大腸桿菌表達高性能融合魷魚環齒-類彈性蛋白的發酵優化

姜正日， 殷仁凱， 王澤建， 錢江潮

（華東理工大學生物工程學院, 生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237）

生物力學功能蛋白如蛛絲、類彈性蛋白、魷魚環齒蛋白等制備的纖維材料因其機械強度高、易降解、具有生物相容性，廣泛應用于醫藥、組織工程和生物材料等領域[1-5]。利用魷魚環齒（Squid Ring Teeth, SRT）蛋白序列（PAATAVSHTTHHAP）和類彈性蛋白（Elastin-like polypeptide, ELP）序列（VPGVG,VPGKG）設計融合蛋白基序（PAATAVSHTTHHAPVPGVG(VPGKG)5），重復該基序得到相對分子質量為192 kDa 的重組蛋白SRT-ELP36，在大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）中表達后，所制備的重組蛋白SRT-ELP36 單絲纖維斷裂強度和韌性分別高達630 MPa 和130 MJ/m3，優于重組蛛絲蛋白及化學再生蠶絲纖維[6-7]。在此基礎上，需針對重組蛋白SRTELP36 在大腸桿菌中的表達進行優化，提高重組蛋白體積產量，才可實現其工業化應用。

E.coli因遺傳背景清楚、生長速率快、培養成本低等特點，已成為最常用的外源蛋白表達宿主[8-10]。目前也有利用大腸桿菌表達力學功能蛋白的研究工作。Pena 等[11-12]將SRT 基因克隆到pET14b 載體系統并轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，可獲得純度約為90%、體積產量約為1 g/L 的SRT 蛋白。Collins 等[13]發現大腸桿菌BL21(DE3)表達類彈性蛋白（Silk-Elastin-Like Protein, SELP）過程中供氧條件和誘導時機對蛋白表達至關重要。在此基礎上，Barroca 等[14]利用能夠產生毒素的宿主和產生抗毒素的質粒構成的SCS（Separate-Component Stabilization System）系統，解決了大腸桿菌發酵過程中的質粒丟失問題，可確保存活的細胞均含表達質粒，提高了類彈性蛋白的產量。

為了提高重組蛋白SRT-ELP36 的表達水平，本文通過分批培養和補料分批培養的方式考察了宿主菌、培養基、誘導時機、供氧量等條件對重組大腸桿菌生長和蛋白表達的影響，獲得了提升大腸桿菌BL21(DE3)表達重組蛋白SRT-ELP36 的最優化控制工藝條件，并在50 L 發酵罐對最優化條件進行驗證，為工業化大規模生產重組蛋白SRT-ELP36 奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 原料和試劑

1.1.1 菌株 大腸桿菌BL21(DE3)購自Thermo Fisher Scientific 公司，BLR(DE3)和pET-25b(+)-SRT-ELP36由中國科學院長春應用化學研究所劉凱教授提供[6]。轉化了表達質粒pET-25b(+)-SRT-ELP36 的重組大腸桿菌BL21(DE3)和BLR(DE3)由本實驗室構建、保藏。

1.1.2 實驗儀器 TS-200B 型恒溫搖床（上海天呈實驗儀器制造有限公司），FA1004 型電子天平（上海天平儀器技術有限公司），UV-1200B 型可見光分光光度計（上海美普達儀器有限公司），Mini Protein 3 型垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司），5 L、50 L 發酵罐（上海國強生化工程裝備有限公司），LC-2010A 型高效液相色譜（日本島津公司），YX280A 型壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司），MAX300-LG 型尾氣過程質譜儀（美國Extrel 公司）。

