基于氧化應激和炎癥探討健脾解毒湯治療銀屑病脾虛濕盛證大鼠的作用機制

許孟月 姚文匯 左永杰 劉紅霞

1.新疆醫科大學第四臨床醫學院，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院皮膚科，新疆烏魯木齊 830000

銀屑病是一種免疫介導的慢性炎癥性疾病[1]。近年來，研究發現銀屑病患者血清中氧化應激相關指標水平異常，可見超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化物的缺乏，丙二醛（malondialdehyde，MDA）等氧化物增多[2]。核轉錄因子紅系2 相關因子2/血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）通路是一條重要抗氧化通路，SOD、GSH 是衡量抗氧化能力的重要指標，MDA 可間接反映自由基引起的氧化損傷程度。同時，氧化應激產生的活性氧也會激活多個炎癥通路[3]。新疆地區年降水量少，燥易傷脾胃，飲食以肉食為主，易生濕化熱。基于此，新疆醫科大學附屬中醫醫院劉紅霞教授提出新疆地區銀屑病“脾虛濕盛證”證型，經驗方健脾解毒湯取得良好的臨床療效，但作用機制尚不明確[4]。咪喹莫特誘導的銀屑病動物模型特征與人銀屑病特征最為相似[5]。因此，本研究采用咪喹莫特誘導的銀屑病脾虛證脾虛濕盛證動物模型，探討其對銀屑病氧化應激和炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康6～8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠，體重180～200 g，由新疆醫科大學動物飼養中心提供，動物合格證號為[SYXK（新）2018-0001]，本研究經過新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審批（20210822-08）。

1.2 主要藥物、試劑、儀器

健脾解毒湯（土茯苓30 g、綿萆薢10 g、黃柏10 g、苦參10 g、連翹30 g、生薏仁30 g、茯苓10 g、炒白術10 g、白花蛇舌草30 g、丹參10 g、炙甘草6 g），大黃顆粒劑（江陰天江藥業有限公司，批號：2108042301）2g/袋；5%咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業有限責任公司，批號：211013）；甲氨蝶呤片（湖南正清制藥集團股份有限公司，批號：210905）2.5 mg/片；MDA、GSH、SOD 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：EBC-K025-M、E-BC-K030-M、E-BC-K020-M）、IL-22試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSBE14918r）、兔HO-1/HMOX1 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM4010）；電泳儀（北京六一生物科技公司，型號：DYCZ-24DN）、化學發光成像儀系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：Chemiscope 3000）。

1.3 動物分組及處理

48 只大鼠按照隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性藥物對照組及健脾解毒湯低、中、高劑量組，每組8 只。六組均背部除去被毛（3 cm×3 cm），空白組以凡士林涂抹背部；其余各組予5%咪喹莫特（62.5 mg，2 次/d）涂抹背部，同時予大黃顆粒劑（10 ml/kg，2 次/d）灌胃，連續10 d。造模成功后，陽性藥物組予甲氨蝶呤片（0.97 mg/kg，1 次/d），健脾解毒湯各組按照低、中、高劑量（2.32、4.64、9.26 g/kg）灌胃，根據前期研究，高劑量（g/kg）=5.67（9.8/6）=9.2 g/kg，分別計算中、低劑量[6]。空白組、模型組予同體積生理鹽水，連續14 d。給藥結束后，六組腹主動脈取血，剪取背部皮膚，將血清及皮膚組織置于-80℃冰箱保存備用。

1.4 銀屑病面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）

根據紅斑、鱗屑、浸潤進行評分，PASI 標準：0 分為無癥狀，1 分為輕微癥狀，2 分為中度癥狀，3 分為重度癥狀、4 分為極重度癥狀[7]。

1.5 皮膚組織病理學觀察

剪取大鼠背部皮損處皮膚，取4%多聚甲醛固定48 h，脫水包埋，進行常規蘇木精-伊紅染色，并于光學顯微鏡下觀察。

1.6 血清氧化應激及炎癥相關指標

采用酶聯免疫吸附試驗檢測六組血清白細胞介素-22（interleukin-22，IL-22）、MDA、GSH 含量及SOD活力，具體操作步驟均嚴格遵照試劑盒說明書。

