Nrf2調控的氧化應激在Adropin抑制低氧肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用研究

陳昌貴，易春峰，王棟，余志華，賀立群（武漢市第一醫院心血管內科，武漢 430022）

持續性低氧可導致肺血管重構，進而引起肺動脈血管阻力增加，過高的肺動脈阻力會導致肺動脈高壓（PH）形成，長期過高的肺動脈壓力會誘發患者出現難以控制的右心衰竭而死亡[1]。低氧肺動脈高壓（HPH）是常見的PH類型。低氧導致的肺血管重構是HPH形成的基礎，其病理改變主要表現為肺小動脈中膜及內膜增厚、細胞外基質沉積、管腔變窄甚至閉塞。氧化應激、炎癥、內皮細胞功能障礙、肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）過度增殖等促進低氧肺血管重構發生[2-3]。氧化應激能夠通過促PASMCs過度增殖，導致肺血管重構發生，在HPH的發生發展中起至關重要的作用，通過抗氧化劑抑制氧化應激能夠抑制PASMCs的增殖，從而抑制HPH形成[4-5]。核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種參與氧化應激的關鍵轉錄因子，其在細胞核內與抗氧化響應元件結合促進下游抗氧化酶或蛋白的表達，發揮抗氧化作用[6]。Adropin是一種分泌蛋白，其由量動態平衡相關基因（Enho）編碼，在人類、大鼠和小鼠中具有相同的氨基酸序列[7]。Adropin與細胞增殖、內皮細胞功能、氧化應激、炎癥、能量代謝等密切相關[8-10]。研究發現Adropin可抑制主動脈平滑肌細胞（ASMCs）增殖及血管重構[8，11]。另有研究表明Adropin可激活Nrf2，抑制氧化應激，從而抑制非酒精性脂肪肝炎（NASH）[12]。而Adropin對低氧條件下PASMCs增殖及氧化應激的影響未見相關報道，因此本研究觀察Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖及氧化應激的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重170～190 g [北京維通利華動物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006]。

1.2 儀器

Dmil Led倒置熒光顯微鏡（Leica公司）；3131和311細胞培養箱 （Thermo公司）；Synergy HT多功能酶標儀（Bio-tek公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（BD公司）；Tanon-5200全自動化學發光分析儀（上海天能公司）。

1.3 試藥

PBS（批號：P2272）、H2O2（批號：323381）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC，批號：A0737）、Ⅰ型膠原酶（批號：SCR103）（Sigma公司）；Nrf2激活劑富馬酸二甲酯（DMF，批號：S2586）、Nrf2抑制劑ML385（批號：S8790）（Selleck公司）；重組Adropin（菲尼克斯醫藥公司）；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（批號：CK04，Dojindo）；活性氧（ROS，批號：S0033S）、超氧化物歧化酶（SOD，批號：S0101S）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx，批號：S0058）、過氧化氫酶（CAT，批號：S0051）、丙二醛（MDA，批號：S0131S）等檢測試劑盒以及細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒（批號：P0028）（碧云天生物科技有限公司）；DMEM/F12培養基（批號：SH30023）、胰蛋白酶（Trypsin，批號：SH30042）、胎牛血清（批號：SH30070）（Hyclone公司）；細胞周期蛋白（Cyclin）D1（批號：55506）、Cyclin E（批號：20808）、Nrf2（批號：12721）、Lamin B1（批號：13435）、GADPH（批號：5174）等抗體（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 SD大鼠PASMCs原代培養

參考本研究課題組之前報道的方法[13]，采用0.2%Ⅰ型膠原酶體外消化分離SD大鼠的PASMCs。用含10%胎牛血清DMEM/F12培養基培養PASMCs，當細胞傳至第3～4代性狀穩定后用于本研究。顯微鏡觀察細胞為長梭形，顯“峰-谷”狀生長。通過免疫細胞化學法檢測SM-α-actin鑒定PASMCs純度[13]（本研究細胞純度＞95%）。

2.2 實驗分組

篩選Adropin抑制低氧誘導的PASMCs增殖及氧化應激最適濃度相關實驗分為7組：對照組（PBS）、H2O2干預組（10 μmol·L-1H2O2）、低氧組（PBS＋低氧）、NAC干預組（10 mmol·L-1NAC＋低氧）、Adropin干預組[不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）＋低氧]。

Adropin抑制PASMCs增殖及氧化應激機制相關實驗分為5組：對照組（PBS）、低氧組（PBS＋低氧）、DMF干預組（75 μmol·L-1DMF ＋低氧）、Adropin干預組（1000 nmol·L-1Adropin＋低氧）、Adropin＋ML385干預組（1000 nmol·L-1Adropin＋5 μmol·L-1ML385＋低氧）。各組細胞在給予低氧刺激前用不含胎牛血清的DMEM/F12培養基培養24 h使細胞同步化。低氧模擬條件為1% O2、5% CO2和94% N2。常氧模擬條件為含5% CO2的空氣。