1.1.3 培養基 LB（Luria-Bertani）培養基（g/L）：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，在LB 培養基中加入15 g/L 瓊脂得到固體LB 培養基；TB（Terrific Broth）培養基（g/L）：酵母提取物24，蛋白胨12，甘油5，KH2PO42.32， K2HPO412.54； SOB（ Super Optimal Broth）培養基（g/L）：酵母提取物5，蛋白胨20，NaCl 0.5，KCl 0.19，MgCl20.95；SOC（Super Optimal Broth with Catabolite Repression）培養基（g/L）：酵母提取物5，蛋白胨20，葡萄糖3.6，NaCl 0.5，KCl 0.19，MgCl20.95；SB（Super Broth）培養基（g/L）：酵母提取物20，蛋白胨35，NaCl 5。M9 培養基（g/L）：葡萄糖4，MgSO4·7H2O 0.49， CaCl2·6H2O 0.022， Na2PO4·7H2O 12.8，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0；發酵罐中所用初始培養基（g/L）：KH2PO46.67，蛋白胨13.0，一水合檸檬酸3.25，CaCl2·H2O 0.05，MgSO4·7H2O 2.5 g/L；葡萄糖補料溶液：650 g/L。

1.2 培養方法

1.2.1 種子制備 將重組大腸桿菌劃線接種于含有氨芐青霉素的抗性LB 固體平板中，放置于37 ℃恒溫培養箱培養16～18 h。挑取生成的單菌落接種至含有5 mL LB 液體培養基（含有終質量濃度為100 mg/L氨芐青霉素）的無菌試管中，于37 ℃恒溫搖床中220 r/min 轉速下培養12 h。

1.2.2 搖瓶培養 將培養好的種子液按2%的接種量接種于裝有50 mL 培養基（含有終質量濃度為100 mg/L的氨芐青霉素）的250 mL 搖瓶中。于37 ℃恒溫搖床中220 r/min 震蕩培養，定時取樣檢測OD600（波長600 nm 處的吸光值）并進行目標蛋白表達量分析。

1.2.3 補料分批培養 5 L 發酵罐中裝入3 L 發酵培養基，121 ℃滅菌30 min 后，按3%的接種量接入種子液（氨芐青霉素質量濃度200 mg/L）。初始條件為37 ℃、500 r/min、通氣量為1 vvm，待溶氧回升時，流加葡萄糖進行補料培養，至菌體OD600達35.0 后加入終濃度為0.5 mmol/L 的ⅠPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）進行誘導培養。培養過程中使用氨水調節pH 為6.9，同時通過轉速調整控制溶氧不低于20%。

50 L 發酵罐中裝入30 L 發酵培養基，121 ℃滅菌30 min 后，按1.3%的接種量接入種子液（氨芐青霉素質量濃度200 mg/L）。通氣量為1 vvm，通過轉速調整控制溶氧不低于20%。。

1.3 檢測方法

1.3.1 菌濃的測定 將發酵液稀釋適當倍數后, 測定OD600。取1 mL 發酵液、12 000 r/min離心2 min，將得到的菌體洗滌2 次，于105 ℃烘干至恒重后，稱量菌體干重（Dry Cell Weight, DCW）。

1.3.2 重組蛋白表達水平的確定 將誘導后的發酵液離心后收集菌體，加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min 后離心取上清液即可上樣。用移液槍吸取樣品加入蛋白凝膠孔后，電泳儀設置電壓為80 V，待樣品通過分離膠與濃縮膠交界面時，調整電壓為120 V，約45 min 樣品距離凝膠底部1 cm 處停止電泳。根據考馬斯亮藍染色法對目標蛋白濃度進行半定量分析，使用Ⅰmage J 軟件對SDS-PAGE 電泳圖進行目標蛋白條帶灰度掃描，分析出每條泳道目標蛋白與定量Marker 的比值，從而計算出目標蛋白的含量。

1.3.3 氧攝取速率（OUR）的檢測 通過尾氣過程質譜儀對發酵尾氣中的二氧化碳、氮氣和氧氣等氣體含量進行檢測，通過計算得到OUR[15]。

1.3.4 胞外乙酸濃度的檢測 發酵液中的胞外乙酸濃度使用高效液相色譜儀（HPLC）進行測定[16]。首先，吸取不同時間的發酵液樣品，離心收集上清液并使用0.22 μm 水相過濾膜過濾至液相瓶中。檢測條件如下：液相流動相及對應流速分別為0.01 mol/L 稀硫酸、0.4 mL/min；紫外檢測波長為210 nm，保持柱溫50 ℃，樣品進樣量為10 μL，且每個樣品檢測時間均為45 min。

