益生菌對采食玉米赤霉烯酮污染日糧的育肥母豬的影響

鐘俊宇，李濤，鄭隆清，尹福泉

廣東海洋大學濱海農業學院，廣東湛江524088

玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是一種有毒的真菌次級代謝產物。污染動物飼料的霉菌毒素可對動物產生毒性作用，并轉移到動物產品中，危害動物與人類健康[1]。科研機構在全國范圍內所采集的840 余份飼料原料和飼料樣品經檢測發現,我國的飼料原料和飼料均受到不同程度的污染[2]。根據Holanda 等報告，美國每年因為動物攝入飼料被ZEA 污染而導致農業虧損將近數十億美元[3]。ZEA嚴重損害動物的肝功能和結構[4]，對小腸的發育和吸收能力造成不利影響[5]，破壞大腸的防御機制[6]和污染盲腸微生物群[7]。由于ZEA 具有雌激素的作用，臨床表現為雌激素過多，導致母豬外陰發紅、充血和水腫，子宮增大，卵巢上形成囊腫和乳腺增大[8]。

ZEA 的脫毒方法主要包括物理、化學和微生物脫毒方法。物理法、化學法儀器設施花費較大，必須考慮營養元素損失、藥物殘留和消化性降低等因素[9]。微生物法因具有高度特異性、有效性以及代謝產物無毒性的優點，在ZEA 脫毒中具有較大的應用潛力[10]。雷元培[11]篩選的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ANSB01G 對ZEA 降解率高達88.65%，較好地減輕了ZEA 對青年母豬的危害。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)和角蛋白酶組合的益生菌，被動物采食后，在動物的胃腸道內產生淀粉酶，可以促進飼料中營養物質的消化吸收；同時，它所分泌的酶類對霉菌毒素具有較好的降解作用[12]。但益生菌對緩解育肥母豬ZEA 中毒癥狀是否有效果目前還不清楚，為進一步明確益生菌在動物生產中的實際應用效果，本文采用自制的益生菌添加于飼料基礎配方中，對比分析不同試驗組育肥母豬的生產性能、血清學指標和肝臟中殘留ZEA 量，研究微生物脫毒方法的實際應用效果，為擴大益生菌的應用及飼料ZEA污染的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌種

自制益生菌（地衣芽孢桿菌≥2.0×106CFU/g，角蛋白酶酶活≥100 U/g）由廣東海洋大學動物營養分子研究室配制。

1.2 儀器設備

電子分析天平（舜宇恒平儀器），高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器），生化培養箱（上海合恒儀器），氣浴振蕩器(常州潤華電器)，實驗室凈化工作臺（東莞佰鴻凈化設備BH-1000），迷你混合儀（拓赫MIXVR），磁力攪拌器（上海梅穎浦MYP11-2），電熱鼓風干燥箱（上海博訊BGZ-70），酶標儀（HBS-1096A），分光光度計(南京菲勒儀器)，冰箱（海爾），三角瓶和培養皿等。

1.3 試驗設計及試驗日糧

選用平均體質量(36.17±2.24) kg的育肥母豬18頭，隨機分成3 組，每組6 個重復，各組間體質量無較大差異（P>0.05）。試驗設計分為對照組A 和2 個處理組（B和C），具體見表1。

表1 試驗設計

其中，正常飼料所添加的ZEA 均為實驗室統一采購。A組飼料中，黃曲霉素、赤毒素和烷基苯酚均未檢出。B 組和C 組飼料中ZEA 含量為300 μg/kg，黃曲霉毒素、赤毒素和烷基苯酚均未檢出。

試驗飼料按照美國國家科學研究委員會NRC[13]推薦配備。基礎日糧配方及營養水平見表2。

表2 日糧組成及營養水平

1.4 飼養管理

每天打掃豬圈，分別在 10:00 和 16:00 飼喂，飼養期間，豬自由采食和飲水。

1.5 生產性能的測定

試驗0、3、10、17 和24 d，每天早上母豬進食前稱取每頭豬空腹體質量，進食后記錄每頭豬的采食量并觀察母豬精神與健康狀況。測定3組母豬的生長性能指標：平均日增質量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。隨時觀察豬只的活動情況及進食飲水狀況。

