05)。結論：歸脾湯可以減輕心肌缺血損傷，保護心肌，其機制可能與抑制氧化應激、降低細胞凋亡有關。

隨著人們生活水平的越來越高，飲食和生活方式的改變，冠狀動脈粥樣硬化心臟病(冠心病)的發病率越來越高。冠心病是由于冠狀動脈發生粥樣硬化，血管變窄，進而導致心肌缺血、缺氧而引發心肌受損、壞死的一類心臟病。該類缺血性心臟病致死率高，嚴重危害了人們的生命健康。中藥具有多靶點、毒副作用小等優勢，在治療心血管疾病方面前景光明。心肌缺血在中醫學中隸屬于“胸痹”“心悸”等范圍[1]。歸脾湯主治氣血兩虛證，在臨床上主要用來治療冠心病、高血壓、心力衰竭等疾病[2-3]。本研究擬探究歸脾湯對慢性心肌缺血損傷大鼠的保護作用及機制，也為冠心病等缺血類心臟病的治療提供新的思路。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(冀)2013-4-003。

1.2 主要藥品及試劑 歸脾湯(黃芪20 g，茯神、龍眼肉、人參 、酸棗仁、大棗、炙甘草各15 g，當歸、白術各12 g，遠志、木香各8 g，生姜6 g)采用水煎法來制備，156 g藥物加水煎煮2次，最后合并水煎液分別為50 mL和100 mL，對應生藥量為0.78 g/mL和1.56 g/mL。Rabbit anti Cleaved caspase-3購自Affinity公司；B淋巴細胞瘤 -2(Bcl-2)、 BCL-Associated X (Bax)抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCL-Associated X (Bax)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動物實驗造模及分組 大鼠慢性心肌缺血動物模型參考文獻[4]的方法進行。造模結束后給藥治療，為期15 d，歸脾湯低、高劑量組每天分別灌7.52、15.04 g/kg的歸脾湯，正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。

1.4 HE染色觀察心肌病理學改變 將心臟置于4%多聚甲醛溶液固定，隨后經75%、80%、95%、100%酒精依次脫去組織中水分，二甲苯透明、石蠟浸透、包埋成組織塊，在切片機上切成7 μm厚度的切片，經二甲苯脫蠟復水、進行HE染色，中性樹膠封片并在顯微鏡下觀察拍照。

1.5 心臟組織SOD、MDA、CAT和GSH-Px的測定 收集心臟組織并勻漿，離心收集上清液，根據試劑盒說明測定上清液中SOD、MDA、CAT和GSH-Px的含量。

1.6 免疫組化檢測Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達 切好的石蠟切片經二甲苯脫蠟、酒精復水、高壓鍋加熱修復抗原，滴加3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，一抗孵育過夜、PBS清洗后滴加辣根酶標記的二抗，DAB顯色，再進行蘇木素復染后，封片觀察。

2 結果

2.1 心肌組織病理染色結果 心臟組織HE染色結果顯示，正常對照組心肌組織排列整齊、染色均勻，未出現炎性細胞浸潤。模型組心肌纖維排列雜亂，心肌間質內現大量炎性細胞，心肌組織壞死。低、高劑量歸脾湯組心肌組織炎性細胞減少、心肌排列較整齊，心肌損傷有所減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織形態學變化(HE，×200)

2.2 心臟氧化-抗氧化狀態的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠SOD和GSH-Px水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。與模型組相比，低、高劑量歸脾湯組SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。與正常對照組相比，模型組大鼠心臟CAT水平有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比，低劑量歸脾湯升高了大鼠心臟CAT水平(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心臟中MDA、SOD、CAT及GSH-Px水平的變化

2.3 歸脾湯對缺血大鼠心臟組織中Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2表達的影響 免疫組織化學染色顯示，各組大鼠心臟組織細胞質中均可檢測到Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的陽性信號。與正常對照組相比，心肌缺血模型組大鼠心臟組織Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達降低。與模型組相比，歸脾湯低、高劑量組大鼠心臟組織Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達下降，Bcl-2蛋白表達升高。詳見圖2、表2。

表2 各組大鼠心臟中Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax 蛋白平均光密度值

圖2 免疫組化檢測Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白在心臟中的表達(免疫組化，×200)

