罕見常染色體非整倍體對胚胎/胎兒發育的影響

劉小霞 王杰 侯東霞 郭志遠 王鑫 王曉華 賈躍旗

染色體非整倍體是指染色體數目非整體性的增加或減少,而呈個別染色體數目的變化[1]。常見的胎兒染色體非整倍體有21-三體、18-三體、13-三體和性染色體非整倍體,其余的可定義為罕見常染色體非整倍體(rare autosomal aneuploidies, RAAs)[2-3]。染色體非整倍體對胎兒發育有不良影響,包括流產、胎兒結構異常及神經發育延遲[4],不同的染色體數目異變對胎兒發育的影響可能不同。目前對常見的染色體非整倍體如21-三體、18-三體和13-三體的研究比較多[5],但對RAAs的研究比較少。本研究回顧近三年來在內蒙古自治區婦幼保健院就診且確診為RAAs的病例,分析了RAAs對胎兒發育的影響,為RAAs孕婦的遺傳咨詢提供理論依據并提升孕婦對RAAs的認知。

對象與方法

1.研究對象:收集2018年8月至2021年9月于內蒙古自治區婦幼保健院進行染色體微陣列(chromosomal microarray analysis,CMA)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)或羊水染色體核型分析確診為RAAs的患者共193例,其中經CMA發現126例,樣本類型分別為絨毛和羊水;FISH發現65例,樣本類型為絨毛;染色體核型分析發現2例,樣本類型為羊水。

分別按以下項目分組研究胎兒存活孕周、孕婦妊娠結局與RAAs的關系。孕期:按末次月經或B超計算得到孕周,其孕早期為孕周<13周,孕中期為懷孕13～28周,晚期為孕周>28周[6];妊娠結局分為流產和非流產。流產根據自然流產發展的不同階段分為先兆流產、難免流產、不全流產和完全流產;稽留流產、復發性流產和流產合并感染是三種特殊類型的自然流產,診斷標準參照謝辛主編的第九版《婦產科學》[7];非流產組包括引產和成功分娩。

RAAs納入標準:經CMA/FISH/羊水染色體核型分析確診為RAAs的患者;排除標準:本人近期接受過移植手術、異體輸血、異體細胞治療或檢測失敗者;臨床信息不全或拒絕隨訪的患者。

2. 方法:

(1)標本采集。羊水標本:一次性抽取羊水量25～35 mL用于CMA和染色體核型分析。采集時為防止母源污染,棄去最初的1～2 mL并更換注射器。標本要求新鮮、清亮無渾濁、無胎糞、無凝塊且無母血污染(血性羊水),可疑母源污染的標本需進行羊水細胞培養,待細胞貼壁后,除去懸浮紅細胞,使用細胞刮或胰酶消化后取貼壁羊水細胞,經生理鹽水沖洗后,再用于全基因組DNA提取;絨毛標本:采集20 mg左右用于CMA和FISH,經生理鹽水充分洗滌后,于顯微鏡下分離蛻膜和血凝塊。

(2)染色體微陣列技術。使用 Promega公司(美國)DNA 提取試劑盒對絨毛組織/胎盤組織/羊水細胞進行全基因組DNA提取。再應用Thermo fisher公司(美國)CytoScanTM 750K芯片進行檢測,標本依次進行酶切、連接、PCR、純化、片段化、標記、雜交洗滌、掃描和分析等,檢測染色體數目異常。CMA檢測提示母體細胞污染超過30%的樣本被排除在外[8]。

(3)熒光原位雜交技術。取經染色體制備過程處理的羊水細胞/絨毛組織滴片,標本依次進行烤片、洗滌、消化、脫水、加探針,76攝氏度變性7 min后迅速置于37攝氏度水浴箱中,取出后雜交,DAPI染色,封片,在熒光顯微鏡下閱片,隨機計數50個強信號且無重疊的雜交細胞。結果判讀:鏡下閱片若大于 90% 的核型顯示非整倍體信號則判斷為異常。若10%～60%的核型顯示非整倍體信號則判斷為嵌合體。如果無法判斷則擴大計數100個細胞。