2.3 CCK-8檢測細胞增殖

PASMCs以5×103/孔接種于96孔板中，細胞經不同干預處理后，每孔加入10 μLCCK-8溶液后37℃繼續孵育3 h，并設定空白組為對照（100 μLDMEM/F12培養基＋10 μLCCK-8溶液），測定450 nm波長處吸光度（OD值），實驗組細胞的相對增殖率（%）＝[（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%]，每組重復6次。

2.4 細胞內ROS的檢測

通過二乙酰二氯氫化熒光素（DCFH-DA）探針聯合熒光酶標儀測定細胞內ROS水平。細胞接種于24孔板，各組細胞經不同干預措施處理后，吸出培養基，加入10 μmol·L-1無血清培養基稀釋的DCFH-DA，37℃孵育20 min之后將培養基吸出，PBS洗滌3次后，置于熒光酶標儀（激發波長488 nm，發射波長525 nm）下檢測ROS水平，每組重復6次。

2.5 試劑盒檢測SOD、GPx、CAT、MDA的水平

細胞接種于6孔板，各組細胞經不同干預措施處理后，細胞裂解液或樣品制備液充分裂解細胞后測定SOD、GPx、CAT、MDA的相對水平，通過BCA法測定細胞總蛋白濃度標準化實驗結果，每組重復6次。

2.6 流式細胞儀檢測細胞周期

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基將PASMCs制作成細胞懸液，以1.5×105/孔接種于6孔板，不同干預處理后，胰酶消化收集細胞，70%乙醇固定后4℃過夜。離心后加入預冷的PBS重懸細胞，再次離心后棄上清液，加入碘化丙啶染色液，37℃避光孵育30 min，后冰浴避光保存，24 h內通過流式細胞儀檢測細胞周期，每組重復3次。

2.7 Western blot檢測Nrf2、Cyclin D1和Cyclin E表達

PASMCs以1.5×105/孔接種于60 mm培養皿，各組細胞經不同干預處理后，使用細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白；使用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒提取細胞核蛋白與細胞質蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。將各組細胞蛋白稀釋成相同濃度，取等量蛋白加樣（約15 μg），通過10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至硝化纖維素膜中，采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入一抗（Nrf2、Cyclin D1和Cyclin E的稀釋倍數為1∶1000，Lamin B1與GAPDH稀釋倍數1∶2000），4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫下孵育1 h，采用ECL法檢測蛋白的相對表達，通過Tanon GIS軟件處理數據，每組重復3次。

2.8 統計學處理

本研究數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量數據采用均數±標準差 （±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；P＜0.05認為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖及ROS產生的影響

ROS激活劑H2O2（10 μmol·L-1）和低氧刺激PASMCs 24 h后，其增殖增強（P＜0.05），抗氧化劑NAC（10 mmol·L-1）及不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）干預24 h后均能夠顯著抑制PASMCs增殖（P＜0.05），且隨著Adropin濃度升高，其抑制細胞增殖作用增強（見圖1A）。H2O2和低氧刺激PASMCs 24 h后，細胞內ROS產生增加，抗氧化劑NAC及不同濃度的Adropin干預24 h后可抑制細胞內ROS產生（P＜0.05），且隨著Adropin濃度升高其抑制ROS產生作用增強（見圖1B），說明Adropin抑制低氧誘導的PASMCs增殖與抑制ROS產生有關。

圖1 Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖及ROS產生的影響（n＝6）Fig 1 Effect of Adropin on the proliferation and ROS production in hypoxia-induced PASMCs（n＝6）

3.2 Adropin對氧化應激的影響

低氧孵育PASMCs 24 h后，細胞核與細胞質Nrf2的表達均下調（P＜0.05），Nrf2激活劑DMF（75 μmol·L-1）及Adropin干預均能促進細胞核及細胞質中Nrf2的表達（P＜0.05），Nrf2抑制劑ML385能夠逆轉Adropin上調細胞核及細胞質中Nrf2表達的作用（P＜0.05）（見圖2）。低氧孵育PASMCs 24 h后，細胞內SOD、GPx和CAT的活性下降，MDA和ROS水平升高（P＜0.05）；DMF及Adropin干預后，細胞內SOD、GPx、CAT活性升高，MDA和ROS水平下降（P＜0.05）；而ML385（5 μmol·L-1）能夠逆轉Adropin抑制氧化應激的作用（P＜0.05）（見圖3）。

圖2 Adropin對低氧誘導的PASMCs中Nrf2表達的影響（n＝3）Fig 2 Effect of Adropin on the expression of Nrf2 in hypoxia-induced PASMCs（n＝3）

