高雄激素誘導小鼠顆粒細胞氧化應激與炎癥的研究

翟怡 龐艷莉

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是育齡期婦女最常見的生殖內分泌疾病,患病率高達7.8%[1],常伴胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病、肥胖、子宮內膜癌等并發癥,嚴重影響患者生活質量。PCOS的診斷標準不一,但高雄激素血癥一直被視為PCOS的重要特征,在PCOS的發病機制研究中,也存在將PCOS視為卵巢源性高雄激素血癥的觀點[2],表明其在PCOS發生發展中的關鍵地位。然而,雄激素和相關信號在PCOS及其相關并發癥中的實際作用尚未明確。

卵巢雄激素在膜細胞中生成,雄激素過量會對顆粒細胞和卵母細胞產生不良影響,阻礙卵泡發育,導致排卵和卵母細胞成熟障礙、月經紊亂[3-4]。全身性的高雄激素血癥會引起多毛和痤瘡,加重其糖脂代謝和激素代謝紊亂,同時也被這些代謝異常進一步惡化[5]。因此,研究高雄激素環境下顆粒細胞的生物學功能改變對揭示PCOS發病分子機制,厘清高雄激素和PCOS其他并發癥之間的因果關系,提供治療靶點意義重大。

顆粒細胞在排卵和卵成熟過程中扮演重要角色,既往研究對顆粒細胞功能障礙的機制篩選多局限在PCOS女性與對照受試者顆粒細胞轉錄組之間的對比[6-8],缺乏關于雄激素對顆粒細胞轉錄組影響的研究,不利于探討卵巢局部雄激素過量這一因素本身如何影響卵巢功能。本研究通過對比體外高雄激素與非高雄激素環境下小鼠顆粒細胞的轉錄組信息,旨在對高雄損害卵巢顆粒細胞功能的分子機制進行全面篩查和討論。

對象與方法

一、對象

實驗動物為SPF級3 周齡C57/BL6 J健康雌鼠,購于北京大學醫學部實驗動物科學中心,實驗方案獲得北京大學倫理委員會審核批準。

二、方法

1. 小鼠顆粒細胞獲取及培養:取材前48 h對小鼠行5～10 IU PMSG腹腔注射以促進卵泡發育。取材時斷頸處死小鼠,取雙卵巢經PBS清洗后轉移到37℃的M2培養基中,體式鏡下刺破卵泡,排出顆粒細胞。口吸管收集顆粒細胞后25℃ 2 000 rpm離心5 min. 棄上清,用PBS重懸洗1～2 次后加入含10% FBS和1% P/S的DMEM/F12培養基,將細胞接種至12孔板中,8～12 h貼壁后換液,DHEA組加10 μM DHEA處理6 h,對照組加入等量DMSO。

2. 總RNA提取:棄去原培養基,PBS清洗1～2 次后Trizol法提取RNA。

3. 文庫構建與測序:RNA質檢合格后取1 μg構建文庫。使用Oligo(dT)珠子分離poly(A) mRNA,在二價陽離子和高溫條件下進行mRNA片段化。采用隨機引物合成了第一鏈和第二鏈cDNA。純化雙鏈cDNA后修復兩端,連接一個dA尾,用T-A連接以在兩端添加接頭序列。然后使用DNA清潔珠子對接頭序列連接的DNA進行大小選擇。采用P5和P7引物進行PCR擴增,并對PCR產物進行驗證。然后,將具有不同索引的文庫多路復用,在Illumina HiSeq/ Illumina NovaSeq/ MGI2000儀器上,根據制造商的說明,使用2x150雙端(PE)配置進行測序。

4. 數據分析:主成分分析用R(Version 3.0.3) ggplot2包分析繪制。差異表達分析用DESeq2 Bioconductor包,多重假設檢驗校正后的Padj<0.05被視為有顯著差異。GOSeq(v1.34.1)用于識別基因本體(gene ontology, GO)術語,注釋顯著富集的基因。京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes, KEGG)是一個涉及基因組、生物途徑、疾病、藥物和化學物質的數據庫集合(http://en.wikipedia.org/wiki/KEGG)。本研究使用其中的腳本在KEGG通路中富集顯著差異表達基因。GSEA分析借助GSEA數據庫完成(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp),參考hallmark基因集,對通路內有標識的基因使用加權法計算富集分數(enrichment score, ES),標準化后得到標準化的富集分數(normalized enrichment score, NES);通過計算錯誤發現率(false discovery rate, FDR) 控制假陽性率。富集結果滿足FDR<0.25,P<0.05且|NES|>1表示結果有統計學意義。

結 果

一、主成分分析和基因差異表達分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)可以降低數據的復雜性,深入挖掘樣品之間關系和變異大小,展示樣本間的聚類關系。在兩組小鼠顆粒細胞的主成分分析中,可以看到在組內差異不大的情況下,兩組樣品明顯地聚為兩類(N=3),表明數據重復性良好。見圖1。