1.6 陰戶面積測定與計算

試驗采用雷元培[11]的方法進行計算，測定豬的陰戶面積（S，mm2）。

S=（π×a×b）/4，

式中，a為陰戶橫截面的長度，mm；b為陰戶豎截面的長度，mm。

母豬陰戶形狀如橢圓形，如圖1 所示。根據各組母豬陰戶面積大小評價陰戶是否正常與恢復情況。

圖1 豬外陰大小

1.7 屠宰試驗

屠宰試驗分別從3 個試驗組中各選擇3 頭豬進行屠宰。宰后分離出心臟、肝臟等組織器官并稱質量。放入-20 ℃冰箱冷藏，為后續器官指數的計算與肝臟的殘留ZEA 做準備。屠宰前對豬耳朵背部進行靜脈采血，分離出血清，放入冰箱中保存備用。

1.8 器官指數的測定

器官指數=臟器鮮質量/體質量×100。

1.9 血清學指標的測定

在飼養試驗結束當天，采取育肥母豬前腔靜脈血液3 mL 于促凝管中，待吸出血清，分別測定促卵泡激素(FSH)、促黃體素(LH)、雌二醇(E2)和催乳素（PRL）含量，均采用定量檢測試劑盒測定。試劑盒選購自南京建成生物工程研究所，檢測方法嚴格按照試劑盒說明方法進行。

1.10 肝臟中殘留ZEA的測定

將肝臟組織研磨取樣1.0 g，與5 mL 70%甲醇溶液進行混合，放置于振蕩器中，進行離心操作，取上清液并添加去離子水1 mL，以上步驟均按照ZEA測定試劑盒說明書進行。

1.11 數據分析

采用SAS 9.0 對生長指標和血清學指標結果進行數據分析。用GLM 過程進行方差分析，結果用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 不同ZEA 含量飼料對育肥母豬生長性能的影響

如表3 所示，24 d 的飼養試驗結束后，3 組豬的平均日增質量、平均日采食量和飼料轉化率差異較小（P>0.05）。結果顯示當飼料中ZEA 含量為300 μg/kg時對育肥母豬生長性能沒有明顯影響。

2.2 益生菌對飼喂ZEA 污染日糧育肥母豬陰戶面積和器官指數的影響

由圖2 可見，喂養母豬前3 d 內，3 組的育肥母豬陰戶面積沒有明顯差異（P＞0.05），處于正常狀態。試驗進行到第10 天時，3 組的陰戶面積差異顯著（P<0.05），與對照組A 組相比，B 組陰戶面積明顯增大，并伴隨著紅腫和炎癥癥狀。試驗到第17 天，C 組中育肥母豬的陰戶面積逐漸恢復正常，而B 組育肥母豬的陰戶面積依然較大，且陰戶發炎發腫癥狀持續惡化。試驗至24 d 時，3 組的陰戶面積仍然差異顯著（P<0.05），但C 組的母豬陰戶恢復至健康水平。

圖2 益生菌對母豬陰戶面積的影響

由表4 可知，3 組育肥母豬的心臟、肝臟、脾臟和腎臟器官指數差異不顯著（P＞0.05），但是生殖器官指數差異顯著（P<0.05）。因為飼料中含有益生菌使處理組C 的生殖器官指數降低，改善了育肥母豬陰戶的癥狀，恢復至健康水平。

表4 益生菌對母豬器官指數的影響

2.3 血清學指標分析

由表5 可知，3 組雜交育肥母豬血清中，促卵泡激素、促黃體素和雌二醇水平沒有顯著差異（P>0.05）。而B 組血清中催乳素水平差異顯著（P<0.05），由于C 組添加益生菌，可以維持血清中催乳素（PRL）值處于正常水平。

表5 益生菌對母豬血清學指標的影響

2.4 肝臟中ZEA殘留量的分析

由于動物機體自身對毒素的排解以及本試驗加入ZEA 為300 μg/kg，ZEA 相對水平較低。經過對肝臟中ZEA 殘留的檢測發現，各試驗組均沒有檢測到ZEA的殘留。

