基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路探討健骨顆粒對UMR-106細胞內質網應激凋亡的影響

陳賽楠，周 芬，黃云梅，林燕萍*

1 福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；

2 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；

3 福建省中醫藥科學院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003；

4 福建中醫藥大學雜志社，福建 福州 350122

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是雌激素水平急劇降低引發骨量下降和骨微結構破壞，致使骨強度減弱和脆性骨折發病率增加的全身性代謝性疾病，屬于高轉換型原發性骨質疏松癥［1］。破骨細胞介導骨吸收和成骨細胞介導骨形成是維持骨穩態的重要因素，雌激素在其中發揮至關重要的作用，PMOP 發生時骨吸收量和骨形成量均增強，但是骨吸收量大于骨形成量。雌激素還是一種抗氧化劑［2］，雌激素水平降低和衰老等因素會導致機體活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度堆積［3］，氧化還原平衡被打破，進一步誘發內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），近十年來許多研究顯示ERS 與PMOP 的發生和發展關系密切［4-5］。

內質網的蛋白質合成、折疊和修飾等功能的正常發揮是細胞存活的必要條件，氧化還原狀態的改變和鈣離子流動異常等引起內質網中未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白堆積，從而觸發未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），輕度的UPR 可維持細胞穩態，然而持續、過強的UPR 引起細胞凋亡；因成骨細胞分泌大量的細胞外基質蛋白，特別容易受到ERS 引起的功能障礙影響，阻礙其增殖分化甚至凋亡，從而導致PMOP 的發生和發展。PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路是ERS 的最主要的信號通路之一，同樣在骨代謝調控中起關鍵作用［6］，為調控ERS相關疾病如PMOP提供新思路。

健骨顆粒是治療PMOP 的經驗方，臨床效果顯著，課題組前期研究顯示健骨顆?？捎行宄龣C體內多余ROS，并且對腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導的成骨細胞凋亡具有保護作用［7］，然而是否通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路減輕ROS/ERS 引起的成骨細胞凋亡尚未涉及。本研究采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導UMR-106細胞形成ROS/ERS模型，觀察健骨顆粒含藥血清對ROS、細胞凋亡率和PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路的影響，探討健骨顆粒保護ROS/ERS 的UMR-106 細胞模型的潛在機制，為PMOP 的臨床治療提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性SD 大鼠40 只，購自浙江省醫學科學院［生產許可證號：SCXK（閩）1908140006］。實驗動物飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室［使用許可證：SYXK（閩）2019-0007］，實驗前適應性喂養1 周，本研究已通過福建中醫藥大學動物倫理委員審核會批準通過［批準號：福中醫倫理審字［2018］第（038）號］。

1.2 實驗細胞

UMR-106 成骨樣細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（目錄號：TCR11）。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1實驗藥物 健骨顆粒由淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥、煅狗骨等組成，購自福建省同春藥業股份有限公司（每克顆粒劑含原生藥2.9 g），由福建省中醫藥科學院內試車間依照課題組制劑工藝標準煎煮濃縮，制備成健骨顆粒浸膏，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2主要實驗試劑 DMEM 培養基、PBS、0.25%胰蛋白酶均購自于美國Sigma公司；FBS購自于美國Gibco 公司；GSK2606414 購自于美國APExBIO 公司；活性氧分析試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒均購自于江蘇凱基生物技術股份有限公司；HiScript Q RT SuperMix for qPCR、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 均購自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PERK 一抗購自于美國Cst 公司；eIF2α、ATF4、CHOP、β-actin 一抗均購自于Pronteintech公司；Capase-12一抗購自于北京博奧森生物技術有限公司；Fluo-3 AM 購自于株式會社日本同仁化學研究所。