(4)羊水染色體核型分析。使用羊膜腔穿刺術抽取羊水20 mL,離心后接種于常規培養基,收獲細胞,制片,G顯染。鏡下計數25個分裂相,至少分析5個分裂相,如異常則增加分裂相分析數目。根據國際人類染色體命名的國際體制(ISCN2016)標準確定染色體核型[9]。

(5)統計學方法。使用SPSS23.0統計軟件分析,計數資料用例數(n)或百分比(%)表示,組間比較使用Fisher確切概率法,以P≤0.05為差異有統計學意義。

結果

1.完全型RAAs與嵌合型RAAs妊娠結局比較分析:193例RAAs胎兒中,190例結局為流產,其中一般流產2例,稽留流產188例;3例未發生流產,其中2例引產,1例成功分娩。統計不同RAAs分娩情況,分析孕婦妊娠結局,結果顯示,RAAs一般流產發生率低于稽留流產,分別為1.0%和97.4%。其中完全型RAAs與嵌合型RAAs一般流產發生率分別為0.6%和3.3%,稽留流產發生率分別為99.4%和86.7%。兩組一般流產發生率無顯著性差異(P>0.05),稽留流產發生率差異有統計學意義,完全型RAAs稽留流產發生率高于嵌合型RAAs。僅有3例嵌合型RAAs未發生流產,染色體嵌合比例分別為2號三體嵌合44%、16號三體嵌合38%和20號三體嵌合25%。見表1。

表1 RAAs胚胎/胎兒流產情況 [例(%)]

2.RAAs分布情況:共收集193例RAAs胎兒,其中完全型RAAs占比84.5%(163/193),嵌合型RAAs占比15.5%(30/193),均為三體或三體嵌合體,未發現單體。本次收集的病例中,RAAs涉及16條染色體,包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、20、22號染色體。其中,最常見的是16號染色體,異常檢出率為43.0%(83/193);其次是22號和15號染色體,異常檢出率為24.4%(47/193)和9.3%(18/193)。雙重三體檢出率為3.6%(8/193),分別是5號合并21號(1/8)、18號合并20號(1/8)、16號合并22號(2/8)、16號合并21號(1/8)、9號合并22號(1/8)、16號合并X(1/8)和20號合并Y(1/8)。未發現1、17、19號RAAs,詳見圖1。

圖1 不同RAAs異常發生頻次

3.RAAs胚胎/胎兒的流產孕周分析:通過統計不同RAAs流產時的孕周情況,分析胚胎/胎兒發育的孕周跨度。結果顯示,所涉及16條RAAs均可在孕早期發生流產,16號染色體發生流產的孕周最早,為第6周;其次是3號與15號染色體,最早流產孕周為7周,其余多數染色體(13/16)發生流產的最早孕周為8～9周,在完全型RAAs中,4、14、15和16號染色體可發育到中孕期的13～14周,9號和22號染色體可發育到更晚,最大為18周。在嵌合型RAAs中,多數RAAs(7/10)胎兒不能發育到孕中期,在孕早期即流產,可發育到的最大孕周為10周,部分(3/10)嵌合型RAAs可發育到較大孕周,16號和20號染色體可發育到19周,2號染色體發育到37周+。詳見表2。

表2 完全型RAAs與嵌合型RAAs胚胎/胎兒發育孕周分布情況

討論

染色體異常是遺傳病常見的病因之一,其中數目異常發生率最高,約占染色體異常的90%[10-11],多數數目異常可能會導致胎死宮內、胎兒生長受限、流產、影響胎兒發育、智力、行為和生長發育落后等疾病。研究顯示,流產中染色體異常占50～70%[12-14],其中RAAs可占60%以上[14]。流產在自然妊娠中的發生率約為10%～15%[16]。在本研究中,RAAs胚胎/胎兒一般流產和稽留流產發生率分別為1.0%和97.4%。完全型RAAs與嵌合型RAAs一般流產發生率無顯著性差異,兩者稽留流產發生率有顯著性差異,完全型RAAs稽留流產發生率高于嵌合型RAAs。稽留流產又稱胚胎停育,指胚胎或胎兒死亡后滯留宮腔內未及時自然排出[17],可能會引起彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC),多次發生可發展為復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA),嚴重影響孕婦的身心健康[18]。因此,對胎兒為RAAs的婦女,應考慮稽留流產的可能,尤其對胎兒為完全型RAAs的婦女,應給予高度關注。此外,本研究未發現RAAs胚胎或胎兒存在復發性流產和流產合并感染結局。Carlo等[19-20]報道復發性流產婦女比正常懷孕婦女更容易發生染色體異常,且兩者差異有統計學意義;鐘漢威等[21]報道流產合并感染主要與生殖道感染、不潔性生活和人工流產密切相關,推測本研究病例中未發現復發性流產結局的原因可能是樣本量少,而流產合并感染的可能原因是其發病機制與染色體異常關系不大,這兩組特殊類型流產與RAAs之間的關系還需要更大樣本量的研究來證明。