圖1 3D主成分分析Figure 1 3D principal component analysis

對兩組樣品基因表達情況按差異顯著性標準(Fold Change≥2且q value(FDR, Padj)≤0.05)進行篩選,可發現DHEA處理組的顆粒細胞相較于對照組有355 個基因顯著下調(圖2中用藍色標記的點),577 個基因顯著上調(圖2中用紅色標記的點),組間差異明顯(圖2),說明DHEA處理對小鼠顆粒細胞基因表達產生了廣泛影響。

圖2 差異基因火山圖Figure 2 Volcano map of differential genes

二、GO和KEGG富集分析

為探究這些表達差異基因的生物學功能,本研究對表達差異具有顯著性的基因進行了GO和KEGG富集分析。GO將基因功能分為分子功能(molecular function, MF)、細胞組分(cellular component, CC)、參與的生物過程(biological process, BP)三類,從這三個角度說明兩組樣本間有顯著差異的基因影響了細胞中什么位置的哪些細胞功能。MF富集最顯著的GO條目依次是:蛋白質結合、蛋白質同二聚體活性、蛋白質激酶結合、微管結合、激素活性、谷硫酮轉移酶活性、配體激活的序列特異性DNA結合RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、谷胱甘肽結合。CC富集最顯著的GO條目依次是:膜的整體成分、細胞質、細胞外間隙、細胞外區域、神經元細胞體、細胞表面、細胞骨骼、頂端質膜、蛋白樣細胞外基質、質膜外側、結合珠蛋白-血紅蛋白復合物。BP富集最顯著的GO條目依次是:細胞分裂、細胞凋亡過程的正向調節、有絲分裂、蛋白激酶B信號通路的正向調節、對機械刺激的反應、氨基酸跨膜轉運、細胞內受體信號通路、谷胱甘肽代謝過程、異種分解代謝過程、睪酮生物合成過程、細胞外基質成分分泌的正向調節。見圖3。

圖3 富集程度前30的GO條目Figure 3 The top 30 enriched GO items

對DHEA組和對照組表達差異具有顯著性的基因進行KEGG通路分析,可以了解兩組樣本間表達差異顯著的基因分布在哪些通路相關的基因集中。如圖4所示,KEGG分析結果富集到過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR)信號通路、腎素分泌、細胞色素P450藥物代謝、谷胱甘肽代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、單環β-內酰胺類抗生素生物合成、在癌癥中的通路、胰島素抵抗、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信號通路等。

圖4 富集最顯著的KEGG通路Figure 4 The most significantly enriched KEGG pathways

三、GSEA分析

GO與KEGG一方面僅僅富集FoldChange與p value同時變化顯著的基因,可能漏掉變化倍數不大但功能重要的基因;另一方面只能指出哪些通路變化顯著,不能回答通路具體是被激活還是被抑制的問題。而基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)不預先在表達差異顯著的基礎上對基因進行過濾,作為GO和KEGG的補充能更全面地對比兩組樣本間通路的抑制激活情況。

與對照組相比,DHEA組中激活最顯著的14 個基因集如表1所示,其中E2F轉錄因子靶點通路,G2M檢查點,MYC靶基因V2,MYC靶基因V1,MTORC1信號,未折疊蛋白響應富集最顯著(FDR q value<0.25)。其次是有絲分裂紡錘體,活性氧途徑,膽固醇平衡,血紅素代謝,雄激素響應,晚期雌激素反應,早期雌激素反應和氧化磷酸化(NOM p value<0.25),說明DHEA激活了小鼠顆粒細胞中的這些生物學活動。而在對照組中顯著富集的基因集只有上皮間質轉化(表2),即DHEA抑制了小鼠顆粒細胞的上皮間質轉化。

表1 DHEA組中顯著富集的基因集Table 1 Gene sets significantly enriched in phenotype DHEA

表2 Control組中富集到的GSEA基因集Table 2 Gene sets enriched in phenotype Control

討 論

一、顆粒細胞凋亡導致卵巢功能障礙

在PCOS模型中,隨著卵泡發育至竇卵泡階段,顆粒細胞凋亡率逐漸增加,大量卵泡發育停滯不前,形成卵巢多囊樣改變。顆粒細胞通過縫隙連接與卵母細胞緊密聯系[9],其凋亡還會影響卵母細胞成熟[10]。卵巢雄激素過量對顆粒細胞凋亡的誘導作用逐漸受到認可[11]。在本研究中,KEGG顯著富集到的癌癥中的通路,以及GSEA分析中被顯著激活的E2F靶點通路,G2M檢查點,MYC靶基因V2,MYC靶基因V1也都指向了DHEA影響顆粒細胞的機制與凋亡有關。E2F主要以細胞周期依賴性的方式調節與細胞增殖、凋亡和分化相關的幾個基因的表達[12-13]。由原癌基因c-MYC編碼的MYC是細胞轉錄的重要調節因子,高 MYC水平可引發細胞凋亡[14],而卵巢組織中c-MYC的表達降低有利于改善小鼠的PCOS表型[15]。當前對PCOS顆粒細胞凋亡引發機制的研究多集中在自噬方面[16],而本研究的測序結果則主要強調了氧化應激與炎癥在其中的作用。