3 討論

隨著人們生活水平的逐漸提高，冠心病的發病率逐年升高，若不及時控制，可發展為心肌梗死，嚴重者會出現猝死。中醫學中并無“心肌缺血”這一病名，將其歸屬于“胸痹”“真心痛”“心悸”等范疇?！督饏T要略》記載：“陽微陰弦，即胸痹而痛?！痹摬〔∥辉谛?，涉及肝、腎、脾。病機為本虛標實。心血不足，心脈失于濡養、陰陽虧損為本虛，寒、痰、血瘀為標實。氣虛則不能帥血，血虛則不能載氣，脈道不充盈，滯于脈絡則發病。國醫大師路志正[5]認為脾胃失調是冠心病的主要病機，脾胃生化不足，氣血虧虛；脾胃運化失常，膏濁痰濕致心脈壅塞。在治療時選用具有健脾益氣、養心安神功效的歸脾湯[6]，該方由人參、茯神、龍眼肉、白術、酸棗仁、黃芪、當歸、甘草、遠志、木香、大棗、生姜組成。黃芪和龍眼肉補脾益氣以生血為君藥；人參、當歸、白術、酸棗仁益氣補脾、安神寧心為臣藥；遠志、茯神交通心腎，木香理氣，炙甘草益氣補脾，復中焦運化之功，為佐使；加之大棗和生姜調理脾胃，諸藥配伍使用，既能補脾益氣，又可養心補血。脾旺則血生、心血生則胸痹除；氣為血之帥，氣旺則血生，血足則養心，心有所養，則疾病得除。

心肌缺血的病理生理機制比較復雜，涉及血管內皮細胞功能障礙、氧化應激、心肌細胞能量代謝異常、炎癥和細胞凋亡等。心肌組織HE染色顯示心肌出現大量炎性細胞，炎癥反應不僅會導致氧化應激的產生，引起心肌細胞的氧化損傷，也可引起心肌細胞凋亡，最終使心肌細胞壞死。心肌缺血發生時，體內的促氧化和抗氧化作用失衡，活性氧(ROS)生成增加、激活氧化應激，進一步加重心臟損傷[7]。心臟中的SOD、CAT和GSH-Px是細胞內重要的抗氧化酶，可以清除體內的超氧化物和自由基。MDA是脂類物質氧化的產物，過多的MDA又會反過來誘導ROS的生成，破壞細胞DNA和蛋白質，使SOD和GSH-Px等酶的活力進一步降低。MDA含量的多少表示機體受到ROS損傷的程度，SOD、CAT和GSH-PX的活性則反映了機體內抗氧化防御系統能力的強弱。本研究中，模型組大鼠心臟中MDA含量增加，說明缺血激活了氧化應激，過多的氧自由基使脂類物質發生氧化；SOD、CAT和GSH-Px活性降低，說明缺血導致細胞的抗氧化防御系統受損，歸脾湯給藥治療后心臟MDA含量下降，SOD、CAT和GSH-PX活力升高。劉麗等報道歸脾湯化裁經驗方可以提高脾虛型黃褐斑患者SOD水平、降低MDA水平[8]。周文靜等研究報道歸脾湯可通過升高肝臟GSH-Px和SOD水平減輕雷公藤所致肝損傷[9]。歸脾湯的主要活性成分黃芪甲苷、人參皂苷、甘草酸等均可以抑制MDA生成[10]。本研究結果表明歸脾湯通過減輕機體的氧化應激損傷來保護心肌缺血大鼠的心臟。

心肌缺血激活了氧化應激，導致ROS生成過度，過度的氧化應激可誘導心肌細胞發生凋亡，氧化應激引起線粒體膜電位下降，導致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等蛋白質，激活半胱氨酸蛋白家族，啟動Caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡[11]。Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可與Bax競爭性結合，Caspase-3是凋亡的執行者，心肌缺血發生時往往伴隨著心肌細胞的凋亡[12-13]。抑制心肌細胞的凋亡能夠減輕心肌缺血損傷。免疫組化結果顯示模型組大鼠心肌組織中Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，與以往文獻報道一致[14]，說明缺血誘導了心肌細胞的 凋亡，歸脾湯給藥治療后降低了Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達，提高了Bcl-2的表達。高麗等報道歸脾湯含藥血清通過減少細胞凋亡來增加骨髓細胞存活率[15]。本研究結果表明歸脾湯可能通過抑制心肌細胞凋亡，保護心肌缺血大鼠的心臟。

綜上所述，歸脾湯可通過抑制氧化應激、減少細胞凋亡，保護慢性心肌缺血大鼠的心臟。