1.7 蛋白印跡法檢測皮膚組織中HO-1 蛋白表達

向裝有皮膚組織的EP 管中加入裂解液，按BCA蛋白測定試劑盒步驟檢測蛋白濃度，跑膠后將目標蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，HO-1（1∶800）一抗4℃搖床過夜，山羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，曝光顯影，Image J 軟件分析各目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 六組形態學特征及PASI 比較

空白組背部皮膚未見明顯變化，健脾解毒湯各劑量組紅斑、鱗屑、浸潤、進食及排便情況優于模型組。健脾解毒湯低、中、高劑量組PASI 低于模型組，健脾解毒湯高劑量組低于健脾解毒湯低、中劑量組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 六組形態學特征及PASI 比較（n=8）

2.2 六組皮膚病理表現

空白組未見明顯病變，模型組皮膚結構異常，與模型組比較，健脾解毒湯各劑量組表皮增生、角化不全減輕，表皮突變短，中性粒細胞數量減少，真皮血管擴張減弱，高劑量組表現出更顯著的效果。見圖2。

2.3 六組血清SOD 活力、MDA、GSH、IL-22 水平比較

模型組SOD 活力、GSH 水平低于空白組，MDA、IL-22 水平高于空白組（P＜0.05）。健脾解毒湯低、中、高劑量組GSH 高于模型組，健脾解毒湯中、高劑量組SOD 活力高于模型組，MDA、IL-22 水平低于模型組（P＜0.05）。健脾解毒湯中、高劑量組SOD 活力、GSH水平高于健脾解毒湯低劑量組，MDA、IL-22 水平低于健脾解毒湯低劑量組（P＜0.05）。健脾解毒湯高劑量組SOD 活力、GSH 水平高于健脾解毒湯中劑量組，MDA 低于健脾解毒湯中劑量組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 六組血清SOD 活力、MDA、GSH、IL-22 水平比較（n=8）

2.4 六組皮膚組織中HO-1 蛋白表達比較

模型組HO-1 蛋白低于空白組，健脾解毒湯高劑量組HO-1 蛋白表達高于模型組及健脾解毒湯低、中劑量組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 六組皮膚組織中HO-1 蛋白表達比較（n=8）

3 討論

銀屑病發生機制尚不明確，可能與遺傳、免疫紊亂、環境等因素有關[1]。近年來研究表明，氧化應激在銀屑病中發揮著重要作用[7]。HO-1 參與皮膚的損傷修復[8-9]。銀屑病患者皮損處HO-1 表達升高，血清MDA、GSH 升高、SOD 降低，處于氧化還原穩態失衡[10-11]。當核轉錄因子紅系2 相關因子2/HO-1 通路表達上調時，活性氧類、促炎性細胞因子等顯著減少[12]。IL-22是由輔助性T 細胞17 分泌和產生的細胞因子，可調節炎癥反應，引起角質細胞過度增殖，而IL-22、IL-17等炎癥因子又可致氧化損傷，形成惡性循環，最終造成角質形成細胞過度增殖、中性粒細胞募集、持續的皮膚炎癥[3，13]。

中醫歷史上各代醫家對銀屑病病因的認識是不斷發展，以血論治銀屑病是主要的治療思路[14-17]。劉紅霞教授對新疆地區銀屑病的病因病機有獨到見解，提出脾虛濕盛證[18]。健脾解毒湯是劉教授治療新疆銀屑病脾虛濕盛證的經驗有效方，土茯苓、綿萆薢健脾祛濕解毒，黃柏、苦參清熱燥濕，白花蛇舌草、連翹解毒，丹參涼血消癰[19]。現代藥理表明，土茯苓的生物活性化合物落新婦苷可誘導核轉錄因子紅系2 相關因子2核易位，減輕銀屑病小鼠病理損傷[20]。綿萆薢具有抗感染、免疫調節作用[21-22]。小檗堿是黃柏的主要成分，可提高GSH 水平，降低腫瘤壞死因子-α、MDA 水平[22-23]。丹參具有抗氧化、抗感染作用，可改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣炎癥[24-27]。

綜上，健脾解毒湯可改善銀屑病病理形態，降低MDA、IL-22 水平，提高SOD 活力、GSH 含量，增加HO-1 蛋白表達，可能是通過調控HO-1 相關通路發揮抗氧化應激、抗感染的作用，但具體作用機制仍需進一步研究。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。