二、氧化應激與炎癥引發顆粒細胞凋亡

PCOS患者卵巢局部存在慢性低度炎癥狀態,影響正常卵巢功能[17]。同時PCOS患者表現出明顯的氧化應激,有研究表明高雄誘導的氧自由基產生可能是這其中的原因[18]。氧化應激與炎癥反應在PCOS的發病過程中同為病因,互為因果。在本研究中,GO和KEGG富集結果顯示PPAR信號通路、谷胱甘肽代謝、精氨酸生物合成、單環β-內酰胺類抗生素生物合成、cAMP信號通路在DHEA處理后發生了顯著變化。GSEA提示DHEA激活了小鼠顆粒細胞中的mTORC1信號,未折疊蛋白響應、活性氧途徑、氧化磷酸化;抑制了上皮間質轉化。上述生物學過程和信號通路均與氧化應激和炎癥相關,強調了氧化應激和炎癥在高雄激素引起顆粒細胞功能損傷中的重要作用。

PPAR作為核激素受體,其中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)不僅與PCOS患者中降低的IL-7,升高的IL-1β,IL-6和TNFα水平有直接關聯[19],被激活后還可改善高雄激素型PCOS患者的代謝和生殖表型[20]。谷胱甘肽作為體內重要的抗氧化劑,能保護人體免受自由基和促氧化劑的傷害,參與調節蛋白質折疊和細胞凋亡[21]。過量的雄激素可能通過影響谷胱甘肽來促進顆粒細胞凋亡,誘發卵泡過早閉鎖[22],這與本研究中GO和KEGG的提示相吻合。精氨酸在甲基化過程中發揮重要作用,參與精氨酸合成過程的9 種精氨酸甲基轉移酶可通過廣泛途徑參與氧化應激和炎癥[23]。目前的研究表明,PCOS患者的精氨酸代謝可能受到影響,但可能由于樣本大小或患者特征的不同,對PCOS患者精氨酸代謝變化及作用的研究結論多有齟齬,需要更多的大樣本研究驗證[24-26]。cAMP是最通用的細胞第二信使之一,調節促炎細胞因子和粒細胞招募,控制粒細胞凋亡和吞噬作用[27]。上述通路在本研究中雖被GO或KEGG富集,卻未在GSEA分析中表現出明顯的激活或抑制趨勢,因此只能說明它們在PCOS中確實發生了變化,但具體變化趨勢還不能明確。

mTORC1 與mTORC2同屬絲氨酸/硫氨酸激酶,有研究報道mTORC1在PCOS中被顯著激活[28],這與本研究中的發現一致,說明PCOS中mTORC1的激活可能是由雄激素過剩導致的。另有研究發現mTOR通路被二甲雙胍抑制后能清除產生TNFα的B細胞[29],這同時強調了PCOS患者過量的雄激素對炎癥的促進關系[17]。此外,mTORC1激活還會造成線粒體損傷,降低葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4, GLUT4)表達,下調葡萄糖攝取,導致骨骼肌胰島素抵抗[30]。最后,顆粒細胞需要進行上皮間質轉化才能完成正常排卵過程[31],GSEA提示DHEA抑制了小鼠顆粒細胞中的上皮間質轉化,這或許是高雄激素抑制排卵的另一原因。

三、創新性與研究局限

高雄激素對PCOS卵巢局部的作用及其與PCOS其他并發癥之間的關系尚未闡明,既往研究中僅有兩例關注了雄激素過量單獨對顆粒細胞的影響[32-33],但其高通量測序內容主要局限于基于差異基因進行的富集分析,沒有進行更高級的數據分析;同時只就研究者的關注重點進行了驗證,數據解讀不夠全面。而本研究借助GSEA這個更高級且不預先設置表達差異顯著性門檻的方法,說明了各個通路的抑制或激活情況,客觀分析其整體變化情況后著重強調了氧化應激與炎癥在雄激素影響顆粒細胞功能中的權重。盡管本研究反映的是顆粒細胞在體外對雄激素DHEA的短期應答,與人體中長期高雄激素環境下顆粒細胞的基因表達變化是否一致還有待證實,有一定的研究局限性,但也部分解讀了高雄激素在轉錄組水平對小鼠顆粒細胞產生的影響,指出了氧化應激與炎癥在高雄激素引發的PCOS顆粒細胞功能障礙中的重要作用,可作為后續分子機制研究的重要參考。