慢性高氧對小鼠肺功能的影響研究

唐俊，李可欣，張鳳梅

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 400016；2.重慶醫科大學附屬大學城醫院，重慶 400030；3.重慶醫科大學實驗動物中心，重慶 400016）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是一種復雜的過程，一些產前和/或產后因素會干擾下呼吸道發育，導致嚴重的終身疾病。Northway[1]等于1967年首次使用術語“支氣管肺發育不良”來描述需要機械通氣的早產兒中由氣壓傷和氧損傷引起的慢性肺部損傷。BPD的病理特征表現為隔膜減少和肺泡發育不全，導致大肺泡簡化，氣體交換面積減少。肺血管平滑肌增生，肺泡毛細血管異常，間質纖維增生和肺泡隔膜增多，病死率和再入院率較高[2]。氧療是通過消除缺氧因素后來治療缺氧的治療措施，是導致BPD的高危因素之一[3]。高濃度氧容易在體內形成損害肺部的高活性氧自由基，對患兒的遠期發育具有一定影響[4,5]。BPD引起的慢性呼吸道疾病是早產最常見的長期并發癥。近年來對BPD發病機制的了解有所增加，但BPD導致肺損傷的機制尚未完全闡明。目前的治療方法主要有控制感染肺、保護性通氣、氧療，給以NO等，但常用的治療措施效果較為有限，暫無特效藥物及其他治療方法[6]。

BPD可導致嚴重的肺損傷[7,8]，可持續性造成肺功能減弱。雖然肺損傷是BPD的標志性特征，但文獻報道的多種高氧誘導BPD動物模型均無法對肺功能進行充分評估。目前大多研究是通過HE染色和定量組織學肺損傷評分評估肺功能，但這些方法均無法有效地評價肺功能。因此，本研究旨在探討慢性高氧對小鼠氣道阻力及肺功能的影響，為研究BPD肺功能提供參考。

一、材料與方法

（一）實驗動物

經重慶醫科大學實驗動物中心采購，實驗動物生產許可證編號為SCX K(渝)2022-0 010的SPF級C57BL/6J新生小鼠。該實驗在重慶醫科大學實驗動物中心進行，實驗動物使用許可證號為SYXK(渝)2022-0016。

（二）儀器設備

無創動物肺功能檢測儀(FinePointe?NAM)、100%醫用氧氣(重慶朝陽氣體有限公司)、數字測氧儀（CY-100，杭州立華儀器有限公司）。

（三）模型制備

隨機將20只出生24h內的SPF級的C57BL/6J小鼠分為對照組和高氧組，每組10只。在自制的密閉氧箱中（40cm×30cm×25cm）放置高氧組小鼠，持續緩慢輸入100%的氧氣，使 FIO2保持在85%左右，并將空氣組放置在同一室內[9]。每天將高氧組與對照組的母鼠進行更換，避免氧濃度過高導致中毒，降低其喂養能力。每日開箱1h，完成稱重、加水、加料及換墊料等工作。高氧干預21天后進行肺功能檢測，使用4%多聚甲醛固定各組小鼠左肺，右肺于-80℃進行凍存。

（四）小鼠基礎肺功能測定

使用FinePointe? NAM動物肺功能儀器對各組小鼠進行基礎肺功能檢測。日齡為21d時，每組隨機取5只小鼠。將處于清醒、活動自如狀態的小鼠類放入全身體積描計箱，待其穩定后，持續監測肺功能指標變化10min并計算平均值[10]。

（五）肺組織形態學分析

將左肺固定于4%多聚甲醛24h后，經脫水透明和石蠟包埋，切片為4～5μm，經脫蠟水化后，制成HE染色切片，在光鏡下觀察組織病理和形態的變化。

1.放射狀肺泡計數（Radical alveolar counts,RAC）

每組隨機抽取3～5個樣本，每個樣本隨機選取一個切面，每個切面隨機選取5個不重疊視域（×200），以每個視域下肺泡的平均數為肺泡計數[11]。

2.平均肺泡截距（Mean linear intercept，MLI）

在顯微鏡視域（×200）中央畫十字交叉線，對所有與交叉線相交的肺泡間隔數(NS)進行計算，進行十字線總長(L)的測算；對每個視域的平均內襯間隔計算(MLI=L/NS)，取其平均數，表示肺泡平均內徑[12]。

（六）統計學分析

資料分析采用SPSS 21.0軟件，兩組資料均經過t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

二、結果

（一）不同組21日齡小鼠的體重及死亡率的比較

對照組的小鼠狀態正常，體重隨日齡上升。21天時空氣組、高氧小鼠體重分別為(7.84±0.24)g，(5.21±0.61)g。空氣組、高氧組21日齡小鼠的存活率分別為100%、70 %，如圖1所示。