1.3.3主要實驗儀器 CO2恒溫培養箱購自于香港力康公司；低速離心機購自于德國Eppendorf 公司；ELx800全自動酶標儀購自于美國Thermo Fisher Scientific 公司；倒置相差顯微鏡購自于日本TKO 光學儀器株式會社；激光共聚焦掃描顯微鏡購自于卡爾蔡司光學有限公司；流式細胞儀購自于美國BD 公司；7500 Fast 實時熒光定量PCR 儀購自于美國Life technologies 公司；化學發光成像系統購自于美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1生理鹽水血清和健骨顆粒含藥血清制備 將40 只SD 大鼠采用隨機數字表法分為生理鹽水血清組和健骨顆粒含藥血清組，每組20只。生理鹽水組采用生理鹽水灌胃，健骨顆粒灌胃劑量根據人和大鼠的體表面積進行換算，按照7.8 g/（kg·d）生藥量連續灌胃7 d，最后一次灌胃后2 h后腹主動脈取血，靜置4 h 后3 000 r/min 離心15 min 取血清，56 ℃水浴30 min 滅活補體，0.22 μmol/L 過濾器過濾后分裝，存儲于-80 ℃超低溫冰箱。

1.4.2細胞培養和分組干預 選用UMR-106細胞，采用10% FBS、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基，培養于5% CO2、37 ℃恒溫的細胞培養箱中。將細胞隨機分為陰性對照組（NC組）、模型組（H2O2組）、健骨顆粒組（H2O2＋JG組）和陽性對照組（H2O2＋GSK2606414組）。NC組和H2O2組采用10%生理鹽水血清干預12 h，H2O2＋JG 組采用10%健骨顆粒含藥血清干預12 h，H2O2＋GSK2606414組采用0.03 μmol/L 的GSK2606414 和10%生理鹽水血清干預12 h，除NC 組外，其余各組在不更換新培養基的情況下，再分別加入10 μmol/L H2O2干預12 h制備ERS模型。

1.4.3CCK8法篩選GSK2606414最佳干預濃度 將UMR-106 細胞按1×104個/孔接種在96 孔板中并培養24 h，采用不同濃度（0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 μmol/L）的GSK2606414 處理細胞，每個濃度重復6 次，孵育12 h，每孔加入CCK8 10 μL，37 ℃孵育1 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度，選取對UMR-106細胞活力沒有影響的最大濃度作為GSK2606414 的最佳干預濃度進行后續實驗。

1.4.4激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內GRP78 和Caspase-12 熒光表達情況 將UMR-106 細胞按8×104個/mL 接種至共聚焦皿，分別培養24 h，棄液，PBS 洗滌3 min×3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌；3% H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min×3 次；SABC 室溫孵育10 min，PBS 洗滌；封閉液孵育1 h，棄液，分別加入GRP78（1∶1 000）和Caspase-12（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜；棄液，PBS 洗滌，避光加入1∶1 000 熒光二抗室溫孵育1 h；PBS 洗凈，加入500 μL DAPI 孵育10 min，PBS 洗凈后激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。

1.4.5DCFH-DA 法測定細胞內ROS 含量 將UMR-106 細胞按8×104個/mL 接種至共聚焦皿，分別培養24 h，棄液，用DMEM 洗滌3 次；按照1∶1 000加入DCFH-DA 熒光探針，37 ℃避光孵育20 min；激光共聚焦顯微鏡拍攝，ImageJ分析實驗結果。

1.4.6激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內鈣離子實時動態變化 將UMR-106 細胞按8×104個/mL 接種至共聚焦皿，培養24 h，棄液，Hank's 平衡鹽溶液（HBSS溶液）洗滌5 min×3次，加入30 μmol/L Fluo-3 AM 工作液1.25 μL，再加入0.05% Pluronic F-127 工作液1.25 μL，輕晃混勻，避光37 ℃孵育30 min；棄液，HBSS 溶液洗滌3 min，加入500 μL HBSS，再加入5 μL Hoechst33342 孵育10 min；棄液，HBSS 溶液洗滌5 min×3 次。根據組別分別滴加10%生理鹽水血清及10 μmol/L H2O2，激光共聚焦顯微鏡拍攝，設置拍攝視頻時長約40 min，ZEN軟件分析。