2 結果與討論

2.1 搖瓶發酵條件優化

2.1.1 宿主菌的篩選 不同的大腸桿菌宿主菌在生長、表達外源基因、代謝副產物積累以及耐受抑制性代謝物能力等方面都存在較大的差異。BL21(DE3)和BLR(DE3)宿主菌均適用于表達pET-25b(+)質粒，BL21(DE3)是應用廣泛的良好表達宿主，發酵過程中具有乙酸積累較少的特點，但質粒穩定性較差。BLR(DE3)質粒穩定性較好，可穩定重復序列的表達，但存在誘導后生長抑制及競爭性質粒不穩定等情況[17-18]。在TB 培養基中，BL21(DE3)和BLR(DE3)培養至OD600約1.0 時進入指數增長期時開始誘導，考察兩種宿主菌的生長和蛋白表達情況（圖1）。兩種宿主菌的生長相差較小，BL21(DE3)表達重組蛋白SRT-ELP36 的最高體積產量達0.2 g/L，約為BLR(DE3)的1.8 倍，且BL21(DE3)表達蛋白的單位菌體產量始終高于BLR(DE3)。 BL21(DE3) 和BLR(DE3)在誘導2 h時單位菌體蛋白產量（Specific production）最高，分別為110、70 mg/g。因此，選擇蛋白表達水平較高、生長速度較快的BL21(DE3)為宿主菌進行后續發酵過程優化。

圖1 誘導階段重組菌BL21(DE3)（a）和BLR(DE3)（b）的生長及蛋白表達（n=3）Fig.1 Cell growth and protein production of recombinant BL21(DE3) (a) and BLR(DE3) (b) during induction period (n=3)

2.1.2 培養基的選擇 本文選擇了常用的6 種培養基：富營養的SB 培養基，低營養的SOC、SOB、LB 和M9 培養基，及含有磷酸緩沖液的富營養TB 培養基，考察不同培養基對BL21(DE3)蛋白表達的影響，結果如圖2 所示。營養豐富的TB 和SB 培養基有利于重組菌生長，誘導8 h 后的OD600分別可達5.9 和5.3。TB 培養基中重組蛋白SRT-ELP36 的表達量明顯優于SB 培養基，這是由于TB 培養基中添加了磷酸緩沖液，誘導后可長期維持pH 于7.0 左右。在低營養培養基LB、SOB 和SOC 中菌體生長速率普遍低于TB 和SB 培養基，與SOB 培養基相比，SOC 中額外添加了葡萄糖作碳源，重組菌生長稍快，蛋白的表達量比較一致。因此，具有pH 緩沖能力且營養豐富的TB 培養基利于BL21(DE3)生長和表達SRT-ELP36。

圖2 不同培養基對重組菌BL21(DE3)生長、蛋白體積產量和培養液pH 的影響Fig.2 Effects of different culture mediums on the growth of BL21(DE3), protein volumetric production and culture pH

2.1.3 誘導時機的確定 在搖瓶中進行大腸桿菌表達外源蛋白時，通常控制重組菌生長至對數生長初期（OD600為0.6～1.0）時開始誘導，此時細胞代謝旺盛，蛋白合成速率較快，但此時菌體量較低，ⅠPTG 誘導可能會抑制菌體在誘導期的生長速率，限制外源蛋白的大量表達[19-20]。根據重組菌的生長曲線（圖3（a）），選擇培養2、4、8 h，分別對應于對數生長前期（OD600為1.05）、對數生長后期（OD600為4.0）和穩定期前期（OD600為8.0）這3 個不同的誘導時機進行誘導，考察了不同生長階段誘導對重組蛋白表達的影響，結果如圖3 所示。雖然起始誘導時的菌體量最低，對數生長前期誘導后重組菌在整個誘導的20 h內可持續生長，最終的菌體OD600與對數生長后期誘導時接近。對數生長后期和穩定期前期誘導時，重組菌誘導后6 h 基本停止生長，穩定期前期誘導的 OD600最高可達12.4。對數生長前期誘導時，菌體單位蛋白產量在初始2 h 內快速達到最高，但隨著發酵過程的進行不斷下降，且菌體量始終最低，導致蛋白體積產量最低。培養4 h 后開始誘導，單位菌體蛋白產量不斷上升，誘導6 h 后蛋白產量超過另2 個誘導時機（對數生長后期、穩定期前期），持續至誘導12 h 達到最高產量為140 mg/g，此時蛋白體積產量也達到最高0.39 g/L。穩定期前期誘導，不利于胞內蛋白合成，單位菌體胞內蛋白體積產量的最高值在3 個誘導時機（對數生長前期、對數生長后期、穩定期前期）中最低，由于誘導階段的菌體濃度始終最高，蛋白體積產量在誘導后8 h 內可保持較高水平，最高達到0.34 g/L，且從誘導10 h 后就開始下降。比較3 個誘導時機的結果，可以發現，在對數生長后期（OD600為4.0）時誘導，蛋白體積產量較高，發酵周期較短，可選為最佳誘導時機。