所有型別的染色體核型異常都可能引起流產[18,22-23]。本文統計的RAAs涉及的染色體包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、20、22號染色體等16條,未見1、17、19號染色體非整倍體,這種差異可能是由于樣本量較少所致。其中發生頻次較高的依次為16號(43.0%)、22號(24.4%)和15號(9.3%)染色體異常,與先前研究報道基本一致[15, 18]。這種差異可能與染色體中的基因數量有關[24],高發的RAAs如16、22、15號染色體上含有800～1 600個基因,要少于其他RAAs(約含有1 600～5 000個基因),可能存在一個閾值效應決定敏感基因的功能及表達。

不同RAAs對胎兒發育的影響可能不同,有國內外研究學者表明1～22號常染色體非整倍體均會導致孕婦在孕早期發生流產[14, 25]。本文對涉及的16條常染色體非整倍體胚胎/胎兒發育的孕周做了分析,各RAAs普遍在8～12周內發生流產,與以往研究一致。多數RAAs能發育到的最大孕周不超過早孕期,少數僅可發育到中孕期。部分嵌合體可發育到較大孕周。其中,有1例16號三體嵌合38%和1例20號三體嵌合25%的胎兒發育到19周時,兩位孕婦要求終止妊娠。另有1例羊水中2號三體嵌合44%的胎兒,排除了單親二體(UPD)且無超聲異常,孕婦經產前門診咨詢后,繼續妊娠至足月分娩,隨訪新生兒3年余,未見發育異常。三體自救是一種可能的解釋,比如內細胞團的一些三體細胞隨機丟失一條染色體變成二體細胞,機體對二體細胞進行有效選擇,三體細胞存在于胎盤中,導致胎盤,羊水和胎兒之間存在細胞遺傳學差異[26]。因此,本研究推測胎兒細胞核型有可能為正常二倍體,而羊水細胞為2號三體嵌合體,胎盤為2號三體或三體嵌合體。此外,有研究表明低比例嵌合與良性的胎兒發育有關,Chen等[27]和Tang等[28]分別報道1例羊水中2號三體嵌合3%和4%的病例,臍血核型和孕期超聲均正常,生后隨訪發育正常,但是目前尚未有指南或共識指出嵌合比例低于多少,胎兒妊娠結局良好。這一結果提示,對于產前診斷為嵌合型RAAs的孕婦,需進行詳細的產前咨詢,密切監測孕婦超聲和孕期情況,必要時對夫妻雙方行染色體檢測。妊娠終止后建議對胚胎/胎兒/新生兒及胎盤行細胞遺傳學檢測,進一步明確RAAs嵌合部位與比例,對新生兒提供正確的臨床指導或干預,并為流產/引產患者健康孕育下一胎提供理論依據。

綜上,本文從罕見常染色體非整倍體的角度分析了其對胚胎/胎兒發育的影響, 絕大多數RAAs與稽留流產相關,且多數流產發生于早孕期,少數胎兒能發育到中孕期。嵌合型RAAs可發育到的孕周與胚胎的嵌合部位和比例有關,嵌合比例較低或胚胎染色體在早期發生自救,胎兒可以正常發育至足月出生。本文提示臨床實踐中應重視RAAs,RAAs是流產的重要原因,有必要提高臨床醫生及廣大孕婦群體對此的認知。