1.4.7Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡率 UMR-106細胞按2×105個/孔接種于6孔板，分組干預，棄液，PBS洗滌，每孔加入200 μL 不含EDTA 胰酶消化2 min，加入完全培養基終止消化，收集細胞懸液至15 mL 離心管，2 000 r/min 離心3 min；棄液，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心3 min；每管加入500 μL Binding Buffer，輕柔吹打混勻移入流式管，每管加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PrPidium Lodide 充分混勻，避光孵育15 min，流式細胞儀上機檢測，FLOWJO 軟件分析數據，實驗重復3次以上進行統計。

1.4.8qPCR檢測細胞ERS標志基因GRP78及PERK通路關鍵指標mRNA 轉錄水平 分別收集4 組細胞，加入TriZol 1 mL 充分混勻，靜置10 min；加入氯仿200 μL，震蕩30 s 混勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min；取400 μL上清至新EP管中，再加入400 μL異丙醇，充分混勻后冰上靜置15 min，放入離心機中4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min；棄液，加入75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 r/min 離心5 min，棄液，加入20 μL DEPC 溶解總RNA；nanodrop 2000 分光光度計檢測OD260/OD280值。HiScript QRT SuperMix 將RNA 逆轉錄成cDNA，AceQ-qPCR SYBR Green Master Mix 配置qPCR反應體系，條件如下：95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s共40 個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s 共1 個循環得到溶解曲線，GAPDH 作為內參，2-ΔΔct計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.9Western blot 檢測細胞ERS 標志蛋白GRP78及PERK 通路關鍵指標蛋白含量 分別收集4 組細胞，棄液，PBS 洗滌，加入100 μL RIPA 裂解液、1 μL PMSF 和1 μL 磷酸酶抑制劑，冰上裂解30 min，4 ℃12 000 r/min 離心18 min，取蛋白上清，按照1∶4 比例加入25 μL 5×Loading Buffer，充分混勻，95 ℃變性5 min，-80 ℃保存。采用6～10% SDS-PAGE 電泳，濕轉至0.22 μm PVDF 膜上，QuickBlock?快速封閉液室溫孵育5 min，分別采用GRP78（1∶1 000）、PERK（1∶1 000）、eIf2α（1∶1 000）、ATF4（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000），一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，1∶10 000 二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌，滴加顯影液曝光成像，以β-actin 作為內參，計算目標蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS 25.0 軟件統計分析。數據符合正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD-t法，方差不齊時用Games-Howell 法。數據不符合正態分布時采用非參數檢驗法。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GSK2606414抑制劑的最佳干預濃度

與0 μmol/L 的空白對照組相比，0.01、0.02 和0.03 μmol/L GSK2606414處理后細胞活力沒有顯著變化，0.04、0.05 μmol/L GSK2606414 可觀察到細胞活力顯著降低（P＜0.01）。見圖1。結果表明GSK2606414干預UMR-106細胞12 h后對細胞活力沒有影響的最大濃度為0.03 μmol/L，故使用該濃度作為后續H2O2＋GSK2606414組的實驗干預條件。

圖1 不同濃度GSK2606414對UMR-106細胞活力的比較Figure 1 Comparison different concentrations of GSK260 6414 on the viability of UMR-106 cells

2.2 NC 組和H2O2組GRP78 和Caspase-12 蛋白熒光表達比較

本實驗沿用課題組前期成熟的體外細胞氧化應激造模條件，采用10 μmol/L H2O2干預UMR-106細胞12 h 誘導氧化應激［8］。免疫熒光染色觀察ERS標志物蛋白GRP78 和ERS 細胞凋亡指標Caspase-12 的表達水平。結果顯示：與NC 組相比，H2O2處理后GRP78 和Caspase-12 的熒光強度顯著增加，表明H2O2誘導UMR-106 細胞ROS/ERS 模型的成功建立。見圖2。

圖2 UMR-106細胞GRP78和Caspase-12蛋白熒光強度比較（×400）Figure 2 Comparison of fluore scence intensity of GRP78 and Caspase-12 of UMR-106 cells (×400)

2.3 NC組和H2O2組鈣離子實時動態變化比較

Fluo 3-AM 檢測細胞內鈣離子實時動態變化，結果顯示：NC組細胞內鈣離子流隨時間推移無明顯變化，處于相對穩定狀態；H2O2處理后H2O2組熒光強度和鈣離子流速隨時間推移而增加，進一步表明H2O2誘導UMR-106 細胞ROS/ERS 模型的成功建立。見圖3。