圖3 重組菌BL21(DE3)生長曲線（a）以及起始誘導菌體濃度對菌體生長（b）、蛋白體積產量（c）和單位菌體產量（d）的影響Fig.3 Growth curve of BL21(DE3) (a), effects of initial OD600 at induction on cell growth (b), protein volumetric production (c) and specific production (d)

2.1.4 供氧水平對生長和蛋白表達的影響 培養環境中的溶解氧水平是影響大腸桿菌生長及蛋白表達的一個重要參數，過高或過低的溶解氧都會直接影響菌株生長及產物的合成[21]。在搖瓶中，可以通過降低裝液量，即裝液比（裝液量與搖瓶體積之比），來提高供氧和培養液中的溶氧水平，考察不同溶氧水平對重組大腸桿菌生長及蛋白表達的影響，結果如圖4所示。在培養起始的2 h 內，不同裝液比條件時菌體均可快速生長，培養2 h 開始誘導后，菌株的比生長速率只在裝液比為5%時維持基本不變，裝液比越高，比生長速率下降趨勢越明顯。當裝液比為5%時，重組菌比生長速率可維持至培養8 h 后下降，在培養14 h 最高OD600達到22.3，但在培養16 h 后迅速下降。菌株的蛋白體積產量隨裝液比的下降而增加，裝液比為5%時的目標蛋白體積產量最高可達0.6 g/L，分別為10%、20%和33%裝液比的1.3、1.5、3.7 倍。由此可見，在BL21(DE3)表達SRT-ELP36蛋白的過程中，維持充足的供氧和溶氧水平對于提高菌體生長和蛋白體積產量都非常重要。當裝液比為5%時，誘導過程胞內外蛋白的分析結果顯示，誘導12 h 以后，重組蛋白SRT-ELP36 占總蛋白的比例逐漸下降，發酵液上清中的蛋白濃度逐漸增大，說明SRT-ELP36蛋白積累降低，菌體發生了裂解。但是，隨著蛋白體積產量的降低和菌體裂解，并未觀察到SRT-ELP36 蛋白被釋放到胞外，可能是蛋白在胞內發生了降解，此時菌體濃度下降、蛋白水解的出現可能與營養物質的耗竭有關。因此，控制高供氧量促進重組菌生長和蛋白表達的同時，需注意及時補充底物，并確定合理的發酵結束時間以防止細胞衰亡引起的目標蛋白裂解。

圖4 不同搖瓶裝液比對重組菌BL21(DE3)生長（a）和蛋白體積產量（b）的影響；裝液比為5%時菌體裂解液及發酵液上清的蛋白電泳（c）Fig.4 Effects of volumetric ratio of medium to flask on the growth of BL21(DE3) (a) and protein volumetric production (b); SDS-PAGE analysis of the cell lysate and fermentation broth when the volumetric ratio of medium to flask was 5% (c)

2.2 補料分批高密度培養工藝條件優化

在搖瓶中的研究結果證實誘導時機、供氧水平和營養物質的補加是影響BL21(DE3)生長和重組蛋白SRT-ELP36 表達的關鍵因素。基于這些結果，我們在反應器中考察了補料分批培養模式下最優化的發酵條件，進一步提高重組蛋白SRT-ELP36 的產量。