圖1 慢性高氧影響新生鼠體重及生存率

（二）慢性高氧導致小鼠肺組織發育受損

與對照組相比，高氧組小鼠肺泡間隔變厚、破裂，肺泡數量減少，且肺泡腔變大(圖2)。高氧組MLI明顯升高，RAC值明顯下降，這表明高氧組小鼠肺組織功能不全，發育受阻。

圖2 小鼠肺組織病理形態改變(HE，200 ×)

圖3 各組小鼠肺功能比較

（三）小鼠的肺功能變化

與對照組相比，高氧組的呼吸頻率（Frequency of breathing，F），潮氣量（Tidal volume，TV），肺通氣量（Minute volume，MV），呼氣峰流速（Peak expiratory flow，PEF），吸氣峰流速（Peak inspiratory flow，PIF）、50%呼氣流量（The Expiratory Flow at 50% Expired Volume，EF50）值均降低。特異性氣道阻力（Specific airway resistance，SRAW）明顯增加，表明慢性高氧導致小鼠的肺功能受損。

（四）慢性高氧對遠期肺發育的影響

為了進一步探討慢性高氧對小鼠遠期發育的影響。將高氧組小鼠置于85%O2處理21天后，將小鼠置于正常室內空氣中喂養（21%O2）至小鼠8周齡，檢測其肺形態學及肺功能的變化。與對照組相比，高氧組小鼠肺泡腔擴大，肺泡數量減少，肺發育紊亂(圖4)。

圖4 慢性高氧對遠期小鼠肺發育的影響

（五）慢性高氧對遠期肺功能的影響

與對照組相比，高氧組的呼吸頻率、肺通氣量值顯著降低，而特異性氣道阻力顯著增加，表明慢性高氧導致小鼠遠期肺功能受損（圖5）。

圖5 慢性高氧對遠期小鼠肺功能的影響

三、討論

肺發育可以概括為五個階段：胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期和肺泡期，這一發育過程從宮內生命早期開始，并在出生后的第一年繼續進行。越來越多的證據表明，早期暴露于氧化應激會導致肺部發育過程改變，使肺部更容易患上許多早產兒的典型疾病，例如呼吸窘迫綜合征、支氣管肺發育不良和持續性肺動脈高壓等。正常的肺泡發育是由體積大、數量少的囊泡向體積小、數量多的肺泡轉化的過程，但在肺泡發育的囊泡形成期將新生動物暴露于高氧下，使肺泡正常發育過程受阻，肺泡腔擴大、數量減少，肺泡正常結構消失，肺泡隔膜增厚，肺組織纖維化，即囊泡期向肺泡發育期的轉化受到阻滯。這一過程可以模擬人類新生兒BPD的病理特征[13-15]。

肺功能是呼吸系統疾病必不可少的檢查之一，在疾病診斷、病情發展、預后評估等方面都有廣泛的應用，在臨床上意義重大[16]。F、MV、TV、PEF、PIF等是臨床常用反映肺功能的重要指標。本研究通過使用85%高氧誘導21d成功建立新生兒支氣管肺發育不良的動物模型，與正常組小鼠相比，高氧組小鼠發育緩慢，21d體重較輕，死亡率升高。通過HE染色研究兩組小鼠肺組織病理形態的變化，發現與對照組相比，高氧組小鼠肺泡腔擴大，肺泡數量減少，肺發育紊亂。通過肺功能儀對各組小鼠進行基礎肺功能檢測，結果顯示，高氧組肺組織結構紊亂，特殊氣道阻力增加，F、MV、TV、Frc、PIF、PEF、EF50值均顯著下降，提示高氧可致小鼠肺損傷。接下來，本研究對慢性高氧對遠期肺發育及肺功能的影響進行了探索，將高氧組小鼠置于85% 高氧處理21d后，將小鼠 置于正常室內空氣中喂養至8周齡，結果發現與對照組相比，高氧組小鼠在正常環境成長至8周齡時，肺發育仍然相對緩慢，且肺功能受損情況仍未改善，這表明高氧對小鼠發育期及遠期肺功能均有較大損害。近期有文獻研究發現，在嬰兒期被診斷患有支氣管肺發育不良的兒童患有呼吸系統疾病風險較正常兒童更高，發育中的肺暴露于高氧會導致活性氧的產生，從而導致細胞損傷和細胞凋亡、炎癥增加和肺水腫，這些不良因素可能導致青少年乃至成人時期呼吸系統疾病風險增加和肺功能下降[17]。

綜上所述，慢性高氧可誘導新生鼠肺發育不良、損害肺功能，并對遠期肺發育產生持續影響。本研究為研究BPD機制及治療方法提供了理想的動物模型，奠定了可靠的實驗依據和重要的理論基礎。