圖3 Adropin對低氧誘導的PASMCs中氧化應激的影響（n＝6）Fig 3 Effect of Adropin on the oxidative stress in hypoxia-induced PASMCs（n＝6）

3.3 Adropin對細胞周期的影響

低氧孵育PASMCs 24 h，G0/G1期的PASMCs減少，S期＋G2/M期的比例增多（P＜0.05）；DMF及Adropin干預后G0/G1期細胞比例增加，S期＋G2/M期細胞比例減少（P＜0.05）；而ML385能夠逆轉Adropin阻滯細胞周期的作用（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 Adropinn對低氧誘導的PASMCs中細胞周期的影響（n＝3）Fig 4 Effect of Adropin on the cell cycle progression in hypoxia-induced PASMCs（n＝3）

3.4 Adropin對Cyclin D1和Cyclin E表達的影響

低氧刺激PASMCs 24 h后，Cyclin D1和Cyclin E的表達上調（P＜0.05）；DMF及Adropin干預后，Cyclin D1和Cyclin E的表達下調（P＜0.05）；而ML385能夠逆轉Adropin抑制Cyclin D1和Cyclin E表達的作用（P＜0.05）（見圖5）。

圖5 Adropin對低氧誘導的PASMCs中Cyclin D1和Cyclin E表達的影響（n＝3）Fig 5 Effect of Adropin on the expression of Cyclin D1 and Cyclin E in hypoxia-induced PASMCs（n＝3）

3.5 Adropin對PASMCs增殖的影響

DMF及Adropin干預后能夠抑制低氧誘導的PASMCs增殖，而ML385能夠逆轉Adropin抑制PASMCs增殖的作用（見圖6）。

圖6 Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖的影響（n＝6）Fig 6 Effect of Adropin on the proliferation in hypoxia-induced PASMCs（n＝6）

4 討論

本研究發現H2O2及低氧均能夠誘導PASMCs增殖及ROS生成，不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）及抗氧化劑NAC均可抑制低氧誘導PASMCs的增殖及ROS產生，且Adropin抑制PASMCs增殖及ROS產生的作用具有濃度依賴性。本研究還發現，Adropin和Nrf2激活劑DMF干預均可通過激活Nrf2上調PASMCs內SOD、GPx和CAT的活性，降低MDA與ROS水平，而Nrf2抑制劑ML385能夠逆轉Adropin上述作用。進一步研究表明，DMF和Adropin能夠通過抑制Cyclin D1與Cyclin E的表達，阻滯細胞周期于G0/G1期，從而抑制PASMCs增殖，而ML385能夠逆轉Adropin上述作用。這說明Adropin通過抑制氧化應激，阻滯細胞周期，從而抑制低氧誘導的PASMCs增殖，其機制可能與激活Nrf2有關。

持續低氧可誘導PASMCs異常增殖，導致肺血管重構及HPH形成。體外研究發現，不同濃度的低氧（1%～10%）刺激PASMCs后，其增殖率與氧濃度成負相關[14]，因此本研究采用1% O2誘導PASMCs增殖，建立細胞模型。細胞實驗中發現Adropin可通過抑制ERK1/2活化抑制人ASMCs的增殖和遷移。動物實驗發現，向Apoe-/-小鼠腹腔注射Adropin可抑制主動脈粥樣硬化的發展，并減少斑塊內單核細胞/巨噬細胞浸潤和平滑肌細胞數量，抑制血管重構[8]。研究發現Adropin與冠心病患者冠狀動脈內新生內膜面積成負相關，體外培養大鼠ASMCs發現，Adropin能夠抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的ASMCs增殖[11]。本研究發現不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）可抑制低氧誘導的PASMCs增殖，且具有濃度依賴性。

細胞增殖與細胞能否順利通過細胞周期的各個階段密切相關。G1期能否進入S期是決定細胞增殖的關鍵。一旦G1期細胞進入S期，細胞周期可正常進行，且不再受有絲分裂原調控。本研究表明，低氧能夠誘導PASMCs有絲分裂增強，減少G0/G1期細胞比例，同時增加S＋G2/M期的細胞比例，而Adropin干預后能夠逆轉低氧誘導PASMCs有絲分裂的作用，增加G0/G1期細胞比例，同時減少S＋G2/M期的細胞比例。研究發現，Adropin能夠通過阻滯細胞周期于G0/G1期，抑制AngⅡ誘導的RASMCs增殖[11]。Cyclin是細胞周期調控系統的關鍵蛋白。Cyclin E和Cyclin D1與細胞周期蛋白依賴蛋白（CDK）2和CDK4/6結合形成復合物促進G1期細胞進入S期，進而促進有絲分裂[15-16]。本研究發現Adropin可抑制Cyclin D1和Cyclin E的表達。因此推測，Adropin通過抑制Cyclin D1和Cyclin E的表達，抑制細胞周期進程，從而抑制低氧PASMCs增殖。