3 討論

3.1 生長性能及飼料中營養物質消化率的變化

在飼料中添加ZEA 300.00 μg/kg 飼喂后，對育肥母豬的生長發育沒有產生不利影響，與其他研究者結果相似。Liu 等[14]研究發現，在母豬日糧內分別添加86.19、300 μg/kg ZEA，結果顯示當試驗進行到15 d 時，母豬的會陰部面積明顯增大，沒有對母豬的平均日增質量（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）產生影響。Jiang等[15]在斷奶仔豬日糧中添加1 000 μg/kg ZEA 飼喂后，仔豬的生長性能沒有明顯差異。并且Oliver等[16]研究發現青年母豬日糧中添加2 mg/kg ZEA 飼料后，各組母豬的生長性能也沒有明顯差異。本試驗發現，飼料中無論是否添加ZEA，皆對育肥母豬的日增質量、日采食量、飼料轉化率的消化性能沒有明顯影響，原因可能是本試驗飼料中添加ZEA 的濃度沒有過量，尚未對豬的生產性能造成不良影響。

3.2 母豬外陰面積與器官的指數變化

ZEA 是一種雌激素類真菌毒素，主要作用于雌性動物的生殖系統，也對雄性動物有一定程度影響。Jiang 等[15]研究發現，在仔豬日糧中分別添加不同濃度的ZEA 純品，飼喂一段時間后，仔豬會出現明顯的陰戶腫大、發炎的癥狀，隨著ZEA 使用濃度增加，陰戶紅腫也會越加嚴重。據Andretta 等[17]研究，在28 d 飼養期內，添加2 mg/kg 玉米赤霉烯酮的母豬的最終外陰體積比對照組大820%(P<0.05)，但沒有對動物生長性能造成影響。Teixeira 等[18]研究發現，青春期前母豬飼喂含0.75 mg/kg ZEA 的日糧連續21 d，生殖道質量、外陰面積、子宮內膜腺體上皮細胞高度及子宮黏膜高度均顯著增加(P<0.05）并出現外陰戶紅腫現象。Jiang 等[15]也發現，斷奶仔豬被飼喂含有1.1 mg/kg ZEA 的日糧后，經20 d 飼喂，外陰戶面積與對照組相比有著較大差異。本試驗發現，B 組、C 組飼料中添加ZEA 300 μg/kg 飼喂后導致了母豬的陰戶面積增大，同時伴有發炎腫脹等癥狀。而在添加益生菌的C 組中，可以明顯改善母豬陰戶發炎、發腫的癥狀，減少陰戶面積的增加，使其恢復至健康狀態。

3.3 肝臟組織器官中ZEA殘留量的變化

王定發[19]在母豬日糧中分別添加500、2 000 μg/kg 的ZEA 日糧，其肝臟ZEA 殘留量分別為26.31、291.14 和1 352.06 μg/kg。隨著飼料中ZEA含量的增加，檢測到肝臟中ZEA 的殘留量增加明顯（P<0.05），但本試驗卻在肝臟中沒有檢出ZEA，這可能是因為飼料中ZEA的含量不高，本試驗中ZEA最高為300 μg/kg，比王定發[19]添加ZEA 的最低濃度還要低。

3.4 血清學指標的變化

由于ZEA 在結構上與雌激素相似，與雌激素受體在母豬體內結合后，可使雌激素發生反應，產生類雌激素相關作用，出現雌激素綜合癥狀。根據Zielonka 等[20]研究，2 種劑量ZEA（20 和40 μg/kg）均能夠使雌二醇和睪酮含量超出生理水平，并且高劑量ZEA 更易引起內分泌紊亂。據王定發[19]報道，日糧中添加ZEA 能使仔豬血清指標中的雌二醇和促黃體素與正常對照組產生顯著差異（P<0.05），但是對促卵泡激素水平沒有顯著影響。同時，Jiang 等[15]報道，斷奶仔豬采食含有ZEA 飼料后，血清中雌二醇含量顯著降低（P<0.05）。本試驗結果顯示，處理組B 采食含ZEA 的飼料會使血清中催乳素升高，但是對血清中其他指標沒有顯著影響。而處理組C在飼料中添加益生菌后，血清中催乳素可恢復至健康水平。

4 結論

該試驗結果表明，飼料中添加300 μg/kg ZEA后，育肥母豬在10 d 內就會出現陰戶面積增大現象。在飼料中添加0.2%益生菌后可以有效減輕母豬的外陰紅腫與陰戶面積增大現象，使母豬的生長性能接近正常對照組水平，維持母豬血清中雌激素水平正常，對采食含有玉米赤霉烯酮日糧的育肥母豬有治療效果。