基于公共數據庫挖掘UBE2A 在肝細胞癌中的表達與調控及其臨床意義#

成樹貞 陳恒 任偉宏

（1.河南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學第一臨床醫學院醫學檢驗技術教研中心，河南 鄭州 450000）

原發性肝癌（Primary liver carcinoma，PLC）是國內最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲性強，患者生存率低[1]。多數肝癌患者就診時已為中晚期，導致其預后不佳。在所有原發性肝癌病例中，其中70-90%是肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。目前化療和免疫療法是治療肝細胞癌的最佳選擇[2]。泛素結合酶2A（Ubiquitin binding enzyme 2A，UBE2A）是一組E2 酶的成員，這些酶通過催化不同靶蛋白的泛素化參與DNA 的損傷修復[3]。

既往研究表明，UBE2A 被認為是指導不同DNA損傷修復途徑的節點，并且UBE2A 在某些癌細胞系和腫瘤中過度表達[4]。與正常卵巢組織相比，UBE2A在卵巢癌（Ovarian cancer，OC）中表達上調，并且UBE2A 的高表達與OC 患者的不良預后密切相關[5]。但目前UBE2A 在HCC 中的作用和功能仍然未知。

因此，本研究擬通過挖掘公共數據庫現有的肝細胞癌的數據信息，分析UBE2A 在肝細胞癌中的差異性表達和相關調控因子，以及其與臨床預后和免疫細胞浸潤的關系，UBE2A 將可能成為診療肝細胞癌患者新的分子靶點，為HCC 的早期診斷、預后和治療方面提供依據和思路。

1 材料與方法

1.1 UBE2A 在不同腫瘤中的表達

使用Timer2.0 數據庫（http://timer.cistrome.org/）研究UBE2A 在所有TCGA 腫瘤中的表達情況，分析UBE2A 在各種腫瘤和相鄰正常組織間的表達差異。

1.2 UBE2A 在肝細胞癌中的表達及預后

GEPIA 在線數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）包含了9736 個腫瘤和8587 個正常TCGA 和GTEX樣本的RNA 測序表達數據。我們使用GEPIA 工具進一步分析驗證UBE2A 在肝細胞癌組織和正常組織中的表達差異情況，并分析患者的生存預后。

1.3 調控因子的篩選及與UBE2A 調控關系預測

GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，合并使用關鍵詞：Hepatocellular carcinoma 和microRNA 檢索數據。選出符合要求的表達譜數據（GSE108724），其中包括7 例人肝細胞癌組織和7例癌旁組織。利用GEO2R 在線工具分析獲得DEmiRNAs 和火山圖。我們使用mirDIP 分析了差異表達microRNA 和UBE2A 之間的調控網絡并使用Cytoscape 工具進行網絡可視化。

1.4 UBE2A 與肝細胞癌患者臨床病理參數相關性的分析

利用UALCAN 數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）中的TCGA 數據，分析UBE2A 基因在不同性別、年齡、轉移、分期及病理亞型中的表達。

1.5 UBE2A 表達與免疫細胞浸潤的關系

使用Timer（http://cistrome.shinyapps.io/timer/）工具分析肝細胞癌中UBE2A 的表達與B 細胞、CD8+T細胞、CD4+T 細胞和樹突狀細胞浸潤的關系。

1.6 統計學處理

使用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 7.0 軟件進行數據統計學分析與作圖。腫瘤組織與正常組織中UBE2A 的表達差異使用非配對t 檢驗，組間比較采用t 檢驗（方差齊）或Wilcoxon 秩和檢驗（方差不齊）；Kaplan-Meier 曲線評估UBE2A 基因改變與肝細胞癌患者生存情況之間的相關性。UBE2A 表達與肝細胞癌患者臨床病理參數的相關性采用χ2檢驗，UBE2A 表達與免疫浸潤細胞的相關性采用Spearman秩相關檢驗。P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同腫瘤組織中UBE2A 基因表達水平

在Timer2.0 數據庫中分析顯示，UBE2A 基因表達水平在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、宮頸癌、膽管癌、結腸腺癌、食管癌、多形性膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃腺癌等腫瘤中，與對應正常組織相比明顯高表達（P＜0.05，圖1）。特別是在肝細胞癌中，UBE2A 在癌組織中的表達也顯著高于正常組織（P＜0.001，圖1）。

圖1 Timer2.0 數據庫中UBE2A 基因表達水平

2.2 UBE2A 在肝細胞癌及正常組織中的mRNA 表達水平

GEPIA 數據庫分析肝細胞癌與正常組織UBE2A mRNA 的表達差異，結果如圖2A 所示，UBE2A 在肝細胞癌中顯著高表達（P＜0.05）。進一步分析UBE2A 高低表達水平與患者預后的關系，繪制總體生存曲線，結果顯示UBE2A 高表達患者預后較差（P=0.045），見圖2B。