2.2.1 起始誘導時機的優化 在5 L 發酵罐中進行分批補料培養，通過溶氧串聯轉速控制溶氧的體積分數范圍為20%～30%，在補料階段流加葡萄糖溶液（650 g/L）維持發酵液中葡萄糖質量濃度在菌體所需范圍內（≤2 g/L），可實現重組菌高密度生長。為了實現重組蛋白的高效表達，根據搖瓶中考察誘導時機的結果，選擇了補料階段菌濃OD600分別達到25、35、50 和70 時進行誘導，取樣測定菌濃和重組蛋白SRT-ELP36 的表達產量，實驗結果如圖5 所示。適當提高起始誘導的OD600，有利于誘導期內達到較高密度的菌量，起始誘導OD600為50 時，菌體在充足的補料和供氧條件下，誘導階段可保持較高的生長速率，OD600最高可達100 以上。當誘導菌濃OD600提高到70 時，重組菌的生長速率明顯降低，在誘導4 h 后基本停止生長。而起始誘導菌濃OD600為25 和35 時，重組菌生長速率在誘導2 h 后明顯下降，最高OD600僅為50.3 和62.6，這可能與代謝副產物乙酸積累從而抑制菌體生長有關[22-24]。從蛋白體積產量來看，OD600為25 誘導時蛋白體積產量最低，單位菌體的蛋白產量雖然比高菌濃OD600為50 和70 誘導時高，但菌體生長太慢導致無法實現蛋白高產。起始誘導OD600提高到35 以上后，蛋白體積產量均可達到OD600為25 時的1.4 倍以上，起始誘導OD600為50 時蛋白體積產量最高，為1.18 g/L。起始誘導OD600為35 時單位菌體產量最高，達60 mg/g，但菌體生長緩慢限制了蛋白表達量的進一步提高，而OD600為50 和75 時誘導單位菌體產量較低而生長較快，表明菌體更多利用培養基中的營養物質進行菌體生長而非蛋白合成。因此，后續采用起始誘導OD600為35，進一步通過優化補料和供氧促進菌體生長和蛋白合成。

圖5 不同起始誘導菌濃時重組菌BL21(DE3)生長（a）、發酵液中乙酸濃度（b）、蛋白體積產量（c）和單位菌體蛋白產量（d）Fig.5 Cell growth (a), acetic acid concentration of the broth (b), protein volumetric production (c) and specific production (d) when cultures were induced at different initial OD600

2.2.2 氧消耗速率（OUR）水平的調控和優化 OUR是表征發酵過程中菌體呼吸代謝強度的重要參數，通過在線測定排出氣體成分能夠計算發酵過程中菌體的實時OUR，用于指導過程控制和優化。大腸桿菌表達外源蛋白是一個高耗氧過程，然而氧消耗速率與蛋白表達的關系卻鮮有報道。在5 L 發酵罐中，我們通過在誘導階段保持較高的補糖速率來維持菌體較高的OUR 水平（圖6），并控制轉速和通氣保持兩種條件下一致的溶氧水平，不同OUR 水平時重組菌生長和蛋白表達如圖7 所示。

圖6 不同補糖速率對OUR 的影響Fig.6 Effects of different glucose feed rates on OUR value

圖7 不同氧消耗速率時重組菌生長與發酵液中乙酸濃度（a）、蛋白體積產量與單位菌體產量（b）Fig.7 Cell growth and acetic acid concentration of the broth (a) and protein volumetric production and specific production (b) when cultures were induced at different OUR levels