大量研究表明，氧化應激在PAH的發生發展中起著至關重要的作用。無論是PAH患者，還是野百合堿或低氧誘導的PH動物模型，均發現氧化應激明顯增加[17]。ROS是參與氧化應激的主要分子之一，包括超氧陰離子（O2-）、羥基（OH-）、H2O2和次氯酸（HOCl）[18]。低氧能夠通過下調抗氧化相關酶活性（SOD、GPx和SOD等）和上調NADPH氧化酶 （NOXs）活性，導致PASMCs產生過量的ROS，從而誘導氧化應激[19]。ROS是重要的細胞內信號分子，低水平ROS對維持細胞正常生理功能極為重要，病理條件下可使ROS的生成增強，誘導細胞增殖、凋亡抵抗。氧化應激能夠通過促進炎癥反應，損傷內皮細胞，促進PASMCs異常增殖，導致低氧肺血管重構發生，從而誘導HPH發生發展，通過抗氧化劑降低ROS水平后可抑制PASMCs增殖以及HPH形成[19-20]。此外，ROS可通過活化細胞內信號通路如ERK1/2和P38，促進PASMCs增殖[21-22]。SOD可將超氧化自由基分解為H2O2，GPx可以催化GSH與H2O2或其他有機過氧化物的反應，生成氧化型谷胱甘肽和H2O，CAT是H2O2酶，能夠催化H2O2產生H2O與O2[18]。SOD缺乏時，PASMCs增殖增強，恢復SOD活性能夠減輕肺動脈重塑[23-24]。氧化應激時能導致細胞脂質過氧化，而MDA是脂質過氧化的產物，其與氧化應激相關，PAH患者血清中MDA水平升高[25]。低氧能夠誘導PASMCs內SOD、GPx和CAT活性下降，ROS和MDA水平升高，促進氧化應激，而通過藥物抑制氧化應激能夠抑制低氧誘導的PASMCs增殖[24，26]。本研究發現ROS激活劑H2O2及低氧均能夠促進PASMCs的增殖及ROS生成，不同濃度的Adropin及抗氧化劑NAC均可抑制低氧誘導的PASMCs增殖及ROS產生，且Adropin抑制PASMCs增殖及ROS產生的作用具有濃度依賴性。進一步研究發現Adropin能夠增強SOD、GPx和CAT活性，降低MDA水平。有研究表明Adropin可減輕棕櫚酸誘導肝細胞和庫普弗細胞內ROS產生，從而抑制NASH[10]。在糖尿病腎病小鼠模型研究中發現Adropin可抑制腎臟的氧化應激，改善腎功能[27]。在NASH小鼠模型中研究發現，敲除Adropin顯著加劇了肝臟脂肪變性及氧化應激，而腹腔注射外源性Adropin可減輕肝細胞的氧化應激，抑制NASH的進展[12]。

Nfr2是參與氧化應激的關鍵轉錄因子。Keap1是Nrf2的抑制劑，在Nrf2活性的調節中起著關鍵作用。在細胞質內Nrf2與Keap1蛋白結合，活性受到抑制，并被降解。當Nrf2與Keap1解離后會進入細胞核，與抗氧化響應元件結合促進SOD、GPx和CAT等抗氧化蛋白的表達[6]。缺氧誘導PASMC內ROS產生，而ROS能夠抑制Keap1與Nrf2在細胞質內解離，從而抑制Nrf2的激活[26，28]。使用siRNA敲除Nrf能顯著促進PASMCs內ROS的產生，誘導PASMCs增殖[29]。在低氧誘導的PASMCs氧化應激模型中發現，Nrf2特異性抑制ML385能夠抑制SOD、GPx和CAT活性，促進MDA及ROS產生[26]。在NASH模型研究中發現，Adropin可通過激活Nrf2，抑制氧化應激[12]。本研究發現Adropin或Nrf2激活劑DMF干預能夠通過激活Nrf2，增強SOD、GPx和CAT活性，抑制氧化應激，并抑制Cyclin D1與Cyclin E的表達，進而阻滯細胞周期，抑制低氧條件下PASMCs的增殖，而Nrf2抑制劑ML385能夠逆轉Adropin上述作用。這說明Adropin可通過抑制氧化應激，抑制低氧誘導的PASMCs增殖，其機制可能與激活Nrf2有關。

綜上，本研究首次發現Adropin可通過抑制氧化應激抑制低氧誘導的PASMCs增殖，其機制可能與激活Nrf2有關。Adropin可能是治療和預防低氧肺血管重構新的藥物。本研究單從細胞水平探討Adropin對低氧肺血管重構的影響，下一步將在動物實驗中驗證Adropin對低氧誘導的HPH大鼠肺血管重構的影響，在動物水平探討Adropin對低氧肺血管重構及氧化應激的影響。