圖2 UBE2A 基因在肝細胞癌及正常組織間的表達差異及總生存曲線

2.3 差異表達microRNA 篩選及與UBE2A 調控關系預測

本研究進一步收集并分析了肝細胞癌microRNA表達譜數據（GSE108724）。GSE108966 包含3 個上調和4 個下調差異表達 microRNA（圖3A）。以P ＜0.05 且|logFC|＞1 為篩選條件得到6 個顯著差異表達microRNA，包括hsa-miR-375、hsa-miR-4270、hsamiR-93-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-3188、hsa-miR-3651。mirDIP 分析 6 個差異 microRNA 與UBE2A調控關系顯示，3 個microRNA（hsa-miR-375、hsamiR-93-5p、hsa-miR-106b-5p）與UBE2A 有潛在調控 關系，見圖3B。

圖3 肝細胞癌樣本差異表達 microRNA 火山圖及靶基因調控圖

2.4 UBE2A 與肝細胞癌患者臨床病理參數的相關分析

UALCAN 數據庫結果表明，UBE2A 基因在肝細胞癌組織中較正常組織明顯高表達（P＜0.001，圖4A），其表達與性別、年齡、淋巴轉移無關（P＞0.05圖4B，4C，4D）。

圖4 肝細胞癌中UBE2A 表達與臨床病理參數的相關性

腫瘤一期患者UBE2A 基因的表達水平與二期和三分期相比，三期與四期相比具有顯著性差異（P ＜0.05，圖4E）。UBE2A 在肝細胞癌和纖維板層癌中有更高的表達（P ＜ 0.05，圖4F）。

2.5 UBE2A 與腫瘤免疫細胞浸潤的關系

Timer 軟件分析顯示，UBE2A 與B 細胞（P ＜0.001，r=0.32）、CD8+T 細胞（P ＜ 0.001，r=0.214）、CD4+T 細胞（P ＜ 0.001，r=0.354）、巨噬細胞（P ＜ 0.001，r=0.383）、中性粒細胞（P ＜0.001，r=0.406）和樹突狀細胞（P ＜ 0.001，r=0.378）的浸潤水平呈正相關，見圖5。

圖5 肝細胞癌中UBE2A 與免疫細胞浸潤的相關性

3 討論

人類泛素結合酶E2A 編碼E2 泛素結合酶家族的一個成員[6]。泛素蛋白充當信號信使，控制細胞周期進程，包括后DNA 轉錄修飾、凋亡和細胞增殖[7]。泛素介導的蛋白酶體降解途徑是癌癥治療的新藥物靶點之一[8]。蛋白UBE2A 在泛素介導的蛋白酶體降解途徑中起重要作用[9]。然而，其在腫瘤中的作用機制越來越受到重視，UBE2A 可作為原癌基因，并且被視為癌癥的治療新靶點。目前，UBE2A 在肝細胞癌中的研究尚未見報道。

有研究報道，UBE2A 在幾種類型的癌癥中出現高表達，且UBE2A 陽性者惡性腫瘤發生率明顯高于UBE2A 陰性者[10]。例如UBE2A 在淋巴瘤[11]、鼻咽癌[12]、白血病[13]等疾病中異常表達。我們的研究結果也顯示，肝細胞癌組織中UBE2A 基因過表達。本研究中，通過Timer2.0 數據庫分析顯示UBE2A 在包括膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、宮頸癌、膽管癌、結腸腺癌、食管癌、多形性膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝細胞癌等腫瘤中，與其對應的正常組織相比表達均上調。為進一步分析UBE2A 在肝細胞癌中的表達情況，采用GEPIA 數據庫分析UBE2A 在肝細胞癌中的轉錄水平，結果顯示UBE2AmRNA 在肝細胞癌中過表達，并且其高表達患者預后較差。本研究發現hsa-miR-375 在肝細胞癌組織中表達上調，hsa-miR-93-5p 和hsa-miR-106b-5p 在肝細胞癌組織中表達下調，使用mirDIP 工具預測出上述三個microRNA 參與UBE2A的調控，然而目前其在肝細胞癌中的功能和作用尚未見相關研究報道。

UALCAN 數據庫分析表明，UBE2A 在肝細胞癌中的表達水平與患者性別、年齡、淋巴轉移無關，但與患者腫瘤分期有關，腫瘤一期患者UBE2A 基因的表達與二期和三期相比，三期與四期患者相比，具有顯著性差異。因此本研究還需要進一步進行臨床實驗，以證實UBE2A 的表達水平與肝細胞癌臨床病理特征的相關性。利用Timer 數據庫分析顯示UBE2A與B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關。UBE2A 高表達患者腫瘤免疫細胞增多可能影響其惡性生物學行為。腫瘤浸潤免疫細胞受宿主免疫狀態的影響，并能被藥物有效靶向，這與免疫治療的臨床療效相一致。以上結果均提示UBE2A 可作為判斷肝細胞癌預后和治療的重要指標。

4 結論

UBE2A 有望成為肝細胞癌診斷的新型標志物和治療的潛在分子靶點。