誘導開始后，提高葡萄糖的流加速率，可使OUR 持續增長至（180±5） mmol/(L·h)，此后由于菌體量增加及設備供氧限制，OUR 逐漸下降并穩定在150 mmol/(L·h)左右。而控制葡萄糖流加速率，也使OUR 維持在較低的水平(130 mmol/(L·h)左右)。較高的OUR 水平有利于菌體生長，最高OD600可達88，約為較低OUR 水平的1.4 倍，且副產物乙酸的積累量下降了58%。此外，開始誘導的1 h 內，重組菌可快速啟動蛋白表達，OUR 水平不影響蛋白表達。但隨著誘導的持續，較高的OUR 水平更利于重組蛋白SRT-ELP36 的表達，誘導1 h 后，單位菌體蛋白產量可持續緩慢增加直至3 h，而蛋白體積產量雖然在誘導1 h 和3 h 后增速減慢，但可在整個誘導期間持續增加，兩者分別達到1.85 g/L 和70 mg/g 的最高水平，分別為較低OUR 水平時的1.6 和1.2 倍。因此，發酵過程中通過控制補料和供氧，維持較高OUR 水平不僅利于菌株生長，還降低了乙酸的積累，可實現重組蛋白SRT-ELP36 的高效表達。

在5 L 發酵罐補料分批培養過程中對起始誘導時機、OUR 和營養物質的補加條件進行了優化，獲得了發酵優化條件：起始誘導OD600為35、提高葡萄糖流加速率維持OUR 不斷增長至(180±5) mmol/(L·h)，可促進重組蛋白SRT-ELP36 的大量合成。

2.2.3 50 L 發酵罐考察 為了后續實現菌株在工業規模的應用，基于5 L 發酵罐中的發酵優化條件，在50 L 發酵罐中，我們以誘導時間、供氧水平、補糖速率和OUR 水平一致為原則，驗證重組菌的發酵過程放大特性，實驗結果如圖8 所示。50 L 發酵罐與5 L發酵罐相比，可實現更高的罐壓、供氧條件和溶解氧水平，50 L 發酵罐中培養的菌株生長更快，在批培養結束后，流加葡萄糖約3 h、菌濃OD600達到40 時開始誘導。誘導5 h 最高OD600可達103，約為5 L 發酵罐水平的1.3 倍。同時，蛋白表達水平得到了較大提高，誘導5 h 達到最高蛋白體積產量2.22 g/L，對比5 L 發酵罐最高水平提高了20%，最高單位菌體產量在誘導3 h 達到最高（90 mg/g），比5 L 發酵罐最高水平提高了29%。重組蛋白SRT-ELP36 在50 L 發酵罐中實現較高水平的表達，可經進一步優化放大實現工業化應用。

圖8 50 L 發酵罐中重組菌生長、OUR、蛋白體積產量和單位菌體產量時間曲線Fig.8 Time courses of cell growth, OUR, protein volumetric and specific production in a 50 L bioreactor

3 結 論

針對大腸桿菌表達高性能重組蛋白SRTELP36，通過對比大腸桿菌BLR(DE3)和BL21(DE3)生長及蛋白表達能力，確定了生長及蛋白表達水平更高的BL21(DE3)為宿主菌。在搖瓶中，對BL21(DE3)表達SRT-ELP36 的培養基、誘導時機和培養基裝液量進行優化，選擇TB 為培養基，裝液比為5%，在對數生長后期時，采用終濃度為0.5 mmmol/L的ⅠPTG在37 ℃進行誘導，最高OD600和蛋白體積產量分別可達22.3、0.60 g/L。在5 L 發酵罐中采用補料分批培養方式優化發酵過程，基于搖瓶中的結果，考察了起始誘導時機和氧消耗速率對宿主菌生長及蛋白表達的影響，發現在OD600為35 時添加終濃度為0.5 mmol/L的ⅠPTG 誘導表達，提高OUR 水平至（180±5） mmol/(L·h)時，最高OD600可達88，最高蛋白體積產量達1.85 g/L，最高單位菌體產量約70 mg/g。基于5 L發酵罐優化條件，在50 L 發酵罐中培養重組菌BL21(DE3)，最高OD600提高至103，重組蛋白SRT-ELP36 的體積產量和單位菌體產量進一步提高至2.22 g/L 和90 mg/g，比5 L 發酵罐最高水平分別提高了20%和29%，與已報道的類似重復序列蛋白表達水平相比（表1），蛋白表達水平位于前列。這些優化結果可用于指導重組菌生產的大規模發酵，有助于實現重組蛋白SRTELP36 的工業應用。

表1 生物合成重復序列蛋白的體積產量比較Table 1 Comparison of biosynthetic production of repetitive sequence proteins