圖3 細胞鈣離子實時動態變化比較（×400）Figure 3 Comparison of real-time dynamic changes in cellular calcium ions (×400)

2.4 NC組和H2O2組ROS含量比較

線粒體是細胞內ROS 的主要來源，DCFH-DA探針證實H2O2處理后UMR-106 細胞內ROS 含量顯著升高（P＜0.01）；健骨顆粒和GSK2606414 干預后細胞內ROS 含量顯著降低（P＜0.01）。見圖4。結果表明健骨顆粒可抑制ROS/ERS 模型細胞中ROS的生成。

圖4 ROS含量比較（×400）Figure 4 Comparison of ROS content (×400)

2.5 4組細胞晚期凋亡率比較

與NC 組比較，H2O2組細胞晚期凋亡率升高（P＜0.01），健骨顆粒和GSK2606414 干預后細胞晚期凋亡率均有所下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 4組細胞晚期凋亡率比較Figure 5 Comparison of advanced cell apoptosis rates in four groups

2.6 4 組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路關鍵基因mRNA轉錄水平比較

與NC 組相比，H2O2組GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA轉錄水平顯著增高（P＜0.01）；與H2O2相比，健骨顆粒和GSK2606414干預后GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA 轉錄水平均降低（P＜0.01）。見圖6。

圖6 4組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路關鍵基因mRNA轉錄水平比較Figure 6 Comparison of mRNA expression level of key genes in the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP pathway

2.7 4 組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路關鍵蛋白相對表達量比較

與NC 組相比，H2O2組GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP蛋白相對表達量顯著增高（P＜0.01）；與H2O2組相比，健骨顆粒和GSK2606414 干預后GRP78、PERK、eIf2α、ATF4 和CHOP 蛋白相對表達量均降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 4組PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路關鍵蛋白相對表達量比較Figure 7 Comparison of expression level of key proteins in the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP pathway in four groups

3 討 論

PMOP 發病率顯著高于老年性骨質疏松癥，嚴重影響中老年女性的生活質量?，F階段治療藥物分為四大類：抑制骨吸收藥物（雌激素類、選擇性雌激素受體調節劑、雙膦酸鹽類和降鈣素），促進骨形成藥物（甲狀旁腺激素等），雙重作用藥物（雷尼酸鍶等）和骨礦化促進劑（鈣劑、維生素D）。雖然雌激素水平急劇降低是PMOP 的主要病因，然而雌激素替代治療可引起子宮癌和乳腺癌的風險性增加［9］。雙膦酸鹽類抑制骨吸收量的同時新生骨量和質量相應減少，可能引起頜骨壞死等嚴重不良反應［10］。甲狀旁腺激素（特立帕肽）的最長持續使用時間是2 年。中醫藥因其獨特優勢受到醫患的廣泛關注［11-13］，進一步明確其作用機制勢在必行。

ROS 包括氧和含氧的高反應活性分子，例如H2O2、超氧陰離子（O2-）和羥基自由基（·OH）等，氧化應激可損傷成骨細胞的細胞成分，是骨質流失的致病因素之一［14］。本實驗采用H2O2制備細胞模型，其直接攻擊維持蛋白折疊酶活性所必需的游離巰基，內質網腔內蛋白質被氧化修飾，觸發ERS，ERS是重要的細胞自我防御機制，適當的ERS 有助于成骨分化，然而持續、過度的ERS 抑制成骨分化并誘導其凋亡，ERS 在PMOP 的發生和發展中起重要作用［15-16］。實驗結果顯示：10 μmol/L H2O2干預UMR-106 細胞12 h，在ROS 水平達到峰值的同時GRP78和Caspase-12 表達水平顯著增強，細胞內鈣離子內流速度隨時間推移顯著加快，并且細胞凋亡率顯著增加，以上結果均提示H2O2引起ERS 細胞凋亡的發生，即ROS/ERS模型構建成功。

內質網是細胞的鈣庫，Ca2+是重要的第二信使，參與細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程［17］。同時內質網的蛋白質合成、折疊、組裝和鈣離子貯存等功能是細胞命運決定的關鍵因素。GRP78 是伴侶蛋白，在蛋白質的折疊和組裝中發揮關鍵作用，負責UPR 迅速啟動，并作為內質網穩態的主要調節因子。PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信號通路是調控ERS的3 個主要通路之一［18］，同時也是調控成骨細胞分化和骨形成的主要信號通路之一［19］。

PERK 是內質網膜上的跨膜蛋白，PERK 基因敲除小鼠出現骨骼缺陷包括成骨細胞數量不足、成骨細胞分化礦化受損、Ⅰ型膠原分泌減少、骨質疏松和異常致密骨發育等［20-21］；在生理條件下PERK 處于無活性狀態，與內質網中含量最豐富的分子伴侶GRP78 結合形成穩定的復合物，UPR 時PERK 與GRP78 解離，游離GRP78 與內質網中蛋白結合，增強內質網的蛋白質折疊能力，緩解ERS；然而反應是有限的，當未折疊或錯誤折疊蛋白質過度堆積，機體為保護其他細胞的正常功能啟動凋亡路徑［4，22］。游離PERK 引起下游eIF2α 磷酸化導致蛋白翻譯水平整體下降或者停止，但誘導ATF4 的優先翻譯和合成，ATF4 也是成骨細胞的關鍵調控因子［23-25］，進而激活其下游轉錄因子C/EBP 同源蛋白CHOP 的轉錄，CHOP 是啟動應激凋亡通路的關鍵蛋白，最終導致細胞凋亡。本實驗中H2O2處理后PERK、eIf2α、ATF4 和CHOP mRNA 轉錄水平和蛋白相對表達量均顯著增加，表明該信號通路在UMR-106 細胞的ERS凋亡中起重要作用。

SU 等［26］發現葉酸可能通過抑制ERS 減少成骨細胞凋亡，MENG 等［27］發現褪黑素通過eIF2α/ATF4通路的激活誘導hFOB 1.19 細胞凋亡，而POSTN 可能通過抑制eIF2α/ATF4通路保護成骨細胞；LI等［28］發現OVX小鼠中增強eIF2α磷酸化可引起骨密度和骨體積分數的增加。GSK2606414 是PERK 的選擇性抑制劑，可通過抑制PERK 磷酸化和降低PERK含量，阻礙下游ATF4 和CHOP 的激活，廣泛用于驗證PERK 信號通路在各種疾病模型中的作用［29］。本實驗中GSK2606414 干預后ROS 含量和細胞凋亡率均顯著降低，PERK、eIf2α、ATF4 和CHOP mRNA 轉錄水平和蛋白相對表達量出現不同程度的下降；上述結果表明減輕ERS 可能在保護成骨細胞對抗PMOP中發揮關鍵作用。

健骨顆粒是治療PMOP 的驗方，主要由淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥和煅狗骨等組成，具有補腎健脾、強筋健骨之功效，臨床效果顯著。課題組前期系列研究發現：健骨顆?？赡芡ㄟ^調節與成骨細胞分化相關的6 個靶蛋白相對表達量，增強去卵巢大鼠成骨細胞分化能力以發揮治療作用［30］；通過p38MAPK 信號通路調控成骨細胞增殖［31］；健骨顆粒氯仿萃取部位調控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 通路促進成骨細胞分化［32-33］。本實驗結果顯示：健骨顆粒干預可顯著降低ROS 含量和細胞凋亡率，PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA 轉錄水平和蛋白相對表達量不同程度降低；提示健骨顆?？赏ㄟ^調控PERK/eIf2α/ATF4/CHOP 信號通路減輕過度的ERS，從而降低UMR-106 細胞凋亡率，發揮成骨細胞保護作用。

綜上所述，調控PERK/eIf2α/ATF4/CHOP 信號通路可能是健骨顆粒治療PMOP的潛在作用機制之一；但本實驗僅限于體外細胞實驗，存在一定的局限性，后續還需要進一步的動物實驗來驗證該作用機制。